מאמר שיטה

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

DOI:

10.3791/58139

⸱

28 ביולי 2018

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היבטים רבים של הארגון ייתכן הבסיסית של תאים נשלטים על ידי מערכות סוג התגובה דיפוזיה. במבחנה הכינון של מערכות כאלה מאפשר לימודים מפורטת מנגנוני הבסיסית שלהם, אשר לא יהיה ריאלי ויוו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול את במבחנה בנייתו מחדש של המערכת MinCDE של Escherichia coli, אשר עמדות מחצה חלוקת התא באמצע תא. וזמינותו נועד לספק רק את הרכיבים הנחוצים לביצוע ארגון-עצמי, דהיינו קרום, את שני החלבונים המוח ואת שלי, ושל אנרגיה בצורת ATP. אנחנו ולכן לפברק תא התגובה פתוח על coverslip, שבו נוצרת שכבה ליפידית הנתמכות. עיצוב החדר פתוח מאפשר הכנת ליפידית האופטימלית ומניפולציה מבוקרת של התוכן בצובר. שני החלבונים, המוח שלי, וכן ATP, יתווספו לאחר מכן לתוך האחסון בצובר מעל הקרום. הדמיה אפשרי על ידי רבים microscopies אופטי, עיצוב תומך קונאפוקלית, שדה רחב ומיקרוסקופ TIRF כאחד. וריאציה של הפרוטוקול, ליפידית נוצר על תמיכה בדוגמת, בצורת תא מזערים PDMS, במקום זכוכית. הנמכת הפתרון בתפזורת על החישוק של תאים אלה יקיף את התגובה בתא קטן יותר ומספק גבולות המאפשרים מחקה התנהגות ויוו מתנדנדות. יחדיו, נתאר פרוטוקולים כדי לשקם את המערכת MinCDE עם וללא כליאה המרחבי, ומאפשר לחוקרים דווקא לשלוט בכל ההיבטים המשפיעים על היווצרות תבנית, כגון ריכוז טווחים או גורמים אחרים או חלבונים, ולהגדיל באופן שיטתי מערכת המורכבות הגדרת נסיוני יחסית פשוטה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייתכן דפוסי חיוניים בטבע, ויסות משימות מורכבות ברמה multicellular וסלולריות, מן מורפוגנזה מוסדר חלוקת התא1,2. התגובה דיפוזיה מערכות יש תפקיד חשוב בהקמת הדפוסים הללו, אבל הם עדיין לא מובנים היטב. דוגמה ומופת מערכת התגובה דיפוזיה לבין מערכת ביולוגית מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה הוא Escherichia coli MinCDE מערכת3,4,5,6,7. מערכת MinCDE מתנדנד מהקוטב תא לקוטב תא ב e. coli כדי לקבוע באמצע של התא כאתר חטיבת בעתיד. מערכת זו מבוססת על המוח ATPase, ATPase הפעלת חלבון שלי, ושל הקרום כמו מטריקס המרחבי תגובה8. MinC אינה חלק ממנגנון היווצרות תבנית, אלא הוא סוכן תפקודית בפועל: מעכב של החלבון העיקרי divisome FtsZ5,6. MinC נקשר לי בראש וזה ולכן עוקב אחר תנודות, וכתוצאה מכך הדרגתי ריכוז חלבון זמן ממוצע מקסימלי בקטבים תא, מינימלי באמצע התא, המאפשר רק FtsZ פולימריזציה midcell9,10 . מערכת MinCDE היא חלק ממשפחת גדול יותר של ווקר A ATPases כי הם המפתח לארגון ייתכן חיידקים2, מיצוב, הובלת חלבון מתחמי11 ו פלסמידים12 ולשם וויסות תא חטיבת13 ו כרומוזום סגרגציה14. לפיכך, מערכת התגובה דיפוזיה MinCDE מייצג מערכת ריאקציה ארכיטיפי-דיפוזיה אלא גם משכה תשומת לב בגלל להתאמתו של הארגון ייתכן בחיידקים.

מחקרים פונקציונלי מפורט של ה MinCDE מערכת ויוו הם מסובכים, מניפולציה של חלבונים ו ג'ין מחיקה התוצאה בדרך כלל פגמים חלוקת התא. יתר על כן, שינוי בהרכב הממברנה או את המאפיינים של ה ציטוזול ויוו הוא מאוד מאתגר15,16. שינויים במערכת והשפעה על גורמים שקשה לפרש בסביבה מורכבת של התא, אפילו יותר אם זה מופר ב פעולה הכרחית כמו חלוקת התא. אנחנו ואחרים ולכן פנו גישה למפת במבחנה , צמצום המערכת רכיבי הליבה שלה: המוח, שלי, ATP כמקור אנרגיה, ליפידית נתמך כמו התגובה מטריקס6,17, 18. גישה מלמטה למעלה זו מאפשרת לחקור את המנגנון של ארגון עצמי בפירוט ללא המורכבות של תא חי. הטופס חלבונים נסיעה משטח גלים6 וסוגים אחרים של דפוסי17,,19 , בתנאים אלה, אמנם עם אורך גל זה בדרך כלל בערך גודל גדול יותר ויוו. השימוש של חדר פתוח מאפשר בקרה מדויקת על כל האספקטים המשפיעים על היווצרות תבנית: ריכוז חלבון6, מאפייני חלבון20, ממברנה קומפוזיציה10, מאגר הרכב וריכוז ATP 6, וכן תוספת של גורמים אחרים כמו הצפיפות סוכנים21 ו- חלבונים אחרים divisome22. לשם השוואה, הכינון במבחנה של מערכת MinCDE19,18,תאים זרימה23 יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של17,זרימה23, חלבון הגבלת תנאים19, ממברנה קומפוזיציה19 ו 3D מלא כליאה18 על דפוסי חלבון, אבל רינדור פקד המדויק של ריכוז חלבון/רכיב, רציפים רכיב תוספת הרבה יותר מסובך.

באמצעות החדר פתוח הזה, אנחנו גם בדוגמת התמיכה של bilayers השומנים מישורי שבו אחד יכול לחקור איך גיאומטרי גבולות ההשפעה דפוס היווצרות21, תופעה בעלת לאחרונה גם היה ובדוקים ויוו באמצעות חיידקים יצוק לתוך מזערים7. אנחנו גם מועסקים זה וזמינותו לחקור כיצד מוגדרים מוטציות בגן שלי תבנית משפיעים על היווצרות מערכת20. יתר על כן, כבר מועסקים באותו פורמט בסיסי assay לחקור איך היווצרות דפוס יכול להיות נשלט על ידי אור, ידביקו פפטיד מכרה של תפור azobenzene וזמינותו, והדמיה עם מיקרוסקופ TIRF24.

מצאנו את זה, כדי לשכפל את התבנית גבירתי היווצרות נצפתה ויוו בבידוד מערכת, במבחנה היה מפתח. באמצעות מוט בצורת microcompartments, עם מידות מותאמות אורך הגל גדולה יותר של גבירתי במבחנה (10 x 30 מיקרומטר), לבושות עם שכבה ליפידית הנתמכות מותר את בנייתו מחדש של תנודות הקוטב-כדי-מוט גבירתי ויצירת חלבונים מעבר צבע 10,25. ב- assay הזה, bilayers השומנים נתמך מופקדים על מצע PDMS בדוגמת המכיל מספר מאה העתקים של microcompartments מוט בצורת שנותרו פתוחים על גבי. על ידי זה, התגובה ניתן להגדיר בחדר פתוח ולאחר מכן המאגר הוא הוריד את שפת microcompartments, ובכך מגבילה את התגובה לאמצעי אחסון קטן. למרות תאים אלה יש ממשק האוויר-מאגר בצד אחד, ולכן אינם מייצגים ריתוק 3D מלא על ידי קרום, הדינמיקה חלבון חיקה ויוו תנודות10,25. בהשוואה כליאה 3D מלא, אשר מראה דומה מאוד תוצאות18, וזמינותו מזערים פתוחה היא יחסית פשוטה וקלה כדי להתמודד עם, יכול להתבצע גם על ידי מעבדות כי אינם מצוידים ציוד מיקרופלואידיקה מיוחדים, מתקני החדר נקי.

כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני לשחזר MinCDE דפוס היווצרות על תמיכה השומנים bilayers במבחנה באמצעות חדר פתוח המאפשר שליטה על כל רכיבי וגישה נוחה על ידי מיקרוסקופ אופטי ו, עם קטין שינויים, גם היא יכולת הסתגלות עבור השטח-בדיקה טכניקות26. ליד bilayers מישורי השומנים הנתמכים, אנו גם מראים איך כליאה חלבון יכול להיות מושגת באמצעות פשוטה השומנים נתמך בדוגמת bilayers על מוט בצורת מזערים PDMS. מבחני האלה, למרות ממוטב עבור מערכת MinCDE, ניתן גם להעביר למערכות אחרות חלבון המקיימים אינטראקציה באופן דומה עם הקרום, כגון FtsZ27 או של אקטין מינימלית קורטקס28.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור החלבון

  1. ביטוי חלבון
    1. להפוך את החיידק BL21 pLysS (DE3) עם פלסמיד המתאימים לביטוי של המוח6, EGFP-נפש29, mRuby3-המוח24, מכרה6 או MinC30. מפות פלסמיד, נא עיין מידע משלים.
    2. לחסן תרבות לילה במדיום ליברות עם שמושבה בודדת באמצעות אנטיביוטיקה המתאימים (אמפיצילין, למשל100 של µg/mL או µg 50-מ/ל Kanamycin), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14-16 h תוך טלטול.
    3. לחסן 500 מ"ל של מדיום טרה-בתים המכיל אנטיביוטיקה בהתאמה עם התרבות לילה (דילול 1:200), דגירה תרבות ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-180 סל ד.
    4. זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת 0.5 מ מ IPTG כשאחוז התרבות של צפיפות אופטית על 600 nm של 0.5-0.7. במקרה של EGFP-נפש או mRuby3-נפש, להעביר תאים אינקובטור עם 16 ° C, לגדל תאים עבור h 14-16, ובמקרה מינק, המוח או אצלי, לגדל תאים עבור 3-4 h ב 37 ° C לאחר אינדוקציה.
      הערה: אינדוקציה של מינק, המוח או שלי הביטוי הוא רעיל לתאים, בתור ביטוי בתוצאות הליקויים חלוקת התא; לפיכך, חשוב כי זמן הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס נשמרת מתחת 4 שעות. אם יש צורך יותר חלבון, להגדיל את כמות תרבות, אבל לא זמן הדגירה.
    5. לאחר זמן הדגירה בהתאמה הקציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 g x 10 דקות ולאחסן בגדר תא ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף להשתמש.
  2. חלבון טיהור
    הערה: חלבונים אפשר לטהר תוך שימוש בעמודות Ni-נ prepacked במערכת טיהור חלבון אוטומטית או באמצעות חרוזים Ni-נ לטיהור ספסל זרימת הכבידה.
    1. טיהור עם prepacked Ni-נ עמודות על חלבון אוטומטי טיהור מערכות לשימוש מאגר A1 (50 מ מ סודיום פוספט pH 8.0, 500 מ מ NaCl, imidazole 10 מ מ), מאגר B1 (50 מ מ סודיום פוספט pH 8.0, 500 מ מ NaCl, imidazole 20 מ מ), מאגר C1 (סודיום 50 מ מ פוספט pH 8.0, 500 מ מ NaCl, imidazole 250 מ מ). לטיהור ספסל זרימת הכבידה באמצעות Ni-נ חרוזים להשתמש מאגר A2 (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 300 מ"מ NaCl, imidazole 10 מ מ), מאגר B2 (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 300 מ"מ NaCl, imidazole 20 מ מ), מאגר C2 (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 300 מ"מ NaCl, imidazole 250 מ מ). תוספת כל מאגרי ß 10 מ מ- mercaptoethanol או 0.4 מ מ TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) כסוכן צמצום נכון לפני השימוש.
    2. התאים resuspend ב- 20-30 מ של מאגר A1 או A2 שיושלם עם EDTA ללא מעכב פרוטאז, 100 µg/mL ליזוזים, ~ 250 U/mL DNase 0.2 מ מ מ ג2 +- ADP (Mg2 +- ADP במקרה של טיהור נפש או EGFP-נפש בלבד, מ- 100 מ מ ADP במלאי ב- 100 מ מ MgCl 2 עם pH להתאים ל- 7.5).
    3. Lyse תאים באמצעות sonicator עצה (30% משרעת, 2.5 דקות, הדופק s 30, 30 s.) תוך שמירה על המבחנה המכילות את התאים באמבט קרח.
    4. להסיר שאריות תאים על-ידי צריך שתוציאו את התא lysate עבור 45 min ב 25,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    5. דגירה של תגובת שיקוע על Ni-נ עמודה או חרוזים Ni-נ. ת.
      1. עבור עמודות Ni-נ prepacked, לטעון את הדגימה אל העמודה באמצעות המשאבה מדגם של מערכת טיהור חלבון אוטומטית.
      2. לטיהור ספסל-העליון, דגירה הדגימה עם חרוזים Ni-נ בשפופרת תגובה 50 מ במטרף מסתובב ב 4 ° C עבור 1 h. עבור הצעדים הבאים, להעביר את החרוזים Ni-נ לתוך עמודה ריקה באמצעות פיפטה 25 מ.
    6. לשטוף עם פחות 5 כרכים עמודה של מאגר A1 או A2.
    7. לשטוף עם פחות 5 כרכים עמודה של מאגר B1 או B2.
    8. Elute חלבון עם מאגר C1 או C2.
    9. להעריך חלבון הטהרות דרך עמוד מרחביות.
    10. אופציונלי: עוד יותר לטהר חלבונים על-ידי החלת סינון ג'ל עמודה equilibrated מאגר אחסון (50 מ מ HEPES/קו pH 7.2, 150 מ מ אשלגן כלורי, 10% גליצרול, 0.1 מ מ EDTA, 0.4 מ מ. TCEP, (מ מ 0.2 מ ג2 +- ADP במקרה של המוח)).
      הערה: מומלץ ג'ל סינון המוח להסרת חלבון צבורים שבר.
    11. אם אין ג'ל-סינון הוא מועסק, להחליף Ni-נ • תנאי מאגר למאגר אחסון (50 מ מ HEPES/קו pH 7.2, 150 מ מ אשלגן כלורי, 10% גליצרול, 0.1 מ מ EDTA, 0.4 מ מ TCEP, (0.2 מ מ Mg-ADP במקרה של המוח)) באמצעות כוח המשיכה לזרום לעמודה desalting (ראה טבלה של חומרים).
    12. הלם-להקפיא חלבונים ב- aliquots חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.
    13. למדוד ריכוז מניות חלבון באמצעות שיטת ברדפורד, לקבוע את פעילות החלבון עם וזמינותו ATPase20.
      הערה: לא להעריך את ריכוז חלבון באמצעות הקליטה ב 280 ננומטר. הנוכחות של נוקלאוטיד במהלך טיהור הנפש וחוסר tryptophans בשלי לעוות מידות ריכוז280 . מבחני השימוש ברדפורד או BCA למדידת ריכוז חלבון במקום.
  3. חלבון תיוג
    הערה: היתוך גרעיני של חלבון פלואורסצנטי כדי החלבון קטן שלי גורם מייג'ור שינויים שלה מאפיינים המפזרת ותפקוד; לפיכך, תיוג כימי של החלבון (ציסטאין במיקום 51) נגמרה המועדפת פיוז'ן חלבונים פלורסנט
    1. להמיס 0.125 מ"ג של maleimide-צבע המספר המשלים ב- 5-10 µL של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולהוסיף תחת טלטול 0.5 מ ל שלי aliquot מאגר אחסון ב- pH 7.2, מוכן כמפורט לעיל.
    2. תקופת דגירה של 2 h ללון ב 4 ° C או 2 h ב- RT תחת טלטולים או ערבוב עדין.
    3. צבע נפרד, חלבון באמצעות זרם הכבידה desalting עמודה equilibrated עם מאגר אחסון (50 מ מ HEPES/קו pH 7.2, 150 מ מ אשלגן כלורי, 10% גליצרול, 0.1 מ מ EDTA, 0.4 מ מ TCEP).
    4. להסרת נוספת בכל צבע כעיגולים בצבע, dialyze החלבון נגד עודף של מאגר אחסון.
    5. ודא labelling מוצלחת על ידי מדידת להכחדת בקצב המרבי עבור לצבוע בהתאמה ולחשב את היעילות תיוג המשוער. נא עיין הוראות היצרן צבע עבור פרוטוקול מפורט על הערכת מידת תיוג. לניתוח עם מרחביות-דף ולקביעת הכולל מסה מאת ספקטרומטריית למידע נוסף שימושי על מדגם הומוגניות והצלחה תיוג.

2. הכנה Unilamellar קטן שלפוחית (רכב שטח)

  1. דור של שלפוחית multilamellar
    1. לחשב את כמות lipid(s) ב כלורופורם על התערובת הרצויה ועל הסופי רכב שטח אחסון. הריכוז צריך להיות 4 מ"ג/מ"ל של ליפידים במאגר Min (25 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ. אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2). Assay מין רגיל מומלץ תערובת של DOPC:DOPG 7:3 (מול אחוז). בעת שימוש ליפידים קוטביים e. coli לחלץ, להשתמש סאט גלובל מאגר (25 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ אשלגן כלורי) עבור כל שלבי ההכנה.
      הערה: לא מומלץ למשתמשים בפעם הראשונה להשתמש תמצית ליפידים קוטביים e. coli הדור של SLBs הומוגנית עם תערובת זו היא הרבה יותר מאתגר.
    2. באמצעות פיפטה תזוזה חיובית עם טיפים זכוכית, מערבבים ליפידים ב כלורופורם, בקבוקון זכוכית 1.5 mL.
      1. יבש ליפידים תחת זרם חנקן קלה בזמן לאט הופכים את הצנצנת. המקום ליפידים תחת חנקן זרם חזק 10 עד 20 דקות. מניחים את הצנצנת המכילה את הסרט השומנים מיובשים desiccator ואקום ולהחיל ואקום במשך לפחות שעה.
    3. נתרענן ליפידים במאגר דקות מאת vortexing בטמפרטורת החדר עד שהתערובת תהיה אטומה homogeneously.
      הערה: עבור הדור של שלפוחית unilamellar קטן מן שלפוחית multilamellar, ליפידים יכול גם להיות extruded כמתואר ב- 2.2. . או sonicated כמתואר ב- 2.3. באופן כללי, שחול מניב התפלגות גודל לצר יותר אשר יכול לעזור עם היווצרות ליפיד הנתמכים bilayers.
  2. רכב שטח הכנה על ידי ההבלטה
    1. לשבור את השומנים אגרגטים מבנים multilamellar, solubilize עוד יותר שומנים על ידי הקפאת מפשיר 7 עד 10 מחזורים.
      1. להכין גביע עם מים ב 70° C מעלות 99 על פלטה חמה מיכל עם חנקן נוזלי.
      2. להחזיק את הבקבוקון של חנקן נוזלי עם פינצטה גדולה עד החנקן מפסיק רותח. ואז להעביר את המבחנה מים חמים עד הפתרון מופשר הוא לחלוטין. חזור על שלבים אלה עד התערובת השומנים מופיע ברור לעין, בהתאם התערובת.
    2. להרכיב extruder השומנים ולשטוף מראש את המערכת עם מאגר Min. הבלטת התערובת השומנים בין 35 ו 41 פעמים דרך קרום של 50 גודל הנקבוביות ננומטר. הקפד לסיים על מספר אי-זוגי של עובר כדי להימנע אגרגטים כי מעולם לא חצה את הקרום.
  3. רכב שטח הכנה על ידי sonication
    1. כדאי להמיס שומנים במאגר, לשים את הצנצנת זכוכית המכיל את הפתרון בתוך גוש חום מוגדר 37 ° C ו מערבולת כל 20 דקות במשך דקה אחת. דגירה בסך של 1 h.
    2. לטבול את תחתית המבחנה באמבט sonicator (בעבודה זו 1.91 L, 80 W) על-ידי הצמדת הבקבוקון אל דוכן קלאמפ בשיאה נדרש.
    3. להגדיר את גובה המים באמבטיה sonicator כך הפתרון המקיף את המבחנה ביסודיות סוער על ידי הפולסים, sonicate את התערובת השומנים למשך 20 דקות. בדוק sonication מוצלחת על-ידי הערכת הבהירות של ליפידים.
  4. רכבי השטח יכולים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע או קפוא ב-20 ° C ב- aliquots קטן (µL ~ 20) ומאוחסנים למשך מספר שבועות. הפשרת בקבוקונים או צינורות בטמפרטורת החדר, sonicate שוב כמתואר תחת 2.2.3 או 5.3 עד הפתרון ברור לפני באמצעות רכבי שטח עבור הכנת נתמך השומנים bilayers (SLBs). אנא שימו לב: התפלגות גודל הצרה של רכבי השטח מתקבל על ידי ההבלטה אובד אחרי ההקפאה ובעקבות מפשיר ו sonication.

3. ניקוי coverslips זכוכית דקה

הערה: hydrophilization של coverslips זכוכית דקה וניקוי הוא פקטור חשוב עבור השומנים נתמך הומוגנית, נוזלים bilayers. Coverslips זכוכית דקה ניתן לנקות באמצעות פתרון פיראניה, זני יחס של חומצה גופרתית 7:2 50% חמצן (3.1), או עם פלזמה של חמצן בפלזמה מנקה (3.2). שתי השיטות להניב תוצאות דומות.

  1. פיראניה ניקוי של coverslips
    1. להחיל פתרון פיראניה
      1. להפיץ coverslips זכוכית דקה על צלחת פטרי זכוכית הפוכה או משטח אחר אינרטי. פיפטה מזכוכית, להוסיף 7 טיפות חומצה גופרתית מרוכזת (98%) למרכז של כל coverslip.
        התראה: חומצה גופרתית היא חריפה חומצי מאכל. עבודה בתוך ארון fume עם ציוד מגן מתאים בלבד.
      2. להוסיף 2 טיפות של 50% חמצן עד לאמצע טיפות חומצה.
        התראה: מימן על-חמצני הוא שמשחית העיניים והעור.
      3. מכסה את התגובה, תקופת דגירה של פחות 45 דקות.
        הערה: זמן ההמתנה המרבי כאן אינו קריטי לתוצאות הניסוי ולא ניתן להרחיב עד מספר ימים.
    2. שטיפת פיראניה לנקות coverslips.
      1. לאסוף את coverslips בנפרד באמצעות מלקחיים ולשטוף חומצה עם מים הנדסה גנטית. מקום coverslips שטף את מחזיקי טפלון או התקן דומה תחבורה.
      2. לשטוף את כל coverslip בהרחבה עם הנדסה גנטית מים ויבשה השטח עם גז דחוס (חנקן, אוויר רק אם נטול שמן). סמן את הצד נקי של coverslip עם טוש שלא יורד.
  2. פלזמה ניקוי של coverslips
    1. לשטוף coverslips עם אתנול עודף ואחר כך עם עודף מים הנדסה גנטית. יבש coverslips עם גז דחוס. להרכיב קאמרית כמתואר ב- 4.
    2. לאחר ההרכבה קאמרית כמתואר ב- 4 לקחת את coverslips עם הקאמרית המצורפת, למקם בפלסמה מנקה עם חמצן וגם תהליך דלק. לנקות coverslips עם פלזמה (30% את הכוח הזה עבודה, 0.3 לחץ חמצן mbar עבור 1 דקות שימשה). לעשות את הניקוי לפני היווצרות סאט גלובל כמתואר ב- 5, כמו האפקט hydrophilizing של פלזמה ניקיון מתנדף לאורך זמן.
      הערה: תזמון, כוח של פלסמה ניקוי צריך להיות ממוטב באמצעות ממברנות fluorescently שכותרתו, כמו גם קצת או פלזמה מופרז ניקוי יכול גם להוביל ממברנות משותק או ריריות עם חורים.

4. לשכת הרכבה

  1. עם מספריים חדות, לחתוך ולמחוק את המכסה והחלק חרוט של צינור תגובה 0.5 mL. להחיל UV-דבק על השפה העליונה של הצינור ולהפיץ באופן שווה באמצעות טיפ פיפטה.
  2. הדבק צינור הפוך coverslip בעבר נקי. במקרה של פיראנה ניקוי הקפד להדביק את זה. אל הצד נקי של הזכוכית. לרפא UV-הדבק על-ידי הצבת צ'יימברס מרובים מתחת המנורה nm 360 או LED 5-15 דקות.

5. תמיכה היווצרות ליפיד Bilayer (סאט גלובל)

  1. מראש בחום חום לחסום עד 37 ° C, דגירה 2 mL צינורות התגובה עם מאגר Min או סאט גלובל, צינור 1 לכל תא.
  2. המכה חנקן לתוך חדרי התאספו, נרפא כדי להסיר את כל האבק או חלקיקים אחרים, כי ייתכן התיישבו במהלך UV לריפוי, הרכבה. פלזמה נקי כפי שמתואר 3.2 אם לא ניקית את coverslips פיראניה פתרון (3.1). במקום צ'יימברס על גוש חום.
  3. לדלל עם aliquot 20 µL של ליפידים ברורה (ב 4 מ"ג/מ"ל) עם µL 130 דקות מאגר או מאגר סאט גלובל במקרה של e. coli תמצית ליפידים קוטביים, מניב ריכוז העבודה של 0.53 מ"ג/מ"ל. למקרה קפאו ליפידים, sonicate לראשונה על ידי החזקת את הצינור לתוך sonicator אמבטיה לפני הוספת המאגר ולאחר מכן sonicate שוב עם מאגר.
  4. להוסיף µL 75 של השומנים תערובת כל תא, יפעילו טיימר עד 3 דקות (לתערובות DOPC/DOPG; דגירה ארוך עשוי להיות נחוץ לתערובות אחרות השומנים). במקרה של e. coli תמצית ליפידים קוטביים, פיפטה CaCl2 ממניה 100 מ מ לתוך החדר כדי ריכוז הסופי של 3 מ מ. במהלך זמן הדגירה, השלפוחיות המוגלתיות פרץ על משטח זכוכית הידרופיליות, נתיך. לגבש סאט גלובל קוהרנטי.
  5. לאחר 60 שניות, להוסיף µL 150 דקות מאגר כל תא.
  6. שטיפת התאים: לאחר עוד 120 שניות (סה כ 3 דקות) לשטוף כל תא על-ידי הוספת µL 200 דקות או סאט גלובל מאגר, בזהירות pipetting למעלה, למטה מספר פעמים, הסרת והוספת עוד µL 200.
    1. לאחר בכל תא יש לשטוף פעם, להמשיך לשטוף ביסודיות לחדר הראשון עד mL 2 המאגר משמשות. כביסה של SLBs צריך קצת ניסיון מושלם את היקף התנועות בבית הבליעה ולמצוא את עוצמת הכביסה הנכונה.
      הערה: אף פעם לא להסיר כל נוזל מן החדר כדי למנוע התייבשות סאט גלובל.
      הערה: על הכביסה, מאפייני הממברנה משתנה בהתאם גורמים נוספים רבים: סוג של ליפידים וריכוזי היחסי שלהם ב השומנים תערובות, שיטת הכנה עבור רכבי השטח, פני השטח טיפול וניקוי מוקדמת של תמיכה.

6. ארגון עצמי Assay

  1. להתאים את מאגר אחסון בבית הבליעה למאגר Min µL 200 מינוס כמות החלבון והפתרון ATP, ולאחר מכן להוסיף את דעתו, שכותרתו המוח, שלי, ובמידת הצורך, מינק. מערבבים בעדינות מרכיבים על-ידי pipetting. דוגמה ריכוזים הם 1 מיקרומטר המוח (מסטול עם 30% EGFP-נפש), 1 מיקרומטר שלי (מסטול עם 10% כימי הנקרא שלי) ואני מיקרומטר 0.05 מינק, אך תבניות טופס על טווח של ריכוזים6,10,20,30 .
  2. להוסיף 2.5 מ מ ATP (מתוך 100 מ מ ATP מניות של 100 מ מ MgCl2, pH 7.5) כדי להתחיל את ארגון עצמי של גבירתי.
    הערה: הסדר של תוספת רכיב (המוח, שלי ושל ATP) יכולים להיות מגוונים, לא תשפיע על התוצאה הסופית דפוס4.
  3. להתבונן גבירתי לביצוע ארגון-עצמי על המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים). ארגון עצמי גבירתי ניתן גם לצפות באמצעות מיקרוסקופ TIRF. הדמיה eGFP-נפש, השתמש 488 ננומטר לייזר ארגון או לייזר דיודה דומה (למשל, 490 nm). עבור הדמיה mRuby3-נפש, עדיף להעסיק 561 ננומטר דיודת לייזר.
    הערה: להימנע רמות גבוהות של עירור לזמנים ארוכים כמו אנחנו ואחרים17 הבחינו phototoxicity במערכת גבירתי, המוביל אל חלבון בלתי הפיך פלמור על הקרום.

7. PDMS מזערים

הערה: PDMS (polydimethylsiloxane) הוא פולימר יכול לשמש לייצור מזערים והתקנים microfluidic. רקיק סיליקון בדוגמת משמש תבנית ליציקת המבנים PDMS. המבנים PDMS לאחר מכן לשמש תמיכה עבור היווצרות סאט גלובל, וזמינותו ההתקנה.

  1. גם לייצר סיליקון וופל עם microcompartments בעצמך באמצעות פוטוליתוגרפיה (ראה Zieske ו Schwille עבור פרוטוקול מפורט31 או משימוש ואח . עבור פרוטוקול וידאו בגודל32) או להזמין שלך וופל סיליקון הרצוי מתוך בית יציקה . את דפוס הנגדי של הסעיפים בבקשה לראות מידע משלים.
  2. ייצור PDMS מזערים מ עם תבנית סיליקון.
    1. השתמש כוס פלסטיק לשקול 10 גרם של בסיס PDMS ו- 1g של PDMS crosslinker. או להשתמש במכשיר ערבוב כדי לערבב, דגה את התערובת PDMS או ידנית לערבב את PDMS ואז דגה תחת ואקום.
    2. השתמש טיפ פיפטה להטיל כמות קטנה של PDMS ישירות על גבי המבנה על פרוסת סיליקון סיליקון.
      הערה: יש להיזהר לא לשרוט את פרוסות הסיליקון.
    3. מיד במקום coverslip #1 אל תפיל את PDMS, את הקצה העליון של טיפ פיפטה נקי ללחוץ בעדינות את coverslip על גבי פרוסת סיליקון סיליקון. צריך להפיץ PDMS דק בין את coverslip את פרוסות הסיליקון.
    4. למקם את וופל עם coverslips לתנור, לרפא את PDMS למשך 3-4 שעות או למשך הלילה ב 75 º C. הסר כשהפחד מהתנור ולתת לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. עם סכין גילוח, הסר בזהירות את coverslip עם PDMS המצורפת סי וופל.
      הערה: כדי למנוע את פרוסות הסיליקון מקבל מלוכלכים או פגומים, תמיד לכסות את מזערים ועם PDMS של coverslip. עם זאת, הגילאים PDMS, וכתוצאה מכך סדקים מזערים, ולכן אין להשתמש במבנים PDMS שגילן עולה על שבועיים עד שלושה שבועות.

8. ארגון עצמי ב מזערים PDMS

  1. שימוש coverslips עם PDMS מזערים לצרף תא כמו תיאר מתחת לגיל 4.
  2. נקי, hydrophilize משטח בפלסמה חמצן נקי כפי שמתואר תחת 3.2.2. האם לא פיראניה נקי PDMS סובסטרטים.
  3. תוכנית ההתקנה assay ארגון עצמי של גבירתי כמתואר מתחת לגיל 6.
  4. לאחר הגדרת וזמינותו, בדוק היווצרות דפוס קבוע של גבירתי, מזערים בנוי כהלכה על המיקרוסקופ זריחה.
  5. כאשר דפוסי גבירתי רגילים נוצרו (10-30 דקות), בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים כדי לערבב את הרכיבים ולאחר מכן להסיר את המאגר, צעד אחר צעד על-ידי pipetting. הסר את עיקר גדול המאגר באמצעות פיפטה µL 100 ולאחר מכן הסר בזהירות את השאר באמצעות פיפטה של 10 µL.
    הערה: שלב זה אולי צריך קצת להתאמן. אם מאגר מדי הוא נלקח החוצה או התהליך לוקח זמן רב מידי, מזערים להיות מיובשים אם גם מעט נלקח, החלבונים לא להיות מרותק על מזערים, אך להמשיך ליצור נסיעה גלי המשטח.
  6. לסגור מיד את החדר עם מכסה כדי למנוע ייבוש של המאגר שיורית ב מזערים.
  7. כדי לאפשר יותר פעמים הדמיה, לחבר חתיכת ספוג בתוך החדר בטעימת ולאחר מכן סגור עם מכסה. ודא הספוג לא פנה אל פני השטח של coverslip.
  8. לפני הדמיה של הבדיקה מזערים על פני המאגר הונמך מספיק, כך השטח מעל היווצרות תבנית גבירתי מזערים עצרה. תמונה גבירתי תנודות ב מזערים. בדוק כי מזערים הם לא התייבש או מתייבשים במהלך דימות.
    הערה: להתעלם coverslips עם microcompartments לאחר כל שימוש, כמו סדקים בצורה PDMS.

9. ניתוח של היווצרות תבנית גבירתי

  1. לכמת אורך הגל, מהירות גל, גל פרופילים של הארגון עצמית גבירתי על השומנים נתמך מישורי bilayers. פיג'י עם ערכה סטנדרטית של תוספים הארוזה מספיקה עבור ניתוח בסיסי33.
  2. לנתח תנודות הקוטב-אל-עמוד ב- microcompartments על ידי קבלת kymographs ופרופילים ריכוז חלבון זמן ממוצע. Kymographs הבסיסי ניתן להשיג על ידי חיתוך מחדש סדרה זמן לאורך קו בחירה בפיג'י.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור חלבון הפרוטוקול שלנו אמור להניב מינימום חלבונים של טוהר נאותה. כאסמכתא, איור 1 מספק תמונה מרחביות-דף של המוח, fluorescently מתויג המוח שלי, מינק. השלבים בודדים של ההליך לביצוע assay ארגון עצמי של גבירתי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers מתוארים באיור2. באמצעות פרוטוקול זה, גבירתי רגיל בנסיעות גלי המשטח יכול להיות שנצפו ברחבי החדר (איור 3). אורך הגל יכול להשתנות מעט בתוך החדר, אך באופן כללי תבניות דומות. קצות החדר צריך לא לשמש להשוואות כמותיות, ממברנות כי הטופס על הדבק UV נראה שיש לה מאפיינים שונים מאשר על הזכוכית על פני השטח (ראה איור 3C). ניתן לנתח את גלי המשטח הנוסע ידי עוצמת לאורך כיוון התפשטות (איור 3B). תוך המוח פלורסצנטיות מישורים די מהר מ בחוד החנית של הגל, ואז יורדת בחדות בקצה נגרר, זריחה שלי מגביר באופן ליניארי כמעט מההתחלה של גל המוח ומגיע המקסימאלית שלה אחרי המוח בקצה נגרר, איפה זה נופל במידה ניכרת6.

חלבון איכותי, האיכות של bilayers השומנים נתמך נמצא הקריטי ביותר עבור ארגון עצמי רגיל של MinCDE. מצד אחד אם הקרום נשטף גם יתר על המידה או המשטח שמתחת מנקים את ובכך טעונה בכוח רב מדי, חורים יכולים ליצור ממברנה (איור 6A, העליון). לעומת זאת אם הקרום לא נשטף כראוי או השטח המשמש כבסיס אינו מנקה/hydrophilized, שלפוחית ידבק הקרום או נזילות ממברנה ייחשף (איור 6A, התחתון). אפילו לא כמו לכאורה כמו בעת התבוננות קרום ישירות באמצעות ליפידים שכותרתו, בעיות אלו ניתן לזהות גם האות פלורסצנטיות המוח, כמו דפוסי אינם קבועים זריחה ב- מקסימה אינה הומוגנית אלא מכיל "חורים" או נקודות האור כפי שמוצג בחלונית האמצעית של איור 6A.

עבור הארגון עצמית גבירתי מוט בצורת מזערים PDMS ההליך מסוכם באיור4. פרוטוקול מספר שלבים לא צריך להיות חוזרות ונשנות, כמו חלבונים ושומנים הניתנים לשימוש חוזר. כאילו על שאינם בדוגמת מצעים, המצע הוא ניקה hydrophilized (על-ידי ניקוי פלזמה), ליפידית הנתמכות נוצר ב- PDMS ואת וזמינותו ארגון עצמי מוגדר באמצעי אחסון של 200 µL. כדי לבדוק כי קרום נאות הקימה ומארגן גבירתי עצמית על הקרום, עם תמונה של הצ'יימברס. כאשר קרום נאות נוצר, גבירתי טפסים רגיל בנסיעות גלי המשטח על פני PDMS בין מזערים בודדים עצמי מארגן גם בתחתית מזערים הגלים יכול באופן חופשי תעבור את כל השטח מכוסה קרום (איור 5A). לאחר הסרת מאגר, פני השטח בין התאים צריך לא להראות כל דפוסי גבירתי כציוד (איור 5B), כמו שזה צריך להיות יבש לחלוטין. אם גבירתי דפוסי עדיין זז, מאגר נוסף צריך להיות מוסר. החלבונים עכשיו מרותק microcompartments מוט בצורת PDMS את קרום לבושת ועל ידי אוויר על הממשק העליונה (איור 5C), שבו הם יארגן עצמית. בתנאים אלה שני החלבונים ניתן לבצע תנודות הקוטב-כדי-מוט כפי שמוצג באיור 5D. כמו חלק של המוח ושלי הוא תמיד מאוגד-ממברנה, גם במהלך הסרת מאגר, ריכוז לאחר הסרת מאגר אינם דומים קלט ריכוזים. בשל אפקט זה ריכוז גם משתנות בין מזערים בודדים על coverslip אותו כפי שהם תלויים המיקום של הדפוסים לפני הסרת מאגר. ייצור פרוסות הסיליקון או PDMS לכייר מ כשהפחד סיליקון יכול לגרום מזערים שלם לא יכול לשמש לניתוח (איור 6B). יתר על כן, עקב המאגר להסרת מזערים עלולה להתייבש בתהליך, לפיכך, לא להיות כלולים ניתוח נוסף (איור 6B). כתוצאה מכך רק שבריר מזערים בתא אחד מראה תנודות הקוטב-כדי-העמוד הרצוי. כדי לנתח חלבון דינאמיקה של מזערים, kymograph ניתן להשיג על ידי ציור מבחר מעל המבנה כולו (איור 5E). בעת MinCDE נעים מן הקוטב-אל-עמוד, מינק והנפש יציג הדרגתי ריכוז זמן ממוצע עם ריכוז מרבי בקטבים תא וריכוז מינימלי באמצע התא (איור 5F).

figure-results-1
איור 1: מרחביות-דף מציג את המוצרים הסופיים של חלבון purifications. מדעתו (33.3 kDa), eGFP-מדעתו (60.1 kDa), mRuby3-מדעתו (59.9 kDa), שלו-שלי (13.9 kDa) שלו-מינק (28.3 kDa) מוצגים לפי סדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers (שלבים 1-6). תיבות מקווקווים מציינים כי אחת מתוך שתי אפשרויות אלה יכולים לשמש לניקוי. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: הדמיה של גבירתי assay מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית- A) מין רגיל ספירלה, באיזה מהירות התפשטות הגל, עוצמת מגרש, מהירות ניתן לקבל מדידות. ריכוזים בשימוש: מיקרומטר 0.6 אכפת לך (30% eGFP-נפש), מיקרומטר 1.8 שלו-שלי (30% שלו-שלי-Alexa647) B) למשל מגרש בעוצמה מנורמלת עבור האזור המסומן בא C) סקירה של הקאמרית assay כולו (סרגל קנה מידה: 1 מ מ, באותו ריכוז חלבון כמו לעיל). ספירלות הפיכת הכיוונים כמו גם דפוסי היעד יכול להיות שנצפו. האזור המוגדל מראה כיצד תבניות גל שונה ב- UV-הדבק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי של מוט בצורת מזערים (שלבים 1-5, 7, 8). תיבות אפורים מציינים היכן המוצרים הניתנים לשימוש חוזר של צעדים הפרוטוקול על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5: תוצאות נציג גבירתי דפוס-צורה מוט בצורת microcompartments PDMS. A) גבירתי לארגן עצמית על פני PDMS להרכיב נוסע גלי המשטח (1 מיקרומטר אכפת (30% EGFP-נפש), 2 מיקרומטר שלי ושל 2.5 מ מ ATP). B) לאחר המאגר הוא הוריד את הגובה של מזערים, ארגון עצמי חלבון עוצר על משטח מישורי בין microcompartments. C) סכמטי של microcompartment בצורת מוט אחד. D) להחליפן בתמונות של גבירתי תנודות הקוטב-אל-עמוד לאחר הסרת מאגר. E) Kymograph של תנודות לאורך הקו המסומן מוצג ברה). F) תמונה ופרופיל של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של הזמן-סדרת שמוצג D) מציג בבירור את המילוי ההדרגתי של חלבון מקסימלי-microcompartment הפולנים, מינימלי-התיכון תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
איור 6: דוגמאות של תוצאות שליליות ניסיוני. A) יתר שטף ממברנות לצבור חורים, בזמן ההכנות שלפוחית שיוצרת ויצירות השומנים להוביל דבק שלפוחית. הלוחות מרכז שני מציגים שילוב של בעיות וגם איך הם הופכים גלויים, כאשר תנודות Min. ממברנות היו בלוחיות 0.05% Atto655-סמים. (גודל ברים: 50 מיקרומטר) B) הדף פאנל: התייבש microcompartments יכולה להיגרם על ידי הסרת מאגר מדי, או כאשר המאגר מתאדה לאורך זמן. פאנל התחתונה: תאים לא שלמים יכולים להיווצר במהלך ייצור פרוסות או דפוס PDMS. (גודל ברים: 30 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1: מפת פלסמיד מדעתו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2: פלסמיד מפת EGFP-מדעתו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 3: פלסמיד מפת mRuby3-מדעתו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 4: מפת פלסמיד שלו-שלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 5: מפת פלסמיד MinC שלו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 6: קובץ ה-CAD עבור סיליקון וופל של מוט בצורת microcompartments. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תארנו פרוטוקול למפת במבחנה MinCDE לביצוע ארגון-עצמי על גרפים מישוריים נתמך השומנים bilayers, בהשומנים bilayer מכוסה מבנים תלת-ממד, באמצעות הדוגמה של מוט בצורת מזערים PDMS. על מנת לקבל נתונים יקרי ערך מן מבחני האלה, הם הגורמים החשובים ביותר כדי לשלוט חלבון ואיכות ממברנה.

כדי להבטיח איכות חלבון, חלבון המוני צריך להיות מאושרות מרחביות-דף באמצעות ספקטרומטר מסה. יתר על כן, כדאי לוודא כי החלבונים הם מסיסים ובחלקם לא צבור, באמצעות סינון ג'ל אנליטית או פיזור אור דינאמי. סינון ג'ל יכול לשמש כדי להסיר כל שבר צבורים של חלבונים. התאמת חומציות זהיר והאיכות של נוקלאוטידים נוסף הוא קריטי, כמו התוספת של נוקלאוטיד לא מנוכים או חלקית מפורק לחלבון מניות או מבחני התארגנות עצמית היא מספיקה כדי לחסל את פעילות החלבון, לכן המבטלת ארגון עצמי.

לצד איכות חלבון, ממברנה איכות הוא הקריטי ביותר, היווצרות קרום לא תקין הוא לרוב הסיבה לביצוע ארגון-עצמי פגום, המקור של מבנים משטח artefactual.

בעת ביצוע הפרוטוקול בפעם הראשונה, זה עוזר לה תווית bilayers את השומנים הנתמכות על-ידי הכללת שומנים שכותרתו כמו אטו-655-סמים או DiI-אחוזי טוחנת נמוך (0.05%). ובכך המאפיינים ואת האיכות של הקרום יכולה להישפט ישירות. באמצעות FRAP, הנזילות של הקרום יכול להיות מוערך. יתר על כן, אחד ישירות יכול להעריך את האיכות של שטיפה של סאט גלובל, כמו שם תהיה שלפוחית רבים מדי, אין ממברנה נוזלית או קרום אין בכלל, אם זה נשטף. הגישה קאמרית פתוחה מאפשרת לרחוץ בקפדנות הממברנה, ומכאן גם להסרת שלפוחית זה דבוקים על פני השטח של סאט גלובל. הגורמים המכריעים עבור קבלת נוזלית ואחידה השומנים הנתמכים הם bilayers ניקוי hydrophilicity של פני השטח תמיכה, בגודל הנכון והומוגניות סולעומת זה יכול להיות מועיל לבדוק את גודל שטח ושימוש התפלגות גודל פיזור אור דינאמי. עבור הפצות גודל צרה, אנו ממליצים הבלטת ממד השלפוחיות המוגלתיות ולא sonicating אותם. שיטות אחרות של ניקוי coverslips, למשל, טיפולים עם בסיסים חזקים, חומרי ניקוי בסיסי, או משתמש coverslips ישירות לאחר שטיפה עם מים, תניב תוצאות טובות, בהתאם התערובת יישום, שומנים בדם.

המחצית הראשונה של פרוטוקול המובאים כאן, במבחנה שיחזור על השומנים נתמך מישורי bilayers בתאי פתוח, יש את היתרון של עיבוד פני השטח נגיש עבור microscopies אופטי, כגון מיקרוסקופ TIRF30, FRAP ניתוח6, יחיד-חלקיקים מעקב34, כמו גם טכניקות בדיקה משטח כגון מיקרוסקופ כוח אטומי26. באזור הומוגנית הגדול מאפשר סטטיסטיקה טובה יותר בריכוזים מוגדרים. יתר על כן הגישה קאמרית פתוח מאפשר לשלוט במדויק ריכוז חלבון לבין תוספת מהירה ופשוטה של עוד רכיבים, ומכאן המתיר כדי titrate ריכוז חלבון יחיד קאמרית20. ניתן להרחיב את הבדיקה גם באמצעות תוספת של רכיבים אחרים divisome חיידקיים כגון22,FtsZ35, ZipA22 או ה10,FtsZ-YFP-MTS חלבון chimeric35.

קבוצות אחרות לקחו בגישה דומה כדי לשחזר את Min מערכת במבחנה, אבל שימוש זרימה-תא במקום18,17,תא פתוח19. זרימה-תאים יש יתרונות מסוימים, בפרט כאשר סביבה תלת-ממד מלא סגור הוא הצורך18, השפעת זרימת17,19,23 או קומפוזיציה ממברנה23 על דפוסי MinCDE חקר, או אם חלבון דפוסי להיות שנצפו תחת חלבון הגבלת תנאים19. למרות זאת, בקרה מקומית של ריכוזים מולקולרית קשה יותר. מרכיבי חלבון, בעיקר המוח, בחוזקה לאגד הקרום הם פוגשים לראשונה18,19. מניסיוננו, החלבונים לעתים קרובות להציג שאינם ספציפיים איגוד אבובים, פתחי הכניסה, מזרקים, חלקים אחרים microfluidic. לכן, ריכוז חלבון המקומי נבדלים ריכוזים קלט18 ו גם להשתנות לאורך של הזרימה-התא, וכתוצאה מכך מגוון של דפוסי חלבונים שונים על קרום בין כניסת ו שקע, כפי שנצפה על ידי אחרים19.

השני מחצית הפרוטוקול המובאים כאן, את הכינון במבחנה במוט בצורת מזערים מחדש באמצעות גישה פתוחה קאמרית על תמיכה בדוגמת מכוסה על ידי השומנים bilayers מאפשר לחקות פשוטה ההתנהגות חלבון ' ויוו למרות שליטה מדויקת ריכוז חלבון אובד עקב הסרת מאגר. שימו לב כי בגלל אורך הגל של גבירתי הוא סדר גודל אחד גדול במבחנה ויוו microcompartments מוט בצורת נמצאים גם על אחד בסדר גודל גדול יותר (10 x 30 מיקרומטר) מאשר מוט בצורת e. coli תא.

בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר שליטה מדויקת של כל התנאים, לרבות ריכוז חלבון, מאגר הרכב ומאפייני ממברנה. השימוש תומך 3D מובנה מאפשר התגובה שילמדו תחת כליאה המרחבי, מחקה התנהגות ויוו ללא צורך מיקרופלואידיקה מורכבים ציוד.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים היימן מיכאל, פרנק Siedler לייצור סיליקון ואפלים הליבה מתקן MPI-B לסיוע בסיימון Kretschmer וטיהור חלבונים ו ליאון הרינגטון להערות על כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
DOPCליפידים קוטביים אוונטי850375
DOPGאוונטי ליפידים קוטביים840475
תמצית שומנים קוטביים E.coli ליפידים קוטבייםAvanti100600
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח דיסודיום טריהידרטרוש
אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרטסיגמאA5285-1G
נתרן כלוריVWR27810.295
אשלגן כלורירוט6781.1
טריס-בסיססיגמא אולדריץ'T1503-1 ק"ג
חומצה הידרוכלוריתרוט9277.1
TCEP-HClטרמו פישר סיינטיפיק20491
אתילן דיאמין טטרה-אצטטMerck Millipore1.08418.1000
חומצה גופרתית 98%Applichem173163.1611
מי חמצן 50%Applichem147064.1211
HEPESBiomol05288.1
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Merck102950Uvasol
גליצרול 86%רוט4043.1
TB בינוני
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Roth2316.x
Atto-655-DOPEAtto TecAD 655-161
Ni-NTA agaroseQiagen30210
PDMSbase Dow Corning CorporationSYLGARD 184
PDMS crosslinkerDow Corning Corporation
Materials
UV GlueNorland Products6801#68 ו-#63 שניהם עובדים היטב
Coverslips #1.5 24x24 מ"מMenzel Glä ser
כיסויים #1 24x24 מ"מMenzel Glä serמשמש רק למיקרו-מבנים PDMS
0.5 מ"ל צינור תגובהEppendorf 
בקבוק תרבית 0030123301 2 ליטרקורנינגלמשל 734-1905
His-Trap עמודתGE Healthcare Life Sciences
: HiLoad Superdex 75 PG או 200 PGGE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG עמוד התפלה ארוז מראשBiorad7322010
מכשיר דיאליזה: קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 מ"ל או 0.5-3 מ"לTermo Fisher Scientific66333 או 66330
סכין גילוח
<חזק>מכשירים
מים טהורים במיוחד: Milli-Q Type 1 מערכות מים אולטרה-טהוריםשל Merck
: Ä kta PureGE Healthcare Life Sciences
סוניקטור אמבטיהברנסוןלמשל דגם 1510
ARE-250 מיקסרThinky Corporation
מנקה פלזמה ZeptoDiener אלקטרונישימוש בחמצן כתהליך
גז תזוזה חיובי פיפטותTransferpettor דגמי עם קצות זכוכית
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי LSM780Zeissמצויד ב-Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 אובייקטיבי
<חזק>פלסמידים
pET28a-His-MinD_MinEהמחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שווילמקודד פלסמיד His-MinD ו-MinE לא מתויג לשיפור התשואה
pET28a-His-MinEהמחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שווילמקודד פלסמיד His-MinE
pET28a-HIS-EGFP-MinDהמחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שווילמקודד פלסמיד His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinDהמחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שווילקידוד פלסמיד His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinCהמחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שווילמקודד פלסמיד His-MinC
ג'לסנון ג'ל של HP מערכת טיהור חלבון אוטומטית מותג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949(2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758(2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271(2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116(2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560(2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MinCDETIRFPDMSLipid Extrusion

מאמרים קשורים