הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58129

⸱

19 באוגוסט 2018

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

שינויים ב- kynurenine מסלול (KP) neuroactive מטבוליטים הם מעורבים מחלות פסיכיאטריות. חוקרים התוצאה הפונקציונלית של kynurenine שינו מסלול חילוף החומרים של ויוו בחולדות עשוי לעזור להבהיר רומן גישות טיפוליות. בפרוטוקול הנוכחי משלב גישות ביוכימיים והתנהגותיים לחקור את ההשפעה של אתגר kynurenine חריפה אצל חולדות.

תקציר

מסלול kynurenine (KP) של טריפטופן השפלה היה מעורב הפרעות פסיכיאטריות. באופן ספציפי, נגזר אסטרוציט המטבוליט kynurenic חומצה (KYNA), אנטגוניסט-שתי N-מתיל-d-אספרטט (NMDA) ואת רצפטורים אצטילכולין nicotinic (α7nACh) α7, היה מעורב תהליכים קוגניטיביים על בריאות ומחלה. כפי KYNA רמות גבוהות במוחם של חולי סכיזופרניה, תקלה glutamatergic, קולטנים שימוש הוא האמין להיות סיבתי קשורה בתפקוד הקוגניטיבי, תחום הליבה של פסיכופתולוגיה המחלה. KYNA עשוי לשחק תפקיד משמעותי pathophysiologically אנשים עם סכיזופרניה. ניתן להעלות את רמת KYNA אנדוגני במוח מכרסמים על ידי טיפול בבעלי-חיים עם kynurenine bioprecursor ישירה, פרה מחקרים בחולדות הראו כי הגבהים חריפה ב- KYNA עשוי להשפיע את תהליכי הלמידה והזיכרון שלהם. בפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה זו ניסיוני בפירוט, והוא משלב א) ניתוח הביוכימי של רמות kynurenine בדם והמוח היווצרות KYNA (באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים), בדיקת b) התנהגותית כדי לחקור זיכרון הקשרי תלויי-בהיפוקמפוס (פרדיגמה הימנעות פסיבי), ו- c) הערכה על התנהגות שינה [telemetric הקלטות שילוב העוויתיים (EEG) electromyogram (EMG) אותות] אצל חולדות. יחדיו, יחסים בין גבוהות KYNA, שינה, קוגניציה היא למדה, פרוטוקול זה מתאר בפירוט גישה נסיונית להבנת תפקוד תוצאות של העלאת kynurenine ו KYNA היווצרות ויוו בחולדות. התוצאות המתקבלות באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה יהיה לבחון את ההשערה כי KP ואת KYNA לשרת תפקידי מרכזי הכוח ויסות שינה וקוגניציה במצבי בריאות ומחלה.

מבוא

KP אחראי משפילים כמעט 95% של טריפטופן חומצת אמינו חיונית1. במוח של יונקים, kynurenine תוך האסטרוציטים עובר מטבוליזם בתוך המולקולה קטנה neuroactive KYNA בעיקר על ידי האנזים kynurenine aminotransferase (קאט) II2. KYNA פועל כמו אנטגוניסט-קולטני NMDA, α7nACh המוח2,3,4, ואני גם מטרות איתות קולטנים כולל הקולטן פחמימן aryl (אמפר לשעה) ו- G-החלבון בשילוב קולטן 35 (GPR35)5 ,6. בחיות ניסוי, הגבהים במוח KYNA הוכחו לפגום את הביצועים הקוגניטיביים שלהם במערך של מבחני התנהגות2,7,8,9,10 . השערת המתעוררים מרמז על זה KYNA ממלא תפקיד חשוב להתכוונן תפקודים קוגניטיביים על ידי להשפיע על התנהגות שינה11, ובכך תומך עוד יותר את התפקיד של מולקולות נגזר אסטרוציט של להתכוונן לנוירוביולוגיה של שינה, קוגניציה12.

קלינית, הגבהים, KYNA נמצאו השדרתי ורקמות המוח פוסט-מורטם של חולים עם סכיזופרניה13,14,15,16, הפרעה פסיכיאטרית מתישה מאופיין על ידי ליקויים קוגניטיביים. חולי סכיזופרניה מוטרדים גם לעתים קרובות על ידי הפרעות שינה זה עשוי להחריף את המחלה17. להבין את התפקיד של חילוף החומרים KP, KYNA הכוח ויסות גומלין בין שינה, קוגניציה, בעיקר בין למידה וזיכרון, עשויה להוביל לפיתוח טיפולים לטיפול אלה עני תוצאות סכיזופרניה, השני מחלות פסיכיאטריות.

שיטה אמינה ועקבית לשקילת KP מטבוליטים חשוב להבטיח כי המחקר המתעוררים ממוסדות שונים שניתן לשלב את ההבנה המדעית של KP ביולוגיה. כיום, אנו מתארים את המתודולוגיה למדוד kynurenine בפלסמה עכברוש, KYNA במוח חולדה על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). בפרוטוקול הנוכחי, אשר עושה שימוש זיהוי fluorimetric בנוכחות Zn2 +, פותחה לראשונה על ידי Shibata18 ועוד לאחרונה הותאם and אופטימיזציה to derivatize עם 500 מ מ אבץ אצטט כמו טור שלאחר הכימית, המאפשר זיהוי אנדוגני, כמויות nanomolar של KYNA המוח11.

לעורר את הייצור KYNA דה נובו אנדוגני כמפורט בפרוטוקול הנוכחי, kynurenine bioprecursor ישירה מוזרק intraperitoneally (i.p.) בחולדות. בשילוב עם הערכות ביוכימי כדי לקבוע את מידת KYNA ייצור, ההשפעות של kynurenine לקרוא תיגר על הזיכרון תלוי בהיפוקמפוס (הימנעות פסיבי הפרדיגמה) ואת הארכיטקטורה שינה (EEG ו- EMG אותות) הוא גם ובדוקים11. שילוב של שיטות אלה מאפשר חקר ההשפעה הביוכימי ופונקציונליים של יישום kynurenine אתגר ויוו בחולדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

את כל מנגנוני ניסיוני אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מרילנד ועל שימוש הוועדה ועקבתי המדריך מכוני הבריאות הלאומיים של על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה.

הערה: חולדות Wistar זכר בוגר (250 – 350 גרם) שימשו כל הניסויים. גדודים נפרדים של חיות שימשו עבור ניתוח הביוכימי, ניסויים התנהגותיים שינה הקלטות. החיות שוכנו במתקן טמפרטורה מבוקרת במכון המחקר הפסיכיאטרי מרילנד. הן הוחזקו על מחזור בהירה-כהה h 12/12, עם אורות בזמן zeitgeber (ZT) 0 ל האורות ZT 12. החיות קיבלו גישה ad libitum מזון ומים במהלך הניסויים. המתקן היה מוכר באופן מלא על ידי האגודה האמריקאית עבור ההסמכה של מעבדה חיה טיפול.

1. בקרום הבטן Kynurenine המינהל חולדות

הערה: ב פרוטוקול זה, kynurenine היה מנוהל ב- ZT 0 (תחילת שלב אור), רקמות נאסף-ZT 2 ו- ZT 4 לקביעת מסלול זמן חילוף החומרים kynurenine. הזרקת מי מלח חיות שימשו פקד. למשל, אם חולדה שוקל 500 גרם, המינון הרצוי הוא 100 מ ג/ק ג, העכברוש צריך לקבל זריקה 5 מ של פתרון 10 מ"ג/מ"ל של kynurenine.

  1. שוקל את L-kynurenine סולפט ("kynurenine") ולמקם אותו לתוך בקבוקון זכוכית 20 מ. הקפד לשמור את kynurenine על קרח כל הזמן.
  2. הוסף תמיסת מלח לריכוז הרצוי ולהתאים את ה-pH ל 7.6 באמצעות N 1 נתרן הידרוקסידי (NaOH). מערבולת, sonicate את הפתרון עד kynurenine יש התפרקה לחלוטין.
    התראה: נקטו כל המלצה לטיפול NaOH.
    1. לדוגמה, כדי להשיג פתרון 10 מ"ג/מ"ל, שוקל את 200 מ ג של kynurenine ולמקם אותו בקבוקון זכוכית. להוסיף 15 מ"ל של תמיסת מלח, מערבולת, sonicate (20 kHz עבור 5 – 10 s, microtip בקוטר 1/8 אינץ ') כדי לפזר. באמצעות NaOH, להתאים את רמת ה-pH של התמיסה. לבסוף, השתמש תמיסת מלח כדי לכוונן את העוצמה עד 20 מ"ל.
  3. שוקל כל עכברוש ניסיוני, לחשב את הנפח של כל זריקה מבוסס על משקל הגוף של בעל החיים והמנה הטיפול הרצוי. בזהירות להסיר את החיה מהכלוב בבית, להזריק את הפתרון intraperitoneally, ויש להחזיר את החיה לכלוב שלו.

2. Kynurenine מדידות באמצעות ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית

  1. אוסף רקמה
    הערה: ב פרוטוקול זה, kynurenine היה מנוהל ב- ZT 0 (תחילת שלב אור), רקמות נאסף-ZT 2 ו- ZT 4 לקביעת מסלול זמן חילוף החומרים kynurenine. הזרקת מי מלח חיות שימשו פקד.
    1. השתמש פחמן דו-חמצני כדי להרדימו. אחרי הסימנים של נשימה חדלו עבור 1 דקות, לבצע שיטה המתת חסד משני על ידי עריפת ראש.
    2. כדי לאסוף את כל כלי הנשק דם, מניחים משפך חד פעמיות לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 20 μL של K3-EDTA (0.5 מ'). לאפשר את הדם להחלים מן הגוף לתוך הצינור. היפוך הצינור שוב ושוב כדי להבטיח ש-EDTA הוא מעורב בכל רחבי.
    3. באמצעות מספריים, לחתוך את העור בתקרת הראש למטה האמצע לחשוף את הגולגולת. הסר כל שריר הצוואר עודף בצד האחורי של הגולגולת, בטקס הפתיחה של חוט השדרה, לחתוך את הגולגולת מאחורה לקדימה.
      1. משוך בעדינות את שני צידי הגולגולת פתוחה כדי לחשוף את המוח ולאחר מכן הסר בזהירות את המוח עם מלקחיים כדי לא לגרום לו נזק. להסיר את הנורות הריח עם סכין גילוח וחותכים את המוח לחצי את האמצע. באמצעות מלקחיים, לנתח את hemibrain למחוזות מעניינים (קרי, ההיפוקמפוס, קליפת המוח).
    4. במקום כל החלקים במוח גזור על רדיד אלומיניום על קרח יבש. לאחר הרקמה לחלוטין קפוא, להעביר אותו בקבוקון פלסטיק 20 מ"ל ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
    5. Centrifuge את הדם כל כלי הנשק ב x 300 גרם במשך 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע (פלזמה) ולהעביר אותו לתוך צינורות חדשים צנטריפוגה לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת הדוגמא
    1. פלזמה: אסף מחיות שטופלו
      1. להפשיר את הצינור קפוא עם פלזמה (ראה שלב 2.1 עבור אוסף רקמה) על קרח רטוב.
      2. בשפופרת צנטרפוגה חדש, לדלל את הדגימה עם הנדסה גנטית מים (1:2 על kynurenine, 1:10 עבור KYNA). כדי μL 100 המדגם מדולל, להוסיף 25 μL של 6% חומצה על-כלורית.
        התראה: נקטו כל המלצה לטיפול חומצה על-כלורית.
      3. מערבולת כל הדגימות, ואז centrifuge אותם ב x 12,000 g למשך 10 דקות. לאחר סיום, להסיר μL 100 של תגובת שיקוע (מתוך כל שפופרת) ולמקם אותם לתוך צינור microcentrifuge קטנים 0.25 mL של kynurenine או KYNA נחישות.
    2. המוח: אסף מחיות שטופלו
      1. במקום צינורות עם דגימות מוח קפוא (ראה שלב 2.1 עבור אוסף רקמה) על קרח יבש. בנפרד לשקול כל מדגם המוח על האיזון האנליטי. להחזיר אותה ברכבת התחתית ולמקם אותו בחזרה על קרח יבש.
      2. לאחר כל הדגימות היה שקל, להעביר הצינורות אל קרח רטוב. לדלל כל מדגם 1:10 w/v עם מים הנדסה גנטית, homogenize אותם באמצעות של sonicator (20 kHz עבור 5 – 10 s, microtip בקוטר 1/8 אינץ '). לדוגמה, עבור 100 מ ג של רקמת המוח, הוסף 900 μL של מים הנדסה גנטית.
      3. Aliquot 100 μL של כל אחד מדולל לדגום את צינור, acidify זה עם 25 μL של 25% חומצה על-כלורית. מערבולת, אז centrifuge זה ב x 12,000 g למשך 10 דקות.
      4. לאחר צנטריפוגה, להסיר μL 100 של תגובת שיקוע ולמקם אותו לתוך צינורות microcentrifuge קטנים 0.25 mL עבור קביעת KYNA.
  3. בניהול הקמה HPLC
    1. להכין 50 מ מ סודיום אצטט שלב ניידים. להמיס 6.81 גר' נתרן trihydrate אצטט ב- 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 6.2 באמצעות חומצה אצטית ולסנן ואז ואקום אותו לתוך כלי זכוכית נקי. העברת השלב סודיום אצטט ניידים לבקבוק זכוכית נקי של 1 ליטר.
    2. להכין אצטט אבץ 500 מ מ. להמיס 54.88 גר' אבץ אצטט ב 500 מ"ל של מים הנדסה גנטית, ואז ואקום. שאמלא את זה. להעביר אותו בקבוק זכוכית נקי 500 מ"ל. למלא בקבוק 1 ליטר מים הנדסה גנטית, בקבוק 500 מ"ל עם HPLC כיתה acetonitrile.
    3. מקם את הצנרור צריכת מהמכונה HPLC בנפרד לתוך השלב ניידים המים הנדסה גנטית, acetonitrile של 100%. משאבת הפתרון אצטט אבץ בנפרד באמצעות משאבה סחרור המשלבת עם העמודה שלאחר שלב ניידים, ולפני את derivatization.
    4. שימוש בלוח הבקרה על המכונה, לתכנת אותו לרוץ 5% acetonitrile ו- 95% מים הנדסה גנטית-0.5 מ ל לדקה לאפשר לו לפעול למשך 20-30 דקות להשיג את הלחץ יציבה בסיסית.
    5. על הקמת בסיס יציב, לשנות את ההרכב פתרון 5% acetonitrile ו- 95% סודיום אצטט שלב ניידים. Equilibrate למשך 30 דקות.
    6. להדליק את המנורה, גלאי קרינה פלואורסצנטית ולאפשר לו להתחמם.
    7. בינתיים, גם להפעיל המשאבה שלאחר עמודה כדי קצב זרימה של 0.1 מ"ל לדקה לאפשר לו להגיע בלחץ יציב של 500 psi לאחר כ 20 דקות.
    8. הכינו את הסטנדרטים.
      1. עבור KYNA, להתחיל עם פתרון מניות 1 מ מ, למהול אותו להכין 5 ריכוזי רגיל (כלומר, 10 ננומטר, 5 nM, 2.5 ננומטר, 1 ננומטר, ו-500 pM).
        הערה: זה יהיה לייצר עקומה סטנדרטיים ועד 200 fmoles fmoles 10 לכל זריקה μL 20.
      2. עבור kynurenine, להתחיל עם פתרון מניות 1 מ מ, למהול אותו להכין 5 ריכוזי רגיל (כלומר10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1 μM, 500 ננומטר).
        הערה: זה יהיה לייצר עקומה סטנדרטיים ועד 200 pmoles pmoles 10 לכל זריקה μL 20.
    9. הגדר את תוכנת המערכת HPLC לשלוט הפרמטרים רצף הדגימה ולאפשר autoinjections של דגימות מרובים.
      1. כאשר על המסך "Sample לרוץ", לחץ על 'קובץ' וגררו להגדרת"ליצור חדש מדגם". עם פתיחת חלון חדש, בחר "ריק". פרט בנפרד כל אורח/ים ילד/סטנדרטים (ראה שלב 2.3.8) או דוגמאות לפי הסדר שהם אמורה לפעול.
      2. בעמודה "פונקציה", לייעד את הסטנדרטים ודוגמאות. צריך להיות לבדיקה את הסטנדרטים-ההתחלה ואת הסוף של הרצף. להזריק מים בין כל דגימות 5.
      3. להגדיר זמן ריצה עבור כל דגימה 15 דקות μL 20 להזריק המדגם את הסטנדרטים, הכנת פלזמה או להזריק 30 μL של המדגם משלב הכנת homogenate במוח.
      4. להגדיר את עירור, פליטה אורכי גל (תלוי על המתחם המוערך) עבור kynurenine כדי עירור: 365 ננומטר, פליטה: 480 ננומטר ולאחר זמן השמירה: ~ 6 דקות, עבור KYNA כדי עירור: 344 ננומטר, פליטה: 398 מקומות ננומטר ולאחר זמן השמירה: ~ 11 דקות.
      5. לאחר כל הפרמטרים שהוגדרו, המכונה יש equilibrated, הפעל את הרצף.
      6. כדי לכמת את הנתונים, נווט אל המסך "עיון פרויקט". תחת הלשונית "ערכות מדגם", לחץ פעמיים על הדגימה מוגדר ניתן לכמת. מהרשימה של זריקות כל, להאיר בכל הסטנדרטים, לחץ לחיצה ימנית. בחלון חדש, בחר "תהליך" ולאחר מכן להשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור "לכייל, Quantitate" ליד "איך":.
      7. סמן כל הסטנדרטים שוב, לחץ לחיצה ימנית ובחר "ביקורת". כאשר chromatograms פותח, השתמש בלחצנים לאורך החלק העליון "לשלב" ולאחר מכן "כיול" כל תקן; פעולה זו תיצור באופן אוטומטי את עקומת סטנדרטי.
      8. לחזור לכרטיסיה "ערכות מדגם" ולחץ פעמיים על הסט הדגימה. בשלב הבא, הדגש בכל הסטנדרטים. חזור על התהליך האמור לעיל, אבל במקום זאת בחירה "Quantitate" מתוך התפריט הנפתח. סמן כל דוגמאות שוב, ואז לחץ לחיצה ימנית ובחר "ביקורת". כאשר chromatograms פתוחה, השתמש בלחצנים לאורך החלק העליון כדי "לשלב", ואז "Quantitate" אחד לטעום.
        הערה: זה פלט את הריכוז של כל מדגם בהתבסס על העקומה רגיל שנוצרה בעבר.

3. הפרדיגמה הימנעות פסיבי

הערה: ניסויים התנהגותיים אלו תוכננו בהתבסס על הממצאים שלנו הביוכימי עם האתגר kynurenine חריפה. כדי למקסם את גידול במוח KYNA, kynurenine (100 מ ג/ק ג) היה מנוהל ב- ZT 0, שעתיים לפני האימון עצמו בתוך הפרדיגמה הימנעות פסיבי כדי לבדוק את הלמידה בתיווך בהיפוקמפוס, שהתרחשה ZT 2. המנגנון מורכב 2 באופן שווה בגודל תאי (נמצא 21.3 ס מ, 20.3 ס מ רחב, ו- 15.9 ס"מ עמוק) המופרדים באמצעות דלת גיליוטינה, הכלול בתוך קופסה אטומים לרעש. שני תאים על מנגנוני בדיקה מכונים "לצד המואר", "הצד האפל". דפנות הצד הבהיר ברורים, במהלך הניסויים, אור יהפוך מאירות נוספות את התא. קירות התא כהה מכוסים לחלוטין כדי לשמור על מצב האפלה.

  1. יום 1: אימון ניסיון
    1. לפני הבדיקה, לנקות את המנגנון עם 70% אתנול.
    2. להביא את החיות מחדר הבדיקות.
    3. בעדינות למקם את החיה ניסיוני לצד האור של המנגנון, סגור, להיצמד אליו את מנגנון הדלת ואת תיבת אטומים לרעש.
    4. באמצעות התוכנה המשויכים, מתחילים את המשפט. במסך הראשי, בחר "קובץ" ואז "הפעלה פתוחה" מתוך התפריט הנפתח. בחלון חדש, להבטיח שההליך הנכון ואת המנגנון נבחרו ולחץ על 'סגור' '. בשלב הבא, בחר "הגדרת" ולאחר מכן "אותות". בחלון חדש, בחר את המנגנון הנכון ולחץ על "בעיה".
      הערה: התוכנה תיזום אור להפעיל בצד האור של המנגנון ולפתוח את הדלת גיליוטינה בין שני תאים. טיימר יהיה יזם.
    5. כאשר החיה נכנס באופן מלא את הצד האפל של המנגנון, את הגיליוטינה הדלת תיסגר מכת רגל בלתי נמנעת (0.56 אמא 1 s) תימסר.
    6. שיא הזמן שחלף לפני החיה הזנת התא כהה.
    7. אחרי החיה קיבל ההלם, לאפשר 30 s של זמן התאוששות לפני הסרת החיה המנגנון.
    8. מקום מאחור חיות בכלוב בבית.
    9. לפני תחילת המשפט עם החיה הבאה, נגב את המנגנון נקי עם מגבת רטובה, היפטרו מכל כדורי צואה.
    10. לאחר כל החיות הוכשרו, מחזירות אותם למתקן בעלי חיים.
  2. יום 2: בדיקה למשפט
    1. להחזיר חיות לחדר הבדיקה 24 שעות אחרי המשפט הכשרה. מתחילים המשפט בדיקה לבעל החיים הראשון על-ידי הצבתו לתוך הצד הבהיר המנגנון, סגירת latching את הדלת ואת תיבת אטומים לרעש.
    2. ליזום בדיקות המשפט שימוש בפקודות באותה תוכנה כמו ביום הקודם; האור יידלק אור בצד של המנגנון ויפתח הדלת גיליוטינה בין שני תאים. טיימר יהיה יזם.
    3. כאשר החיה מזין תא כהה, דלת גיליוטינה ייסגר. שיא הזמן חלף.
      הערה: המשפט יופסק באמצעות התוכנה לאחר מספר מרבי של 300 s אם החיה נותר מצד האור על מנגנוני בדיקה.
    4. מקום מאחור חיות בכלוב שלהם הביתה ולנקות את המנגנון (כפי שמתואר בשלב 3.1.9) לפני תחילת המשפט עם החיה הבאה.

4. ניתוח לישון

  1. השתלה כירורגית של משדר אלחוטי EEG/EMG
    הערה: telemetric צריך להיות מעוקר ומשדרי שהוכן לפני הניתוח.
    1. בעזרת סכין גילוח, להסיר בעדינות באורך קטן של ציפוי פלסטיק כדי לחשוף את שהכבל מוביל. למקם את משדרי 50 מ ל צינור חרוטי מלא לחיטוי פתרון [למשל, Wavecide (2.65% גלוטראלדהיד)].
      1. השאירו את משדרי הפתרון חיטוי לפחות 12 שעות. ואז, לפני הניתוח, להעביר את הפתרון פח אשפה. יש לשטוף את המשדר עם סליין סטרילי.
    2. ביום של הניתוח, לשקול את החיה לפני הנחתו בתוך חדר הרדמה. לגרום איזופלוריין % 3-5 עם 100% O2.
    3. על הרדמה מוצלח, להסיר את החיה, בזהירות להתגלח, באמצעות מכונת גילוח, החלק העליון של הראש והצוואר, כמו גם תיקון קטן של שיער בחלק האחורי של הגוף, רק מעט שמאל ומתחת קשת הצלעות.
    4. לנהל carprofen (5 מ"ג/ק"ג) subcutaneously על שיכוך כאבים לאחר הניתוח.
    5. מקם כרית חימום מים חמים thermostatically מבוקרת להגדיר ב 37 ° C תחת החיה כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה במהלך הניתוח.
    6. מסגרת stereotaxic, במקום החיה על קונוס האף כדי לשמור על התנאי הרדמה מקום ברים האוזן כדי לייצב את הראש. לחטא את העור מגולח, לסירוגין מטליות betadine סקראב ו- 70% אתנול. החל opthalamic משחה לעיניים לשמן אותם.
    7. כדי להבטיח הרדמה מספקת לפני החתך הראשוני, השתמש במבחן הבוהן-קורט.
    8. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך של ממש מאחורי העיניים למטה כדי האחורי של הצוואר. הגולגולת ושריר הצוואר צוואר הרחם הגבי צריכים להיות חשופים.
    9. במידת הצורך לחשוף את הגולגולת, השתמש applicators שקצהו כותנה כדי להסיר כל הקרומים. מיקרו-בולדוג מלחציים יכול לשמש כדי להחזיק את העור מן הגולגולת. לאתר ולסמן את המיקום של bregma. תרגיל 2 חור בגולגולת- ולהוסיף ברגי מתכת 2.0 מ מ קדמי / + 1.5 mm לרוחב ו- 7.0 מ מ אחורי /-1.5 מ מ לרוחב ביחס bregma. להשלים 2 מהפכות כדי להדק את הברגים. מכסים את הגולגולת חשוף עם פיסת גזה.
    10. באמצעות מספריים כירורגיים סטרילי, לעשות חתך לתוך חלל הגוף, ממש מתחת לצלעות.
    11. בגיליון כירורגי, הקפד לרשום את המספר הסידורי של המשדר כדי להיות מושתלים.
    12. הכנס את המשדר סטרילי בתוך חלל הגוף. ההפניות תיל עדיין צריך להיות מחוץ לגוף.
    13. השתמש נספגים לתפור את הקיר שריר, להבטיח כל ההפניות נאספים בקצה אחד של החתך.
    14. הסר את הגזה הראש ולהרים את העור מתחת החתך. להפעיל זוג ועוצרי דימום ארוך סטרילי מתחת לעור החתך הראשי כדי חתך בצד. תמשיך ללחוץ על העור כדי למזער פגיעה כלשהי.
      1. לאחר טוב ליד החתך הגוף, קליפ כל קרום זה עשוי לכסות אותם עם מספריים כירורגיים, תפוס שהמשדר ארבע מוביל. טוב. לאט לאט למשוך החוצה. טוב, כך החוטים לשכב תחת העור ולהתעצם בגולגולת.
    15. ציין אילו 2 מוביל תהיה מחוברת הגולגולת. באמצעות מלקחיים, לאחוז בקצה של חוט עם יד אחת, רק מתחת לסוף נדן פלסטיק עם האחר. משוך את החוט עד לולאות בודדים יכולים להתבצע רק.
    16. בחוזקה לעטוף חוט חשוף סביב אחד הברגים מתכת x 3-4. ברגע מאובטח, להדק את הבורג כדי למנוע את החוט להתיר ולגזור את חיווט נוסף כלשהו. חזור על פעולה זו כיוון שני של בורג.
    17. משוך שתי הפניות EEG מחלל הגוף כך הם יושבים צמוד לגולגולת.
    18. להשתמש במלט שיניים כדי לכסות את הברגים, מוביל קורטיקלית, יצירת כובע על הגולגולת חשוף. ודא כי צמנט שיניים ומודבקת על העור או שריר כי אין קצוות חדים נוצרים. לאפשר את הבטון שיניים להתייבש.
      הערה: הכובע צריך להיות קטן מספיק כי העור יכול להיות sutured מעל.
    19. עבור הפניות EMG, לאחוז בקצה של חוט, נדן פלסטיק כפי שמתואר בשלב 4.1.15. למתוח את החוט עד לולאות בודדים ניכרת בבירור.
    20. להפעיל מחט 22 גרם מתחת לשריר בצוואר בצד ימין במשך 2-3 מ מ לפני ומאפשרת להגיח. בעזרת תפרים nonabsorbable, מקום suture יחיד, חופשי סביב המחט מוטבעים.
    21. חוט חוט EMG לתוך המחט ומשוך את המחט החוצה, המאפשר את החוט EMG פתיל מתחת לשריר. להדק את התפר כדי להבטיח החוט נשאר באותו מקום, קליפ הנוספת חוט זה עשוי להגיח מן השריר.
    22. חזור על שלבים 4.1.20 ו- 4.1.21 עבור ההפניה השנייה EMG, 1 מ מ למטה מן ההפניה הראשונה.
    23. משוך שתי הפניות EMG מחלל הגוף כך הם יושבים צמוד נגד השריר.
    24. השתמש תפרים nonabsorbable לסגירת החתך הראש והצוואר. לקפל כל חוט נוסף מתחת לעור של הגוף ולהשתמש קליפים הפצע כדי לסגור את החתך הגוף.
    25. להחיל משחה לידוקאין בשני האתרים החתך כדי לסייע החיה עם כאב לאחר הניתוח.
    26. להחזיר את החיה לכלוב שלו הביתה, המאפשר את הכלוב לשבת על כרית חימום עד החיה שיחזר מן ההרדמה.
      הערה: החיה צריכה לשחזר במשך 7-10 ימים לפני תחילת ההקלטות.
  2. EEG/EMG הקלטה
    הערה: ב פרוטוקול זה, מנוהל מלח או kynurenine-ZT 0 ואנו מכן הקליט דפוסי של החיה שינה במשך 24 שעות ביממה.
    1. להשלים את כל ההקלטות לישון בחדר המיועד איפה החיות לא ייפגעו משך ההקלטה.
    2. למקם את הכלוב הביתה של החיה (הנושאת את המשדר EEG/EMG מושתל) על יחידת המקלט. להפעיל את המשדר מושתל בניתוח באמצעות מגנט.
      הערה: אור אמורה להופיע על יחידת מקלט המשדר מופעל.
    3. להגדיר את ההקלטה של נתוני EEG/EMG באמצעות תוכנה המשויכת.
      1. בחר "ניסוי" ולאחר מכן "יצירת" מתוך התפריט הנפתח. שם הניסוי ולאחר מכן לשמור אותו. בשלב הבא, בחר "חומרה" ולאחר מכן "עריכת תצורה MX2".
      2. בחלון חדש, בחר כל משדרי המשמשים את הניסוי, לציין איזה משטח המקבל כל מזווג עם. כשמוכן, ליזום את ההקלטה על ידי לחיצה על "להתחיל כל רציף".
    4. -הפסקת הניסויים, בחר "לעצור כל רציף" התוכנה המשוייכת וכבה את משדרי באמצעות המגנט.
    5. המתת חסד החיות בעזרת2 CO ואחריו נקב לב. הסר את המשדר בקפידה על ידי פותחים מחדש את החתך לאורך החלק העליון של הראש עם מספריים כירורגיים וחיתוך ללידים חינם מן השריר מלט והצוואר שיניים.
    6. הבא, לפתוח חלל הגוף, לאתר את המשדר, אט-אט להסיר אותו מן הגוף.
  3. ניתוח EEG/EMG
    1. להשתמש בתוכנה המשויך כדי לנתח את הנתונים שינה. פתח את התוכנית, בחר "הוסף מיקום חדש". בחלון חדש, בחר את הנתונים כדי לייבא אותה לתוך תוכנת הניקוד.
      הערה: פעולה זו תיצור קובץ חדש בתוך התוכנה המכיל כל ואת גלם שנאספו במהלך הניסוי.
    2. באופן ידני ניקוד המדינות דריכות על הניסויים הרצויים. אחרי הניקוד, לנתח את הפרמטרים כגון משך הפעילות הכולל, את מספר התקפי משך התקף ממוצע של המדינות דריכות השונות [תנועות עיניים מהירות (REM), שאינם - REM NREM ו התעוררות].
      הערה: הניתוח ניתן לבצע על פני כולו או מקוצר זמן מסוים נקודות העניין. . הניתוח בוצע עבור התקופה הקלטה בין ZT 0 ל ZT 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאמת את השימוש זריקה kynurenine בקרום הבטן כשיטה להעלות את המוח KYNA, בוצע ניתוח HPLC של רקמות. רגיל עקומות (איור 1) נבנו באמצעות התוכנה המשויכים ואת המותר עבור כימות של דגימות רקמה. נציג chromatograms עבור kynurenine ו- KYNA מוצגים באיור2. Kynurenine נצפתה בזמן השמירה של 6 דקות, והיה KYNA זמן השמירה של 11 דקות. כדי לבחון את הדינמיקה KP, 100 מ"ג/ק"ג של kynurenine היה מנוהל בפרוטוקול זה, רקמת נאסף מייד לאחר ההזרקה או 2 או 4 h ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבור הערכה אמינה של KYNA במוח לאחר המינהל kynurenine היקפיים, חשוב לשלב ולפרש ניסויים הביוכימי ופונקציונליים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר למשתמשים חדשים ליצור שיטות יעילות למדידת פלזמה kynurenine של המוח KYNA של חולדות. המדד של kynurenine ב הפלזמה אישרה הזרקה מדויקת ואת המידה של מטבוליט KYNA מאשרת את סינתזת דה נובו במוח. ישנם מספר יתרונות המתואר fluorometric HPLC השיטה, המותאמים מ Shibata18, derivatize KYNA בנוכחות Zn2 +, כולל את היכולת לזהות בדיוק כמויות KYNA אנדוגני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 NS102209) ותרומה של אמון פורבס קלייר אי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חולדות וויסטאר מעבדותנהר צ'ארלסזכר בוגר, 250-350 גרם
L-קינורנין סולפטSai Advantium
ReproSil-Pur C18 עמודה (4 מ"מ x 150 מ"מ)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
ברגי חומרי הרכבהפלסטיק אחד00-96 X 1/16
תפרים בלתי נספגיםMedRep Express699BCP רפואי מונומיד שחור תפרי ניילון, 4-0, P-3, 18 אינץ', קופסה של 12
תפרים נספגיםEthiconJ310H4-0 מצופה Vicryl Violet 1X27'' SH-1
צמנט שינייםStoelting Co.51458
מקדחהStoelting Co.5145510.45 מ"מ
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>תגובות
<חזק>ברית HPLC מערכת
E2695 מודול הפרדהווטרס176269503
2475 גלאי פלואורסצנטיווטרס
מנהל ריאגנטים לאחר הטורווטרס725000556
מחשב לנובוווטרס668000249
העצמת תוכנהווטרס176706100
שםחברהCatalog NumberComments
><חזקה>פסיבית תיבת הימנעות לחולדה
תא הנחתת קול MDF גבוה במיוחדMedAssociatesENV-018MDפנים: 22 אינץ' (W) x 22 אינץ' (H) x 16 אינץ' (D)
תא תיבת מעבורת מודולטור ערוץ מרכזיMedAssociatesENV-010MC
רצפת רשת נירוסטה לחולדהMedAssociatesENV-010MB-GF
דלת גיליוטינה אוטומטיתMedAssociatesENV-010B-S
ניתוק מהיר רתמת רצפת רשת מעבורת לחולדהMedAssociatesENV-010MB-QD
אור גירוי, עדשה לבנה בגודל 1 אינץ', מותקנת על פאנל מודולרימודולMedAssociates ENV-221M
Sonalert עם בקרת עוצמת קול לתא חולדותMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 כניסה/16 פלט חבילתMedAssociatesDIG-716P2
8 ערוצים בקרת IR עבור תיבות מעבורתMedAssociatesENV-253C
מקור אינפרא אדום ורצועות מערך דקטקטורMedAssociatesENV-256
ארון ממשק שולחני, 120 וולט 60 הרץMedAssociatesSG-6080C
מודול גירוי מרתיע זרם קבוע בטווח כפולMedAssociatesENV-410B
מודול רצפת רשת מצב מוצקMedAssociatesENV-412
מודול בקרת זעזועים כפול A/BMedAssociatesENV-415
2' 3 פינים הארכת מיני-מולקסMedAssociatesSG-216A-2
10 אינץ' כבל פלט זעזועים, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
כבל בקרת זעזועים של מעבורת 15 ', 6MedAssociatesSG-219SA
ארון שולחן קטן וספק כוח, 120 וולט 60 הרץMedAssociatesSG-6080D
חבילת ממשק PCIMedAssociatesDIG-700P2-R2
חבילת שירות הימנעות מתיבת הסעותMedAssociatesSOF-700RA-7
<חזק>שם< strong>CompanyCatalog Number>Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah SoftwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition InterfaceData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
מחשב Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 סיביותData Sciences International (DSI)271-0112-013
צג מחשב Dell בגודל 19 אינץ'Data Sciences International (DSI)271-0113-001
מקלטים לכלובי פלסטיק, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
נתב VPN של Cisco RV130Data Sciences International (DSI)RV130
מטריקס 2.0מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)271-0119-001
מתג רשתמדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)SG200-08P
תוכנת Neuroscoreמדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)271-0171-CFG
משדר שני ערוצי ביו-פוטנציאל, דגם TL11M2-F40-EETמדעי הנתונים הבינלאומי (DSI)270-0134-001
186247500

מקורות

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מסלול קינורניןפרדיגמת הימנעות פסיביתארכיטקטורת שינה ויקירהבדיקת זיכרון הקשרימדידת קינורנין בפלזמהיצירת KYNA במוחאנליזת HPLCגילוי פלואורסצנציה
יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.