בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

תקציר

המערכת החיסונית היא מרכיב חיוני של לב בריא. שריר הלב הוא ביתם של אוכלוסיה עשירה של תאים חיסוניים שונים תת-ערכות עם תפקודי מידור במהלך מצב יציב ובמהלך צורות שונות של דלקת. עד לאחרונה, המחקר של תאים חיסוניים בלב הצריכו השימוש במיקרוסקופ או פרוטוקולים עיכול לקוי מפותחת, אשר סיפקה מספיק רגישות בזמן דלקת חמורה אבל לא היו מסוגלים בביטחון לזהות קטן — אבל מפתח – אוכלוסיות של תאים במהלך מצב יציב. כאן נדון שילוב של שיטה פשוטה אנזימטי (collagenase, hyaluronidase ו- DNAse) ועיכול מכני מאתר לבבות ולפניהם קרישה תוך-כלית מינהל מתויג fluorescently נוגדנים להבדיל קטן אבל בלתי נמנע קרישה תוך-כלית תא מזהמים. שיטה זו יוצרת השעיה של מבודד התאים קיימא שניתן נותחו על ידי cytometry זרימה עבור phenotyping וכימות, או מטוהרים נוסף עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון או הפרדה מגנטית חרוז לימודי ניתוח או במבחנה תעתיק. אנו כוללים דוגמה של ניתוח cytometric זרימה צעד אחר צעד כדי להבדיל בין מקרופאג מפתח אוכלוסיות תאים דנדריטים של הלב. עבור ניסוי בגודל בינוני (10 לבבות) השלמת ההליך מחייב h 2-3.

מבוא

צורות שונות של מתח שריר הלב או פציעה, כולל איסכמי (פגיעה reperfusion איסכמיה או אוטם שריר הלב) ואיסכמי (יתר לחץ דם או דלקת שריר הלב), לקדם הגיוס של תאים דלקתיים עם תיקוני ומגונן, אבל גם מאפייני פתוגניים. מוקדם ככל 1891, רומברג תיאר לראשונה את הנוכחות של תסנין התאית בשריר של חולים שנדבקו עם טיפוס ועוד השנית¹. עם זאת, המחקר מפורט של תאים חיסוניים לב נדרש הפיתוח של טכניקות מתקדמות יותר immunophenotyping. כתוצאה מכך, רק לאחרונה התחלנו להבין כי אוכלוסיה מגוונת של תאים חיסוניים עם תחזוקה חיוני תפקידים במהלך מצב יציב שוכן בתוך שריר הלב.

היסטולוגיה היה, והוא עדיין, השיטה הנפוצה ביותר כדי לאפיין את תאי מערכת החיסון לב בעת דלקת. עם זאת, בעוד היסטולוגיה מייצג כלי אבחוני חשוב, השימוש במחקר של תאי מערכת החיסון לב יש מגבלות חשוב. תאים חיסוניים המתגוררים שריר הלב מייצג חלק קטן מאוד של התאים הכולל ומופצים פחות או יותר באופן שווה בחלל העצום באופן פרופורציונלי. באופן דומה, כמה צורות של דלקת לב, כגון נגיפי דלקת שריר הלב, להציג דפוסים מוקד של דלקת. משמעות הדבר היא כי ניתוח מדויק של המערכת החיסונית של הלב דורשים לעיתים קרובות גבוהה יותר מעלות של דגימה היסטולוגית, הגדלת העלות לצמצם הטיה. יתר על כן, היסטולוגיה מספק כמות מוגבלת מאוד של מידע שימושי בזיהוי תא (למשל מספר פרמטרים). עם מספר גדל והולך של תת-ערכות תא מחייבות השימוש של מספר סמני ביטוי (כולל סמני פני השטח, גורמי שעתוק או על ידי מולקולות), cytometry זרימה ביססה את עצמה בתור הכלי החזק ביותר עבור immunophenotyping, בשל בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה.

השימוש בטכניקות immunophenotyping תלויה בשיתוף פעולה הדוק לפיתוח פרוטוקולים לעיכול יעיל המותר עבור ניתוח חד-תאים של מספר גדול של תאים. הפיתוח של הפרוטוקולים ממצה של מיצוי תא נפתח חלון חדש של הזדמנויות במחקר של הלב אימונולוגיה. באמצעות השילוב של מערכת העיכול, cytometry זרימה transcriptomics, האוכלוסיות הגדולות של מקרופאגים, תאים דנדריטים ששוכן בלב היה מאופיין^2,3. האוכלוסייה הנפוץ ביותר של תאים חיסוניים הלב במהלך מצב יציב הן CD64⁺MerTK⁺ מקרופאגים, אשר ניתן לחלק נוספת המבוססת על הבעת רגשותיהם CCR2 או CD11c². CCR2⁺ מקרופאגים שמקורם במח העצם למבוגרים hematopoiesis, בעוד הרוב המכריע של CCR2^– מקרופאגים, אשר יכולים לבטא רמות גבוה או נמוך של MHC-II, הם בעיקר ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים לבצע פונקציות מפתח כגון תיקון⁴ ופינוי פסולת⁵ במהלך פציעה או תמיכה קישוריות חשמלי⁶ במצב יציב. במהלך צורות שונות של דלקת זרם חשוב של Ly6C^שלום MHC-II^הלאו CD64^int ומונוציטים להתרחש, אשר מאוחר יותר להבדיל לתוך Ly6C^שלום CCR2⁺ מקרופאגים^2,7 . אוכלוסיה קטנה יותר באופן משמעותי, אבל חשוב, של תאים המתגוררים שריר הלב של אנשים בריאים מורכב של תאים דנדריטים^8,9. שני תת-קבוצות העיקריים של הלב בקרי קבוצת מחשבים קונבנציונלי (cDCs) אפיינו היה לאחרונה: cDC1 (CD103⁺ DCs), cDC2 (CD11b⁺ בקרי קבוצת מחשבים). DCs לשחק תפקידים חשובים בהגנה נגד זיהום⁸ , אך יכול גם לקדם פגיעה עצמית בעת דלקת, במיוחד במהלך אוטם שריר הלב⁹.

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של קיימא תאים חיסוניים הלב מן העכבר שריר הלב. השיטה משלבת עיכול אנזימטי ועל מכניים עם סינון תא-מסננת כדי לקבל השעיה תא בודד שניתן לנתח, או עוד יותר טהור, על ידי מיון cytometry זרימה או חרוז מגנטי העשרה. מדידות מדויקות של תאי שריר הלב extravascular דורשות זלוף הלב כדי להסרת לכלוך אפשרי מזרם הדם של microvasculature הלב. בנוסף, אנו מציגים שלב אופציונלי של קרישה תוך-כלית תיוג של תאים חיסוניים יכול לשמש כדי נוספות להבדיל תאי שריר הלב מזהמים קרישה תוך-כלית, המבוסס על פרוטוקול et al. Galkina¹⁰. לבסוף, אנו מציגים ניתוח cytometry זרימה בסיסיים כדי לזהות את subpopulations הגדולות מקרופאג ו- cDC.

פרוטוקול

אתיקה במשפט: פרוטוקול זה עבר בדיקה וזכה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה אוניברסיטת בריאות ברשת (טורונטו, קנדה), עומדת בדרישות המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים.

1. מאגר הכנה

1. להכין מאגר HBB (מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), סרום שור חום 2% לא פעיל, 0.2% שור אלבומין). להוסיף 10 מ של חום להשבית סרום שור ו- 1g של אלבומין שור עד 500 מ"ל של HBSS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C.
2. הכנת מאגר FACS (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 2% חום להשבית סרום שור, 1 מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, pH 8.0)). להוסיף 10 מ ל חום להשבית סרום שור, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 500 מ"ל ל- PBS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C.
   הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 ° C עד כחודש.

2. תוויות של מחזורי לויקוציטים

1. גילוח ורחיצה כירורגית להכין אנטי-עכבר הזרקת CD45 עם 1 µg של נוגדן מעורבבת עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) עבור אמצעי אחסון הזרקת הסופי של µL 200/עכבר. לטעון אמצעי אחסון לתוך מזרק אינסולין 28.5G ולשמור מן האור.
   הערה: השתמש שני נוגדנים שונים מתויג fluorochrome אנטי-CD45 על מנת להבדיל את קרישה תוך-כלית (מוכתמים דרך העירוי המינהל) ההכתמה intracardiac (מוכתמים לאחר עיכול; ראה שלב 4).
2. לחמם עכברים (בת 8-12 שבועות) על ידי חשיפת הזנב למנורה לחום האדום במשך 5 דקות.
   התראה: לא לחמם יותר מדי את החיה. לשמור את המנורה במרחק בטוח (> 30 ס מ).
   1. לרסן את החיה במצב בחזה ובצלעות באמצעות התקן המתאים. לחשוף ולייצב את הזנב עם היד הלא דומיננטית על ידי שיתק בבסיס הזנב עם והאמה ובאזור אמצע-הדיסטלי של הזנב כאשר האגודל הקמיצה.
      התראה: אין להחיל יותר מדי כוח בקצה הזנב כמו העור יכול להיות הסיר. הכנס את המחט עם שפוע פונה כלפי מעלה המזרק. שמרו את המחט במקביל לוריד בכל עת קל לנקב את הווריד.
      הערה: דם הזנת את המזרק עלולה להתרחש, סימן של זריקה טובה. כיפוף המחט לזווית 90 מעלות יכול להקל על הניהול עירוי. אשר עם משרדך בטיחות כמו מחטים כיפוף עשוי לייצג סיכון.
   2. מזריקים לווריד 200 µL לווריד הזנב. הנוזל צריך לזרום בקלות ונקה באופן זמני את הווריד.
      התראה: אל תדחף בכוח נוזלים אם ההתנגדות. זהו סימן מוזרים של המחט.
   3. לאפשר נוגדן לזרום למשך 5 דקות לפני בצורה הומאנית המתות חסד העכבר.

3. הלב בידוד ועיכול

1. המתת חסד עכברים באמצעות CO₂ או על ידי אחרים הליך מקובל כמוסד המתת חסד.
   1. עבור CO₂ המתת חסד, מקם את העכבר בתא₂ CO ולהגדיר את קצב מילוי 20% נפח החדר לדקה (קרי, אם החדר הוא L 10, מילוי ב- 2 ל'/דקה). לפעול במשך 2 דקות וצג העכבר עד להפסקת נשימה.
   2. . כבה את ה-CO₂ ולא להשאיר את העכבר דק 1-2 נוספים ודא נשימה שחדל לפני פתיחת התא ולבצע קמצוץ הבוהן כדי לאשר שהעכבר מת לפני שתמשיך כדי לעבד את העכבר.
2. לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את העור בבטן, לנתח את העכבר על ידי גזירה לאורך תחילת קו האמצע הגחון ברמה של הירכיים עד עצם החזה. לפתוח את הבטן ולהעביר את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת.
3. חותכים את הסרעפת, אז הצלעות משני צידי הקו האמצעי, להיות נזהר שלא ניקב את הריאות והלב.
   1. חושפים הלב על ידי פילינג בחזרה את הצלעות, ואז לחתוך קודם אטריה שמאל ואחריו אטריה נכון.
      התראה: שימוש באזהרה בעת חיתוך אטריה, המבטיח שאין עורקים או ורידים נפצעים, כמו זה יכול להפחית את היעילות של שטיפה הדם הכלול האברים.
   2. Perfuse את הלב עם 15-20 מ"ל של PBS קר באמצעות מזרק 60 מ ל מצויד עם מחט 21 G, PBS קר. בעדינות לתפוס את הבסיס של הלב עם מלקחיים והכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ליד השיא. חזור על הפעולות של החדר הימני. זריקה נכונה גורמת לבן הריאות והכבד חיוור.
      הערה: זלוף צריכה להתבצע בתוך 5 דקות לאחר המתת חסד כדי למנוע קרישת דם, אשר יכול לזהם את האיברים של עניין עם מחזורי תאים.
4. להחזיק את הבסיס של הלב עם מלקחיים, בעדינות תמשוך את הלב ולאחר מכן לנתק את הלב על ידי חיתוך ועורק הריאה ראשי ואת הוורידים, העורקים השק סביב הלב.
   1. לנקות את הלב על-ידי בעדינות החזקת את הלב בין האגודל לבין האצבע במגבת נייר נקייה נטולת ומשוך את אטריה, שרידים של העורקים הראשיים, ורידים, כל מזהמים אחרים עם מלקחיים.
      הערה: ודא מכלול של אטריה מוסר אין רקמות אחרות, כגון הריאות או כלי דם, קיימים כמו רקמות אלו יש תאים חיסוניים תושב משלהם. הריאה בפרט יש אוכלוסיה תאים חיסוניים גדולים זה יכול להסוות את אוכלוסיות קטנות יותר של אלה בתוך שריר הלב.
5. מקום בלב בצלחת פלסטיק 5 ס מ עם µL 50 ל- PBS קר.
   1. מינצ הלב באמצעות מספריים ויבתר מעוקל עד אין כלים גלוי, יש עקביות חלקה.
      הערה: לנסות לשמור על הלב באזור כלולות של המנה במהלך קוצץ כדי למזער את איבוד רקמות.
   2. העברת רקמות thetrituratedheart באמצעות מלקחיים מעוקל לתוך צינור microcentrifuge 2 מ עם 800 µL קר Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM).
6. להוסיף ofcollagenase U/mL 450 אני 60 U/mL של hyaluronidase סוג אני-S, 60 U/mL של DNase-את כל דגימה.
   1. דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף נדנדה ב-50 סל ד למשך 45-60 דקות.
7. לאחר עיכול, בקצרה דוגמאות מערבולת (20 s) ומניחים מיד על קרח כדי לשמור דגימות על 4 מעלות צלזיוס.
   1. באמצעות pipettor של 1 מ"ל, פיפטה דגימות למעלה ולמטה עד דגימות רקמה הומוגנית, לא לסתום את הטיפ פיפטה.
      הערה: הגדרת מספר מסוים של פעמים על פיפטה עשוי להגביר הפארמצבטית. אם הלבבות לא מתעכל בצורה אופטימלית, חתיכות של שריר הלב עלול להכשיל את פיפטה. טחינת בעדינות את הטיפ פיפטה נגד הצינור microcentrifuge יעזור homogenize גדול יותר חתיכות רקמה.
8. טרום רטוב מסננת תא 40 µm המוטלות על צינור חרוטי 50 מ עם 1 מ"ל של HBB קר.
   1. הוסף מדגם הומוגני את המסנן ' לשטוף דרך מאת לאט למזוג 12 – 14 מ ל HBB קר.
   2. העברת דגימות מסוננים צינור חרוטי שכותרתה 15 מ"ל ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
9. צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. תשאף את תגובת שיקוע.
   1. Lyse כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 1 מ"ל אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר כל דגימה. Resuspend דגימות מאת vortexing, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   2. לאחר פירוק השלימה, להוסיף 5-8 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק קר) להפסיק המוליזה.
10. צנטריפוגה דגימות-gfor 400 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. תשאף את תגובת שיקוע.
11. להוסיף 1 מ"ל FACS מאגר כל דגימה של העברת צינור microcentrifuge mL 1.5 עם תוויות ברורות.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עבור עד 2 שעות עם דגימות המאוחסנים ב 4 º C.

4. לזרום Cytometry מכתים וניתוח

1. צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
   1. להפחתת נוגדנים שאינם ספציפיים מחייב, לדלל מטריים anti-CD16/CD32, מונוציט חוסם הפריטים המוקפצים (1:20) חשבונאות (ראה טבלה של חומרים) עבור 50 FACS µL עבור דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
   2. להכין את הנהלת דילול (1:250 עבור כל נוגדן) נוגדנים עבור 50 µL של FACS לדגימה.
      הערה: צבע הכדאיות יכולות להיכלל הנוגדן קוקטייל כדי לא לכלול תאים מתים. לחלופין, גודל קטן מהכלל על-ידי ניתוח תזרים יכול להיות משומש (איור 1C ו- D).
   3. בלי כביסה, להוסיף 50 µL של מיקס מאסטר נוגדן אחד לטעום ולערבב.
   4. דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
2. להוסיף 600 µL FACS כל מדגם לשטוף את צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב- 300 µL FACS. לשמור דגימות ב 4 ° C בחושך.
   הערה: צבעי הכדאיות מסוימים, כגון דאפי, לדרוש מכתים בתוך 10 דקות לפני הפעלת cytometry זרימה.
4. לנתח ידי cytometry זרימה (ראה דמויות 1 ו- 2) בתוך ה 3 הבא. אם זמן רב יותר הוא נדרש, קצר טווח קיבוע באמצעות paraformaldehyde של ריכוז נמוך (0.5-1% ב- PBS) מומלץ לשמר מכתים.
   הערה: מומלץ לסנן דגימות דרך מסננת תא 40 µm לפני ניתוח cytometry זרימה אתחול כדי למנוע שיבוש פלואידיקה של cytometer הזרימה.

תוצאות

נכון להיום, אין שיטה טובה תוכנן כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים מרכיבי התא הלב, כגון cardiomyocytes. לפיכך, ניתוח של התליה תא בודד הלב מאת cytometry זרימה דורש מראש-gating עם CD45 כדי לזהות את אוכלוסיות תאים חיסוניים, ואחריו תא בודד, גודל קטן אי-הכללה של חסימה (איור 1א'). לחלופין, את הכדאיות צביעת ניתן לבצע כדי לא לכלול תאים מתים. אי-הכללה של גודל קטן, הכדאיות צבע צביעת מייצגים שתי שיטות כדי לא לכלול תאים מתים (איור 1

דיון

דלקת שריר הלב, או דלקת שריר הלב, היא תכונה של מחלות לב וכלי דם ביותר. עם זאת, שריר הלב אינו נטול משלו רכיבי מערכת החיסון במצבים שאינם מחלת. במהלך מצב יציב, תאים חיסוניים רבים שוכנים בשריר, לגלם את התפקידים החיוניים של תחזוקה והגנה. אפיון אלה אוכלוסיות מגוונות של תאים לא היה אפשרי ללא שיטות כמו האחד הוצג פרוטוקול זה.

שילוב של עיכול מכני, אנזימטי של שריר הלב מאפשרת את ניתוקה של השעיה תא בודד יכול לשמש בשילוב עם שיטות אחרות של ניתוח, כגון לזרום cytometry או immunomagnetic חרוז בידוד. מספר שיקולים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט חוצץ מלח	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 מ"מ x 40 מ"מ) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank' s תמיסת מלח מאוזנת	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
סרום בקר אלבומין	Sigma-Aldrich	A4503-50G
סרום בקר	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה	BioShop	EDT111
מסנן ואקום, 0.2 µ m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 גרם 1/2 1 סמ"ק מזרק אינסולין	BD	329424
60 מ"ל BD		309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ו-L-גלוטמין ונתרן פירובט
קולגנאז I	Sigma	C0130	מ-Clostridium histolyticum
היאלורונידאז מסוג I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	מלבלב בקר
מסננת תאים, 40 ומיקרו; m ניילון	פלקון	352340
אמוניום-כלוריד- אשלגן (ACK) מאגר ליזה	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 נגד עכברים/אנושי CD11b	Biolegend	101222	1:250 דילול
APC/Cy7 נגד עכבר Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 דילול
APC נגד עכבר CD103	Biolegend	121414	1:250 דילול
מבריק סגול 605 נגד עכבר CD11c	Biolegend	117334	1:250 דילול
PE נגד עכבר Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 דילול
פסיפיק כחול נגד עכבר I-Ab	Biolegend	116422	1:250 דילול
FITC נגד עכבר CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 דילול
PE/Cy7 נגד עכבר CD45	Biolegend	103113	1:250 דילול
PerCP/Cy5.5 נגד עכבר CD45	Biolegend	103132	1:40 דילול
TruStain fcX (נגד עכבר CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 דילול
חוסם מונוציטים True-Stain	Biolegend	426101	1:20 דילול
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
עכבר: Batf3 -/-מעבדת	ג'קסון	JAX: 013755