השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

תסמונות Myelodysplastic (MDS) מייצגים קבוצה מגוונת של הפרעות במחזור הדם המשובטים מאופיין hematopoiesis לא יעילה, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, נטייה לשינוי לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)^{1,2 3, ,4}. Hematopoiesis לא יעיל מזוהה כמספר מעצר ההבשלה במח העצם, ותוצאות דם היקפיים cytopenias למרות במקרי מח עצם^1,3. השכיחות של MDS הוערך בדרכים שונות כמו 2-12 מקרים לכל 100,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית, השכיחות של MDS עולה עם הגיל, שהופך את תנאי חשוב להבין לאור הזדקנות האוכלוסייה בארה ב^{3, 5}. למרות ברוב המקרים של MDS אין אטיולוגיה ברורה, בחלק מהמקרים MDS הם חשבו להיות עקב חשיפה לסוכנים genotoxic ידועים, לרבות ממיסים כמו בנזן, כימותרפיה לסרטן⁶.

בדרך כלל חולי MDS שרכשו מוטציות בגן התאים MDS⁷. למרות נדיר יחסית, מספר חולי MDS שרכשו translocations כרומוזומלית מאוזנת המערבים גנים כגון NUP98, EVI1, RUNX1 ו- MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). המעבדה שלנו יש עניין ארוכת שנים translocations כרומוזום, שכרוכים ג'ין NUP98⁸. העכברים הטרנסגניים כך מפורשת transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) מוסדר על ידי האמרגן Vav1, משפר אלמנטים להציג את כל התכונות העיקריות של MDS, כולל cytopenias דם היקפיים, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, וטרנספורמציה ל AML⁹ .

למרות MDS זוהו למעלה מ-60 שנה¹⁰, נחשבים הפרעה בתאי גזע המשובטים, מאמצים engraft התא האנושי MDS בעכברים immunodeficient לא הצליחו במידה רבה, כי התאים MDS engraft גרוע^{11, 12,13,14} ו העכברים אינם מפתחים מחלה קלינית. במאמץ לזהות אילו תאים hematopoietic יכול לשדר MDS, אנחנו הפך למודל NHD13, והראה כי אנחנו יכולים engraft MDS כישות המחלה הראה את כל התכונות קרדינל של MDS האנושי, כולל cytopenias דם היקפיים, דיספלסיה, ו טרנספורמציה AML¹⁵. בדו ח זה, אנו מציגים את הפרטים הטכניים של ניסויים אלה, כמו גם גישות נוספות fractionate hematopoietic גזע ותאים קודמן (HSPC), בניסיון לזהות תאים ייזום-MDS.

בעלי חיים בהליכים המתוארים במאמר זה אושרו על-ידי המכון הלאומי לסרטן ב Bethesda חיה אכפת והוועדה שימוש ולאחר לציית למדיניות הנכלל מדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול אנושי, שימוש של חיות מעבדה, חוק צער בעלי חיים, המדריך עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה.

1. תא הכנה

1. מח עצם האיסוף nucleated תא (BMNC)
   1. השתמש רק סטרילי חומרים. לחטא כלי שמיש מחדש באמצעות של תא לחץ אדים. לרכוש את מחטי מזרקים, וואר פלסטיק במיכלים סטריליים לשימוש יחיד. ביצוע מניפולציות כל חיה ותא Class II, סוג A2 הקבינט בטיחות ביולוגית.
   2. להכין BMNCs ב mL 14 סיבוב התחתית התחתונה המכיל 3 מ"ל של HF2 (של האנק מאוזנת תמיסת מלח בתוספת 2% סרום שור עוברית).
   3. המתת חסד C57Bl6 בדרך כלל 2-6 חודשים, גיל התורם עכברים (חיובי עבור CD45 אלל CD45.2), באמצעות תא₂ CO.
   4. לחטא את הגווייה העכבר ע י ריסוס אתנול 70% על פני הגוף כולו עם בקבוק ספריי. לקלף את העור מן הרגליים, מהאגן עד הקרסול.
   5. הסר את femora ואת tibiae הגווייה באמצעות מספריים סטרילי (ישר, חד/חד, 11.5 ס מ) וחדים (Graefe, משונן, עצה 0.8 מ מ רוחב). חתוך את השרירים המחוברים באופן ברור.
   6. חותכים את הקצוות לקרע, בשוקיים עם המספריים. מחזיקים בשוקיים עם מלקחיים, הכנס מזרק 27-מד 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 לתוך חלל מח הטיביאלי בקצה הדיסטלי של עצם השוקה (קרסול). לרוקן את התאים במח העצם של עצם השוקה באמצעות לחץ עדין לתוך mL 14 סיבוב התחתית התחתונה.
      1. חזור על עצם השוקה אחרים.
   7. חותכים את הקצוות הפרוקסימלית ו דיסטלי של עצם הירך עם מספריים. סומק חלל מח עצם הירך על ידי החדרת מחט 20 גאייג-לצרף מזרק 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 בתוך הסוף דיסטלי של חלל מח עצם הירך והחלת לחץ עדין על המזרק.
      1. חזור על עצם הירך אחרים, איסוף כל מח עצם בשני tibiae, femora ב mL 14 באותו סיבוב התחתית התחתונה.
   8. לפזר את המסה מח על ידי כ רפה בעברית למעלה ולמטה מספר פעמים עם 20 גאייג-באותה המחט מחוברת המזרק 3 מ.
2. נוגדן מכתים של BMNC
   1. הרוזן BMNC. הוסף 20 µL של פתרון חומצה אצטית 3% µL 20 של ההשעיה BMNC שנוצר בשלב 1.1.8. לאחר מכן, לספור באמצעות hemocytometer של מיקרוסקופ הפוכה.
   2. גלולה של BMNC על ידי צנטריפוגה עדין ב g x 450 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר עם HF2 באמצעות 90 µL לכל 10⁷ תאים ולהוסיף 10 µL של נוגדנים נגד השושלת biotinylated קוקטייל התליה תא.
   3. לאחר המקננת כעשרים דקות ב 4 ° C, לשטוף את התאים ויטראז'ים עם 3 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
   4. Resuspend את BMNC עם µL 100 של HF2 לכל 10⁷ תאים. להוסיף 2 µL של allophycocyanin (APC) מצומדת נוגדן אנטי ביוטין כדי התליה תא, ואחריו הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. לשטוף את BMNC ויטראז'ים עם 3 מ"ל של PBS, resuspend את BMNC עם HF2 בתוספת 0.2 µg/mL של יודיד propidium (PI) עבור מיון תא cytometry זרימה.
3. Flow cytometry מיון תא של BMNC
   1. כיילו סדרן התא cytometry זרימה. למטב את כל צינורות האופטיקה (PMTs), פיזור ופרמטרים פלורסצנטיות באמצעות תאים וללא רבב ולהגדיר בתוך הטווח. ליניארית של כל גלאי.
   2. להכין וללא רבב, מוכתם PI, APC שכותרתו שושלת התאים קוקטייל במקביל מהשלב 1.2. ניתוח ספקטרלי לפיצוי.
   3. תפלה כפיל תאים על-ידי gating רציפים של FSC-H נגד האס-H, 640-האס-A לעומת 640-האס-H ו- 640-האס-S לעומת 640-האס-וו
   4. הכללת תאים nonviable באמצעות PI נרגש 561 ננומטר, פליטה שנאסף עם מסנן לעבור הלהקה 614/20. לרגש השושלת APC המסומנת תאים על פליטת nm ולאסוף 640 671/30 מסנן.
   5. להקליט פלורסצנטיות ערכים כמו מתח גובה ולאסוף לפחות 100,000 אירועים בקבצי נתונים מצב הרשימה כדי להמחיש את אוכלוסיות ימוין.
   6. חישוב פיצויים ספקטרלי לאחר שרכשה שלוש דוגמאות של 10,000 תאים עבור הגורמים הבאים: ללא תווית תאים PI שכותרתו התאים, נוגדנים נגד השושלת קוקטייל מצומדת עם APC שכותרתו תאים.
   7. להגדיר שלושה אזורים כדי למיין השושלת שלילי (LN), שושלת היוחסין חיובי (LP) עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית דים (LP1), והאוכלוסייה LP עם פלורסצנטיות בהיר (LP2) לתוך צינורות 5 מ"ל המכילה 0.5 מיליליטר 10% FBS מדיה.
   8. סוג תאים באמצעות טיפה אחת אופפים ולטהר את מצב הביטול.
   9. מבצע ניתוח מיון פוסט עם תאים סך 1,000 כל מדגם ממוינים כדי לאשר את הטוהר ואת הכדאיות של תאים ממוינים.
   10. איסוף תאים ממוינים על ידי צנטריפוגה-g x 450 עבור 5 דקות ב 4 ° C, resuspend תא גלולה עם 0.5 מ של HF2.
   11. לאשר מספר עם hemocytometer ו- Trypan blue ממוינים התא. התאם מספר תאים עם HF2 עבור השתלת.
       הערה: קשת רחבה של אוכלוסיות BMNC ניתן לבודד עבור השתלת באמצעות שילובים נוספים של נוגדנים fluorochrome מצומדת בשלב 1.2.2 לעיל.

2. הנמען עכברים והכנה השתלת תא גזע Hematopoietic (HSCT)

1. הכנה של השתלת הנמענים
   1. לשמור על וטרינרי ועל גידול טיפול congenic הנמען עכברים (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במתקן פתוגן מסוים (SPF) חינם בעלי חיים.
   2. טיהור מניעתי של המסלול במערכת העיכול, מספקים במים סטריליים המכיל 100 מ ג/ליטר של ציפרופלוקסאצין לנמענים עבור 7 ימים לפני מנה קטלנית (9 Gy) הקרנה, לשמור למשך 14 ימים בעקבות הקרנה.
   3. מספקים של הקרנה מנה קטלנית (9 Gy) ממקור מדעי המחשב כדלקמן. השתמש מפעיל מיומן, מוסמך במדעי המחשב. להגדיר את המכשיר מקור Cs לספק 70 cGy/min גמא גופית. מקום 10 עכברים בעל אישית מעוצבת והכנס את המחזיק אל החדר בעוצמה. לספק 9 Gy גופית 13 דקות ולחזור העכברים לכלובים.
2. השתלת תא גזע hematopoietic
   1. מערבבים פראי סוג (WT) BMNC מ- congenic הנמען עכבר (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במינון תא של 2 x 10⁵ תאי עכבר עם 2 עד 5 x 10⁴ תאים של הבדיקה מטוהרים ש-BMNC מוכן עם לזרום cytometry מיון כמו שמתואר 1.3 לעיל. מערבבים תאים במזרק אותו.
      הערה: BMNC WT לספק קרינה ממעט-אפקט העכבר הנמען, לאפשר להישרדותה של העכבר הנמען אם התאים הבדיקה אינם תומכים hematopoiesis. BMNC WT השתמשו בסוג זה של הניסוי אקספרס אלל CD45.1, וניתן ובכך מכובד מתאי הבדיקה באמצעות נוגדנים אשר להפלות בין CD45.1 לבין CD45.2. התאים WT מוניטור מכונים "המסייע תאים", "קרינה ממעט תאים" או "המתחרה תאים".
   2. לכוון את עוצמת הקול של התא תערובת כדי µL 200 לכל נמען באמצעות HF2 סטריליות להקלה על הזריקה.
   3. השתלות של תערובות תא ועד לקרינה אולם עכברים נמען באמצעות הזנב תוך ורידי וריד להזרקה באמצעות מזרק 1 מ"ל ואת מחט בקוטר 28, בתוך 24 שעות של הקרנה. מקום זנב העכבר תחת מנורת חימום, כמו חום מוביל אל הזנב התרחבות וריד.
      הערה: המתת חסד כל העכברים הנמען בסוף המחקר ולהעריך את התקדמות המחלה על ידי necropsy, היסטולוגיה cytometry זרימה.

3. engraftment Assay באמצעות Cytometry זרימה

1. כדי להעריך את התורם תא engraftment, לאסוף דם היקפיים (PB) העכברים הנמען-בשבוע ה-6, בשבוע ה-12, ובשבוע ה-16 לאחר ההשתלה.
2. לחמם את הנמענים בכלוב עם מנורת החימום עבור 1 דקות והניחו העכבר לתוך restrainer.
3. לחתוך את וריד הזנב עם איזמל (להב 10, ידית האזמל #3) ולאסוף µL 100 של PB לכל נמען באמצעות צינור microcapillary המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.
4. לחלק את PB שנאספו aliquots שווה שני על ידי הצבת 50 µL צינור microcentrifuge סטרילי. השתמש aliquot אחד עבור ספירת אוטומטיות דם (CBC) (מתבצעות בתוך ליבת Histopathology NCI) לשימוש נוגדן מכתימה את aliquot השנייה, flow cytometry.
5. כדי לזהות engraftment התורם cytometry זרימה, lyse בתאי הדם האדומים (RBC) על-ידי הוספת 1 מ"ל של RBC היפוטוניק פירוק מאגר (8.29 g/L של NH₄קלרנית, 1 g/L של KHCO₃, 0.037 g/L של נה₂EDTA, pH 7.2) µL 50 של PB שנאספו. מערבולת הדגימה כדי לערבב דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. Centrifuge את lysed PB ב 4,600 x g עבור 1.5 מינימלית בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע ולמחוק.
7. חלקית לשבש בגדר תא על-ידי בעדינות הקשה או "מצליף" בתחתית הצינורית. להוסיף מ 1.3 ל- PBS לתוך בגדר הממוקמים צינור צנטריפוגה ב g 4,600 x עבור 1.5 מינימלית בקפידה וביופסיה, להשליך תגובת שיקוע.
8. לשבש בגדר תא על-ידי הקשה או להכות אותך, וכן להוסיף 200 µL של HF2 בתוספת 5% עכברוש לנסיוב בגדר התא.
9. מוסיפים נוגדן anti-CD45.2 (1 µL) מצומדת עם allophycocyanin (APC) כדי התליה תא. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות, בקצרה מערבולת התערובת.
10. לאחר ההכתמה, לשטוף את התאים פעמיים כמתואר לעיל, resuspend עם µL 400 של HF2 בתוספת 1 µg/mL של פאי.
11. לאתר את engraftment באמצעות cytometer 4-צבע זרימה. לקבלת מידע נוסף על סוגי תאים בתוך הדם ההיקפיים על-ידי הוספת נוגדנים נוספים כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים, כגון B או T לימפוציטים.
12. רישום נתונים טורי engraftment באמצעות גיליון אלקטרוני כדי לאפשר ניתוח נוסף של נתונים.

אנו מראים דמויות נציג עבור התוצאות של מספר ניסויים. איור 1 מראה של cytometry זרימה נציג מיון הניסוי. במהלך התמיינות hematopoietic נורמלי, כמו התאים להיות מחויבים שושלת hematopoietic ספציפיים, הם רוכשים מגדיר-שושלת היוחסין סמני פני שטח התא, לאבד את פוטנציאל התחדשות עצמית. לכן, בעכברים פראי-סוג, התחדשות עצמית בתאי גזע מוגבל BMNC היוחסין-שלילי. בניסוי זה, אנחנו מיון BMNC ממח העצם NHD13 לתאי שושלת היוחסין-חיובית חיובי וגבוה שושלת היוחסין-שלילי, נמוכה. דייב תאים ואז היו מושתלים לתוך WT הנמענים כדי לקבוע את יכולת התחדשות עצמית.

איור 2 מציג תוצאות של ניסוי נפרדים, אילו היוחסין תאים שלילי או תאי ממוינת מתורמים NHD13 עם MDS היו מושתלים לתוך אולם לקרינה WT נמענים. תאי התורם NHD13 הביע דה מרקר פני שטח התא CD45.2, ואילו תאי המתחרה WT (עיין בסעיף 2.2.1 לעיל) הביע סמן משטח של תאים CD45.1. איור 3 מראה טורי engraftment ניתוח של BMNC NHD13 ממוינת או שלילי השושלת NHD13 BMNC. לאחר כ- 16 שבועות, התאים NHD13 לגבור תאי WT, כפי שהראה את אחוז גדל והולך של CD45.2 + בתאי הדם ההיקפיים. איור 4 מציג דוגמה של טרנספורמציה לוקמיה עכבר מושתלים עם תאים NHD13 MDS.

איור 1: cytometry זרימה מיון אסטרטגיה של BMNC צבעונית עם נוגדן שושלת היוחסין קוקטייל. כל תיבה מלבנית על המגרש נקודה מייצג את האוכלוסייה תא מיינת לשם HSCT להעריך את תפקוד התא. R4, שושלת היוחסין שלילי; R5, שושלת היוחסין נמוך חיובי; R6, שושלת היוחסין גבוהה חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: נציג FACS פרופילים עבור engraftment assay באמצעות נוגדן anti-CD45.2 ספציפי לתורם. BMNC המטופל היה מושתלים עם עונה 1 פרק 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +), תאים LNBM המטופל עם מוניטור שלילי של שושלת היוחסין 5 X 104 NHD13 (CD45.2 +). בכל מקרה, 2 x 105 BMNC WT (CD45.1 +) שימשו כתאים המתחרה. המספרים מייצגים תיבות העליונים והתחתונים CD45.2 החיובי (נגזר NHD13 התורם) ואת CD45.2 שלילי (נגזר WT המתחרה תאים), בהתאמה, ב שלאחר השתלת בשבוע 6 ובשבוע 24 שעות ביממה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: Engraftment קינטיקה של נמענים יחידים לאחר ההשתלה. כל שורה על הגרף מראה מבחני engraftment סדרתי עכבר הנמען בודדים. נמענים BMNC היו מושתלים עם עונה 1 פרק 106 תאים של NHD13 BMNC כולו, הנמענים LNBM היו מושתלים עם 5 X 104 של השושלת NHD13 מוניטור שלילי לאחר המיון. NHD מציין NHD13 התורם. מוניטור, עכברים הנמען BMNC; LNBM, שושלת היוחסין שלילי מוניטור הנמען; PBMC, תא mononucleated דם היקפיים. בכל המקרים, תאי התורם NHD13 לגבור בהדרגה את התאים WT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: צביעת Giemsa מאי-גרונוולד (MGG) של מח העצם (מוניטור) מנמען MDS זה התקדם AML. הערה הנוכחות של פיצוצים רבים וצורות לא בוגר. חיצים מציינים תקיעות, ראשי חצים מצביעות על הטפסים לא בוגר. מקורי 400 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אין לנו לחשוף.