שינויים ב- kynurenine מסלול (KP) neuroactive מטבוליטים הם מעורבים מחלות פסיכיאטריות. חוקרים התוצאה הפונקציונלית של kynurenine שינו מסלול חילוף החומרים של ויוו בחולדות עשוי לעזור להבהיר רומן גישות טיפוליות. בפרוטוקול הנוכחי משלב גישות ביוכימיים והתנהגותיים לחקור את ההשפעה של אתגר kynurenine חריפה אצל חולדות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מסלול kynurenine (KP) של טריפטופן השפלה היה מעורב הפרעות פסיכיאטריות. באופן ספציפי, נגזר אסטרוציט המטבוליט kynurenic חומצה (KYNA), אנטגוניסט-שתי N-מתיל-d-אספרטט (NMDA) ואת רצפטורים אצטילכולין nicotinic (α7nACh) α7, היה מעורב תהליכים קוגניטיביים על בריאות ומחלה. כפי KYNA רמות גבוהות במוחם של חולי סכיזופרניה, תקלה glutamatergic, קולטנים שימוש הוא האמין להיות סיבתי קשורה בתפקוד הקוגניטיבי, תחום הליבה של פסיכופתולוגיה המחלה. KYNA עשוי לשחק תפקיד משמעותי pathophysiologically אנשים עם סכיזופרניה. ניתן להעלות את רמת KYNA אנדוגני במוח מכרסמים על ידי טיפול בבעלי-חיים עם kynurenine bioprecursor ישירה, פרה מחקרים בחולדות הראו כי הגבהים חריפה ב- KYNA עשוי להשפיע את תהליכי הלמידה והזיכרון שלהם. בפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה זו ניסיוני בפירוט, והוא משלב א) ניתוח הביוכימי של רמות kynurenine בדם והמוח היווצרות KYNA (באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים), בדיקת b) התנהגותית כדי לחקור זיכרון הקשרי תלויי-בהיפוקמפוס (פרדיגמה הימנעות פסיבי), ו- c) הערכה על התנהגות שינה [telemetric הקלטות שילוב העוויתיים (EEG) electromyogram (EMG) אותות] אצל חולדות. יחדיו, יחסים בין גבוהות KYNA, שינה, קוגניציה היא למדה, פרוטוקול זה מתאר בפירוט גישה נסיונית להבנת תפקוד תוצאות של העלאת kynurenine ו KYNA היווצרות ויוו בחולדות. התוצאות המתקבלות באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה יהיה לבחון את ההשערה כי KP ואת KYNA לשרת תפקידי מרכזי הכוח ויסות שינה וקוגניציה במצבי בריאות ומחלה.
מבוא
KP אחראי משפילים כמעט 95% של טריפטופן חומצת אמינו חיונית1. במוח של יונקים, kynurenine תוך האסטרוציטים עובר מטבוליזם בתוך המולקולה קטנה neuroactive KYNA בעיקר על ידי האנזים kynurenine aminotransferase (קאט) II2. KYNA פועל כמו אנטגוניסט-קולטני NMDA, α7nACh המוח2,3,4, ואני גם מטרות איתות קולטנים כולל הקולטן פחמימן aryl (אמפר לשעה) ו- G-החלבון בשילוב קולטן 35 (GPR35)5 ,6. בחיות ניסוי, הגבהים במוח KYNA הוכחו לפגום את הביצועים הקוגניטיביים שלהם במערך של מבחני התנהגות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
את כל מנגנוני ניסיוני אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מרילנד ועל שימוש הוועדה ועקבתי המדריך מכוני הבריאות הלאומיים של על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה.
הערה: חולדות Wistar זכר בוגר (250 – 350 גרם) שימשו כל הניסויים. גדודים נפרדים של חיות שימשו עבור ניתוח הביוכימי, ניסויים התנהגותיים שינה הקלטות. החיות שוכנו במתקן טמפרטורה מבוקרת במכון המחקר הפסיכיאטרי מרילנד. הן הוחזקו על מחזור בהירה-כהה h 12/12, עם אורות בזמן zeitgeber (ZT) 0 ל האורות ZT 12. החיות קיבלו גישה ad libitum מזון ומים במהלך הניסויים. המתקן היה מוכר באופן מלא על ידי האגודה האמריקאית עבור ההסמכה של מעבדה חיה טיפול.
1. בקרום הבטן Kynureni....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאמת את השימוש זריקה kynurenine בקרום הבטן כשיטה להעלות את המוח KYNA, בוצע ניתוח HPLC של רקמות. רגיל עקומות (איור 1) נבנו באמצעות התוכנה המשויכים ואת המותר עבור כימות של דגימות רקמה. נציג chromatograms עבור kynurenine ו- KYNA מוצגים באיור2. Kynurenine נצפתה בזמן השמירה של 6 דקות, והיה KYNA זמן השמירה של 11 דקות. כדי לבחון את הדינמיקה KP, 100 מ"ג/ק"ג של kynurenine היה מנוהל בפרוטוקול זה, רקמת נאסף מייד לאחר ההזרקה או 2 או 4 h .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבור הערכה אמינה של KYNA במוח לאחר המינהל kynurenine היקפיים, חשוב לשלב ולפרש ניסויים הביוכימי ופונקציונליים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר למשתמשים חדשים ליצור שיטות יעילות למדידת פלזמה kynurenine של המוח KYNA של חולדות. המדד של kynurenine ב הפלזמה אישרה הזרקה מדויקת ואת המידה של מטבוליט KYNA מאשרת את סינתזת דה נובו במוח. ישנם מספר יתרונות המתואר fluorometric HPLC השיטה, המותאמים מ Shibata18, derivatize KYNA בנוכחות Zn2 +, כולל את היכולת לזהות בדיוק כמויות KYNA אנדוגני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 NS102209) ותרומה של אמון פורבס קלייר אי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חולדות וויסטאר מעבדות | נהר צ'ארלס | זכר בוגר, 250-350 גרם | |
| L-קינורנין סולפט | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 עמודה (4 מ"מ x 150 מ"מ) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| ברגי חומרי הרכבה | פלסטיק אחד | 00-96 X 1/16 | |
| תפרים בלתי נספגים | MedRep Express | 699B | CP רפואי מונומיד שחור תפרי ניילון, 4-0, P-3, 18 אינץ', קופסה של 12 |
| תפרים נספגים | Ethicon | J310H | 4-0 מצופה Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| צמנט שיניים | Stoelting Co. | 51458 | |
| מקדחה | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 מ"מ |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | ><חזק>תגובות |
| <חזק>ברית HPLC מערכת | |||
| E2695 מודול הפרדה | ווטרס | 176269503 | |
| 2475 גלאי פלואורסצנטי | ווטרס | ||
| מנהל ריאגנטים לאחר הטור | ווטרס | 725000556 | |
| מחשב לנובו | ווטרס | 668000249 | |
| העצמת תוכנה | ווטרס | 176706100 | |
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| ><חזקה>פסיבית תיבת הימנעות לחולדה | |||
| תא הנחתת קול MDF גבוה במיוחד | MedAssociates | ENV-018MD | פנים: 22 אינץ' (W) x 22 אינץ' (H) x 16 אינץ' (D) |
| תא תיבת מעבורת מודולטור ערוץ מרכזי | MedAssociates | ENV-010MC | |
| רצפת רשת נירוסטה לחולדה | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| דלת גיליוטינה אוטומטית | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| ניתוק מהיר רתמת רצפת רשת מעבורת לחולדה | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| אור גירוי, עדשה לבנה בגודל 1 אינץ', מותקנת על פאנל מודולרי | מודול | MedAssociates ENV-221M | |
| Sonalert עם בקרת עוצמת קול לתא חולדות | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 כניסה/16 פלט חבילת | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 ערוצים בקרת IR עבור תיבות מעבורת | MedAssociates | ENV-253C | |
| מקור אינפרא אדום ורצועות מערך דקטקטור | MedAssociates | ENV-256 | |
| ארון ממשק שולחני, 120 וולט 60 הרץ | MedAssociates | SG-6080C | |
| מודול גירוי מרתיע זרם קבוע בטווח כפול | MedAssociates | ENV-410B | |
| מודול רצפת רשת מצב מוצק | MedAssociates | ENV-412 | |
| מודול בקרת זעזועים כפול A/B | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3 פינים הארכת מיני-מולקס | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10 אינץ' כבל פלט זעזועים, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| כבל בקרת זעזועים של מעבורת 15 ', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| ארון שולחן קטן וספק כוח, 120 וולט 60 הרץ | MedAssociates | SG-6080D | |
| חבילת ממשק PCI | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| חבילת שירות הימנעות מתיבת הסעות | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| <חזק>שם< | strong>Company | Catalog Number | >Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah Software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition Interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| מחשב Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 סיביות | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| צג מחשב Dell בגודל 19 אינץ' | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| מקלטים לכלובי פלסטיק, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| נתב VPN של Cisco RV130 | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| מטריקס 2.0 | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI) | 271-0119-001 | |
| מתג רשת | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI) | SG200-08P | |
| תוכנת Neuroscore | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI) | 271-0171-CFG | |
| משדר שני ערוצי ביו-פוטנציאל, דגם TL11M2-F40-EET | מדעי הנתונים הבינלאומי (DSI) | 270-0134-001 |
מקורות
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
