כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ייצור של הערוץ מתיחה, כפול, איברים שבב microfluidic תא תרבות מכשירי recapitulating איברים ברמת פונקציונליות בתוך חוץ גופית.
מאמר שיטה
ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים
* These authors contributed equally
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
מספר משמעותי של תרכובות עופרת להיכשל בצבר התרופות כי מחקרים שנעשו בבעלי חיים לעיתים קרובות אינם מצליחים לחזות תגובות קליניים בחולים אנושיים. האדם איברים-על-שבב (צ'יפ איברים) microfluidic תא תרבות התקנים, המספקים פלטפורמה ניסיוני במבחנה כדי להעריך את היעילות, רעילות, פרופילים פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה (PK) אצל בני אדם, עשויים להיות גורמים מנבאים טוב יותר של יעילות טיפולית, בטיחות במרפאה לעומת מחקרים שנעשו בבעלי חיים. התקנים אלה עשויים לשמש מודל הפונקציה של כמעט כל סוג האיבר והוא יכול להיות מקושר fluidically דרך נפוצה microchannels מצופה אנדותל לביצוע מחקרים במבחנה על הפיזיולוגיה של איברים וברמת כל הגוף ברמת בני ללא צורך לערוך ניסויים על אנשים. האסימונים איבר מורכב בשני ערוצים perfused microfluidic מופרדים באמצעות קרום חדיר אלסטומריים עם תאים parenchymal ייחודיים בצד אחד, אנדותל microvascular מצד שני, אשר יכול להיות מתח המזמורים לספק איבר ספציפי מכני רמזים (למשל, נשימה תנועות בריאה). פרוטוקול זה פרטים הזיוף של הערוץ גמיש, כפול, צ'יפס איברים דרך הליהוק של חלקים באמצעות 3D מודפס בתבניות, המאפשרת שילוב של מספר הליהוק ועיבוד פוסט-שלבים. פוליפוני נקבובי (דימתיל siloxane) ממברנות (PDMS) מושלך עם מיקרומטר בגודל דרך הפתחים באמצעות סיליקון מערכים עמוד תחת דחיסה. ייצור והרכבה של איברים שבבי כרוך ציוד שלבים אשר ניתן ליישם מחוץ חדר נקי מסורתיים. פרוטוקול זה מספק חוקרים עם גישה טכנולוגיית השבבים איברים במבחנה איברים, גוף-ברמת לימודי גילוי תרופות, בטיחות, יעילות הבדיקה, כמו גם מחקרים מכניסטית של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.
מבוא
כאן, אנו מתארים הזיוף של ערוץ כפול, vascularized איברים-על-שבב (צ'יפ איברים) microfluidic תרבות התקנים באמצעות פרוטוקול מדרגי קלה לשימוש על ידי קבוצות מחקר חסר גישה cleanrooms וכלים מסורתיים ליתוגרפיה רך. התקנים אלה פותחו כדי לסכם את התפקודים האנושיים איברים ברמת ההבנה רגיל פיזיולוגיה של המחלה, כמו גם סמים תגובות במבחנה1,2. פונקציונליות זו קריטית הנדסה הם שני ערוצים perfused microfluidic מופרדים באמצעות קרום חדיר למחצה (איור 1). עיצוב זה מאפשר בילוי של רקמות רקמות ממשקים בין לפחות שני סוגים של רקמות, בדרך כלל איברים תאים parenchymal בצד אחד של קרום נקבובי, אנדותל כלי הדם מאידך, כמו גם את חשיפתם זרימת נוזלים. בנוסף, כי הפולימר אלסטומריים פוליפוני (דימתיל siloxane) (PDMS), משמשת כדי להמציא שבב איבר הגוף ואת קרום רכיבים, מאמץ מכני מחזורית שניתן להחיל על כל מהונדסים רקמות רקמות ממשק דרך הגומי ממברנה לחקות את microenvironment הפיזי הטבעי של איברים חיים, כמו נשימה בריאה ותנועות הפריסטלטיקה במעי.
איור 1: שבב איברים לעבור סעיף- צ'יפס איבר מורכב בשני ערוצים מופרדים באמצעות קרום נקבובי, אלסטי זה יכול להיות נזרע עם תאים משני הצדדים. הערוץ העליון הם חתכי רוחב רחב x תחתון גבוה, 1 מ 1 מ"מ ערוץ הצלב שמקטעים הם 1 מ"מ x 0.2 מ מ גבוה, ואקום וערוצי בשני חלקים התחתון הן 0.3 מ מ רחב, 0.5 מ מ גבוה, מרווח 0.3 מ מ הערוצים fluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
אלה ערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס איברים שימשו הממחיש את ההשפעה של נשימה תנועה על ספיגת ננו-חלקיק ריאות, בצקת ריאות שיכרון3,4; ההשפעות של ממברנות תנועה על בידול5 ו מוגבר ב-6,' המעי5,'7; ואת ההשפעה של העיוותים מחזורית עקב pulsation הלב על בידול התבגרותם של podocytes glomerular הכליה8. בנוסף, לומן שני התקנים אלה המכילים מצופה אנדותל כלי הדם ערוץ המופרדים של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-מצופה קרום תאים parenchymal בתוך ערוץ בנפרד נגיש מתאימים היטב אפיון של סמים PK הפרמטרים ואת גילוי יעד חדש, אשר הגביל ב זלוף יחיד ערוץ מערכות. יתר על כן, שבבי איברים מרובים עשויים להיות מקושרים זה לזה באמצעות ערוצי כלי הדם שלהם ליצירת ביעילות של האדם גוף-על-צ'יפס, אשר יכול להציע פלטפורמה מושכת אנושיים במבחנה הרפוי פיתוח9, 10. בניגוד ביותר מיקרו-פיזיולוגיים מערכות (MPS)11,12,13, האסימונים איברים מכילים שני ערוצים microfluidic מופרדים באמצעות קרום נקבובי המקל על כלי הדם parenchymal אינטראקציות כדי מסכם את הדברים ויוו תפקוד האיבר. זה לא רק מפשט את הקישור של איברים שונים ביחד על ידי פרפוזיה מדיום משותף דרך הערוצים כלי הדם, אבל מידור של רקמות ונוזלים מחקה ויוו פונקציות ותומך ניסויים פרמוקוקינטיים ו מידול כמו גם במבחנה-ויוו אקסטרפולציה9,10 כי קשה או בלתי אפשרי בכל אחד מהערוצים MPS14,15,16. הפופולריות של PDMS במכשירים microfluidic הוביל לפיתוח כלים להתגבר על יכולת מובנית של החומר כדי לספוג את מולקולות קטנות10,17. עם זאת, מספרם של שבבי הנדרשים כדי לתמוך במחקרים ביולוגיים שבו השימוש סוכנים חיידקים ותרכובות קליטת PDMS לעשות שימוש חוזר של איברים שבבי קשה מחייבת תהליך ייצור מדרגי גם עבור קבוצות מחקר קטן. הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטת הזיוף המכשיר מתאים לשימוש במעבדות אקדמית, כולל אלה חסר גישה cleanrooms, הדפס אבן רכה. פרוטוקול זה שואפת להרחיב את הגישה שבבי איברים על ידי מגוון רחב של חוקרים המבקשים להשתמש המכשירים מתיחה, ערוץ כפול עבור חקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כמו גם פיתוח טיפולית translational.
מינוף מומלצות משדות micromanufacturing בשילוב עם עיצוב ייצור, בגישה חזקים פותחה עבור בדיית איברים שבב מכשירים בכמויות גדולות עם הפארמצבטית גבוהה ועם תשואה. פרוטוקול פבריקציה נוספת המתוארים כאן מספק שיטה מדרגי לייצור השבב איברים. אנו מתארים את השימוש אופציונלי עובש-in-Place יג (MiP; פרטי העיצוב בתוספת חומרים) בשילוב עם רצועות פוליאוריתן אטם כדי לאפשר אולם שינוי קנה המידה של השלכת PDMS רכיבים. הצד מבריק של רצועות פוליאוריתן לייצור חלקים PDMS שטיחות חלקה ואילו הצד עם מרקם מקלה על demolding. אנו מתארים גם את השימוש של אופציונלי אוטומטית ממברנה מפברק (אלירן לגזיאל) מספק דחיסה אחידה של קרום וופל בתבניות במהלך ריפוי בדיית עד 24 ממברנות לכל אצווה. העיצוב הוא ישים באופן כללי עבור מחקרים של איברים מורכבים של רקמות להיתקל מאמץ מכני זלוף, הצ'יפס הזה, יכול להיות מיוצר עם השתנות צ'יפ לצ'יפס-נמוכה בכמויות הנדרשות כדי לענות על הצרכים של קטנים וגדולים קבוצות מחקר כאחד. זרימת העבודה היא נוטה תבנית אצווה או קו הרכבה, ברצון תואם עם איכות הערכת פרוטוקולים לשליטה של תהליכי הייצור, אנשי הדרכה, ופתרון מגיבים. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יתרחב גישה ליכולות של ערוץ כפול, מתיחה, שבבי איברים למחקר בסיסי והתרגום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. כללי הכנה
- כדי להימנע פסולת, לנקות את אזור העבודה באמצעות דבק סלוטפ, והורסים אזור עם חדר נקי לנגב, איזופרופיל אלכוהול.
- עבור כל השלבים הדורשים PDMS, מערבבים PDMS ביחס של 10:1 (10 גרם של צלב קישור סוכן, 100 גרם של אלסטומר הבסיס). מערבבים ידנית או עם מערבל זמינים מסחרית. השתמש מערבל צנטריפוגלי פלנטרית כאן: ערבוב 2 דקות ב 2000 סל ד, ואז degassing את PDMS למשך 2 דקות ב 2200 סל ד.
- הכל נקי תבניות עם רובה אוויר להתפוצץ פסולת לפני השימוש.
התראה: אין להשתמש מלקחיים מתכת להסיר פסולת. יהרוס את פני השטח של התבניות.
2. לראש ערוץ הכנה
- נגב למטה בצדדים מבריק כל פיסת פוליאוריתן עם מגבונים אתנול וביו -חדר נקי. ודא כי כל אתנול שיורית הוא מיובש מהמשטח פוליאוריטן.
- מניחים בצד מבריק של הפוליאורטן בצד הפתוח התבנית MiP כדי ליצור חותמת בצד הפתוח של העובש, עוזב רק חור טוב כמו בחלק העליון של, התבנית PDMS השוטף.
הערה: לבדוק כי כל עובש מכוסה בצורה מאובטחת ע י חתיכת פוליאוריתן או PDMS ידלוף מ בתבניות במהלך לשפוך. - במקום ההרכבות עובש, פוליאוריתן לתוך ג'יג MiP, עם הצד עם מרקם נגד בסוף החגיגה MiP. להמשיך לעשות את זה. עד כל תבניות הוצבו לרעתנו.
- הדק רוסמ MiP על-ידי הפעלת הידית באמצעות מפתח ברגים עד 25 מ מ רוחב המרווח יג.
- לעשות סירה רדיד אלומיניום סביב התוכנית MiP כדי למנוע עודף PDMS נוזלת על משטחים.
- שופכים PDMS לתוך כל אחד התבניות. ובכן עד מלא.
הערה: כל רכיב העליון של שבב דורשת כ 3 מ"ל של PDMS. - ברגע. החגיגה כולה מלאה, מקום החגיגה לתוך desiccator ואקום. משוך ואקום ב-80 kPa עבור h 1 כדי דגה PDMS.
- לאחר 1 h, החגיגה MiP להסיר desiccator, הכנס לתנור 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות לרפא את PDMS.
- לפרק רוסמ MiP באמצעות מפתח ברגים, לשחרר את התוכנית על-ידי הפעלת הידית נגד כיוון השעון. לאחר בתבניות ללא דחיסה, להסיר עובש יג.
- הסר את רצועות פוליאוריתן עובש כל וזורקים.
- בזהירות דה-עובש PDMS חלקים מ בתבניות שלהם ולהניח אותן כוללים מקצה לקצה.
- בשורה הלהב של אריח המגרד-סוף tab חריץ, לחתוך בכל קצה singulate את הרכיבים העליון.
- לבדוק חלקים עבור כל מצבי כשל הבאים ולמחוק כל חלקים משביעת רצון: שריטות בתעלה הראשית, פסולת גדולה מעל האזור ערוץ, בועות גדולות, מעוותים ערוצי ואקום.
- לאחסן חלקים סיים פטרי מרובע בתוך ארונות לחץ חיובי בטמפרטורת החדר.
3. בתחתית הערוץ הכנה
- יוצקים כ- 10.5 גרם של PDMS לתוך תבניות עד PDMS מגיע לפסגה של החלל.
- בדוק, התבנית הערוץ התחתון PDMS נרפא לתחתית של עובש.
- אם מלוכלך, לגרד PDMS ישן מהחלק התחתון של העובש מאז משטח לא אחיד לתחתית התבנית יכול לגרום עובי אחיד של החלקים הסופי.
הערה: עבור קטנות < 2 ס מ2 אזורים ונחשפים, אוויר יכול לשמש בעדינות כדי לעבור PDMS על פני השטח.
- מניחים בתבניות desiccator ואקום לשעה.
- לאחר 1 h, להעביר התבניות לתוך תנור ברמה 60 ° C עבור > 4 שעות.
- במקום עובש על שולחן למינארי. שחרר PDMS מקצה אחד של העובש.
- אחיזה בפינה אחת, בעדינות לקלף את PDMS מפני השטח עובש.
- בעת הסרת באופן מלא, שכב על משטח העבודה, כך תכונות הערוץ הם הפנים למעלה.
- חותכים חלקים לאורך קצות בחוץ עם חותכני אריח, הנחת אריח חותך להב PDMS מחורץ כמו שלב 2.12.
- נשכב חלקים תכונה בצד בקלטת כדי להסיר את כל הלכלוך.
- הסר את החלק של קלטת אריזה. גרור את הקצה של החלק לרוחב השקופית. הקצה למינציה עם הזכוכית.
הערה: זה קריטי כדי למנוע מתיחות החלק כשהניח את זה למטה. אם הבועה הוא לכוד בין חלק זכוכית, בעדינות להרים את החלק עם המלקחיים ושכבה מחדש. - לבצע פיקוח בקרת איכות של חלקים. לבדוק חלקים עבור כל מצבי כשל ולמחוק כל חלקים משביעת רצון, כולל אלה המכילים שריטות הערוץ העיקרי, פסולת גדולה, בועות גדולות, או מעוותים ערוצי ואקום.
- מכסים תכונות עם הקלטת.
- חנות חלקים לחץ חיובי ארון בטמפרטורת החדר.
4. PDMS ממברנה הכנה
- בדוק מוצרי קונדיטוריה חופשיים של PDMS על הגב.
- מקם כל וופל ממברנה במכונה ייעודית במגשי מסלולי.
- להשתמש במזרק 1 מ"ל כדי למקם 0.09 מ של PDMS במרכז כל מערך פוסט וופל ממברנה. תן PDMS לשבת למשך תקופה מינימלית של 5 דקות כדי לאפשר PDMS להתפשט ברחבי ההצבות הנגדי של הממברנה.
הערה: אין להמשיך לשלב הבא עד לפחות 75% מערך פוסט מכוסה PDMS. האיכות של ממברנות משפר עוד PDMS מותרת עד לפתיל לאזור פוסט אז זמני ההמתנה ארוכים יותר בשלב זה הם העדיפו. - פלזמה מתייחסים רצועת פוליקרבונט בגיל 20 W עבור 45 s, O גז2 על mbar 0.80 במכונת פלזמה.
- הסר את גיליון פוליקרבונט המכונה פלזמה, להשתמש במספריים לחתוך את הסדינים פוליקרבונט לריבועים 45 מ"מ x 45 מ"מ.
הערה: למזער מגע עם הפלזמה השטח המטופל כדי למנוע אבק נדבקות פוליקרבונט. - בעדינות שכב בצד הפלזמה יחס הריבועים פוליקרבונט על גבי PDMS נוזלי שבמרכזה כשהפחד ממברנה. ודא את פוליקרבונט, PDMS את הקשר.
הערה: להימנע כיסי אוויר בין פוליקרבונט את PDMS. - מניחים את מרווח PDMS חתוכות מראש במרכז הכיכר פוליקרבונט.
- מקם את גיליון פוליקרבונט בעלי מרקם חתוכות מראש על הבלוק PDMS לשמור את מכלול של מליטה לצלחת דחיסה.
- הכנס את המגש כך מגש 3 הוא מאחור, מגש 2 הוא האמצעי, מגש 1 הוא במושב הקדמי. מגש 1 יש חריץ עבור יישור.
- פתח את שסתום הלחץ פלט, לאט לאט פתח את שסתום הלחץ קלט. רק אז סגור את שסתום הלחץ פלט.
הערה: זהו כך הפלט 4 ק ג של כוח מוחלת בהדרגה על כל וופל ממברנה בניגוד באופן מיידי, אשר עשוי לשבור את מוצרי קונדיטוריה. - . מפעילים את המתג מסלולי כ- ON להתחיל מחזור ריפוי לרפא וופל מתחת לגיל 4 ק ג (16 kPa) של דחיסה, מחזור טמפרטורה ramping המפורטים בטבלה1.
| שלב | טמפרטורה (° C) | משך הזמן (דקות) |
| 1 | 20 | 20 |
| 2 | 35 | 10 |
| 3 | 45 | 10 |
| 4 | 50 | 60 |
| 5 | 60 | 120 |
| 6 | 20 | . תחזיק |
טבלה 1 - ממברנה אשפרה תנאים
- סגור את השסתום לחץ קלט ופתח את שסתום הלחץ פלט לשחרור לחצים בין הגלילים אוויר.
- להסיר את המגשים ולהביא להם למינארי.
- לקלף בזהירות את מרקם פוליקרבונט, הסר בזהירות את מרווח PDMS.
הערה: צפה את מרווח PDMS כדי להבטיח שזה לא גם לקלף ההובלה פוליקרבונט, אם מצב זה מתרחש התחלה פילינג מפינה שונה.- לבדוק את הקרום PDMS דרך המוביל פוליקרבונט אזורים עם דרך חורים ולהשתמש סמן כדי לאתר את קווי המתאר של האזור דרך חור ולסמן כל החורים או פגמים בקרום.
- באמצעות וופל טיפול מלקחיים, שחרר ופלים מהמגש.
- הסר כל קרום כשהפחד ומניחים בצלחת פטרי.
הערה: קרום PDMS בטל עובש מן כשהפחד ממברנה ו להיות דבקה את פוליקרבונט מגבה. אם PDMS מתחיל ניתוק מנושאת המטוסים פוליקרבונט, לקלף מאזור אחר. - לאחסן ממברנות ומתקני ופלים פטרי לחץ חיובי ארון בטמפרטורת החדר.
5. ראש האסיפה והכנות
- באמצעות הקלטת מט, לנקות את הקרומים PDMS, כמו גם הקרביים של הפטרי להסיר את הלכלוך.
- ביסודיות להקליט את הצד תכונה של כל רכיב העליון כדי להסיר את הלכלוך.
- מקום הערוץ העליון חלק ("למעלה") תכונה בצד את צלחת פטרי עם קרום PDMS.
הערה: להיות מודעים כי ממברנות מסוימים עשויים לשמש אחד או שניים העליון חלקי בהתאם לגודל האזור שמיש. הערוצים העיקריים של כל חלק העליון צריך להתאים בתוך השטח המסומן של הקרום. - לטעון את צלחות פטרי לתוך המכונה פלזמה.
- פלזמה לטיפול קרום העליון בגיל 20 W עבור 45 s, O גז2 על 0.80 mbar.
- לאחר סיום מחזורי מליטה, להסיר את הכלים ואת נשכב החלקים מופעל תכונה בצד על גבי הקרום ולהבטיח חלק מאובזרות עם קרום עם אין בועות.
- למקם חלקים לתנור 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 h כדי anneal.
- באמצעות אזמל, מעקב בהיקף של למעלה מלוכדות להפרדת העליון-הממברנה הרכבה מנושאת המטוסים פוליקרבונט.
הערה: לא לחתוך את המוביל. - לאחר החלק נמצא במעקב, לקלף את מכלול מפוליקרבונט. קרום PDMS אשר מודבקת לחלק העליון צריך לקלף מנושאת המטוסים.
- באמצעות מלקחיים משופעת חדה, הסרת הקרום היציאות לגשת בערוץ התחתון והסר כל לכלוך או אבק עם מלקחיים תחת סטריאוסקופ.
הערה: אל תשאירו שום חלק קרום המכסה את יציאת גישה.
6. שבב הרכבה
- כוללים מקצה לקצה, פלזמה פינוק הרכבות עם רכיבים התחתון באמצעות התנאים בשלב 5.5.
- תחת מיקרוסקופ הפוכה, יישר את מכלול העליונים עם שקופיות מיקרוסקופ לתחתית חצי.
- מניחים בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות.
- שבב בקרת איכות הבדיקה
הערה: לשלם קרוב לב הנמלים העיקריים וערוץ של השבב. בדוק אם מצבי כשל לפי העין וגם מתחת למיקרוסקופ.- כדי לבדוק השבב מודבקת באופן מלא, tug קלות על כל פינה של השבב כדי לבדוק חלקים delaminating.
- תראו הערוץ של השבב כדי לבדוק אם קרום מקומט או נפול, אשר תופיע תבנית גלי או אפשרות סטיה קלה בערוץ.
- לבצע בדיקה במיקרוסקופ כדי לפקח על פסולת בתעלה המרכזית.
הערה: פסולת בתחומים שאינם קריטיים, כגון הערוצים ואקום מקובל. - עם שבב עדיין על המיקרוסקופ הפוכה, לבדוק את הערוץ העיקרי וערוצי ואקום עבור delamination.
הערה: Delamination באזורים שאינם קריטיים (למשל, הקצה של השבב) מקובל. - בדוק כי מיושרים הערוצים העיקריים בתוך 50-60 מיקרומטר (1-2 ממברנה נקבוביות).
הערה: חשוב כי הערוצים לא חופפות עם ערוצי ואקום. - בדוק כי קרום בין הערוצים העיקריים ואת הערוצים כניסת ולשקע הוא שלם ללא חורים נראית לעין.
הערה: כל חור הקרום יכול להוביל שבב דולף או צמיחת תאים מחוץ הערוצים.
- חנות שבבי פטרי לחץ חיובי ארון בטמפרטורת החדר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול המובאת כאן מתאר הזיוף מדרגי של שבבי איבר PDMS. מכשירים אלו מאפשרים תרבות של שני סוגי רקמות perfused ברורים על אלסטי נקבובי ממברנה (איור 1). הערוצים PDMS מושלך שימוש בתבניות מודפס 3D, אשר מאיצה שטנץ של עיצובים חדשים (איור 2A ו- 2B). ערוצי העליון נוצקו בתבניות תחת דחיסה נגד אטם פוליאוריתן תואם כדי לייצר רכיבים עם יציאות יצוק (איור 2C) בעוד לרכיבי ערוץ התחתון הם הטלת המגשים, שט...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תהליך ייצור מסתמך על תבניות מודפסות תלת-ממד ברזולוציה גבוהה לתבנית PDMS העליון והתחתון שבב איבר גוף המרכיבים יחד עם ממברנות PDMS נקבובי micromolded. גישה ביקורתית זו נבחר בשל נוחות של שטנץ בשילוב עם המעבר מהיר לתוך המשנה את גודלו את ייצור והחלפה של אבזור. התבניות הרכיב העליון מיועדים ליציאות דפוס במיקומים מדויק עם פרופילים אנכי מוגדר במהלך השלב הליהוק. זה לא רק מונע העבודה מעורב באופן ידני ניקוב גישה יציאות אלא גם מפחית פסולת במקום העבודה, מאפשר יישור לשחזור יציאת ממשק יריעות או מכשור, ונוסף מייצרת חלקים עם שליטה על התאמ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
D.E.I. הוא מייסד מחזיק הון עצמי Emulate, inc., ו כיסאות שלה המדעית המייעצת. ג'יי. פי היא כיום אחת העובדים שאמרתי Emulate, inc. ווי. סי, ג'יי. פי, D.E.I. הם ממציאים על קניין רוחני זה מותקן ברשיון כדי Emulate, inc.
תודות
אנו מודים רוסו מ ו ס קרול לעזרה עם צילום, צילום וידאו, מסיה אינגרם, ג'יי נגוין, שיאה ד ש ון תרומתו פיתוח פרוטוקול ייצור ראשוני. מחקר זה היה בחסות מכון Wyss ביולוגית בהשראת הנדסה באוניברסיטת הרווארד, את ההגנה מתקדם הסוכנות למחקרי תחת הסכמי שיתופי #W911NF-12-2-0036 ו- #W911NF-16-C-0050 ולהעניק ה-FDA # HHSF223201310079C, NIH מעניקה #R01-EB020004 ו- #UG3-HL141797-01, ביל ומלינדה גייטס מעניקה #OPP1163237 ו- #OPP1173198 DEI. מנופים ומסקנות הכלולים במסמך זה הם אלה של המחברים, אין לפרש כמייצג את המדיניות הרשמית, גם בין מפורשת ובין משתמעת, של הסוכנות האמריקאית לפרויקטי מחקר מתקדמים ההגנה, המזון והתרופות האמריקאי, המכונים הלאומיים לבריאות, או ממשלת ארה ב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד מגן אישי | |||
| רשת שיער | VWR | 89107-770 | |
| מעיל מעבדה Tyvek | VWR | 13450-506 | |
| כפפות שרוול מורחבות | VWR | 89521-898 | |
| ציוד | |||
| מחצלת חיתוך | VWR | 102096-430 | |
| חותך אריחים | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| תבניות עליונות של עובש במקום (MIP) | Protolabs, Inc. | מודפס בהתאמה אישית ב-Prototherm 12120 | |
| תבניות תחתונות של תבנית במקום (MIP) | Protolabs, Inc. | מודפס בהתאמה אישית | ב- Prototherm 12121 |
| מלקחיים מעוקלים ברווז | VWR | 63041-864 | |
| מלקחיים חדים עם קצה אלקטרונים | מדעי מיקרוסקופיה | 72700-D | |
| מרית מתכת | VWR | 82027-528 | |
| תחריט יונים תגובתי עמוק (DRIE) פרוסות מערך עמודים | Sensera, Inc. | ארבעה מערכי עמודים מותאמים אישית | בגודל 50 x 50 מ"מ לכל רקיק; עמודים ברוחב 7 אום, גובה 50 אום, מרווחים משושה 40 אום זה מזה |
| פוליקרבונט מרקם בעובי 0.01 אינץ' | McMaster-Carr | 85585K33 | חתוך לבלוקים PDMS מרובעים של 45 מ"מ |
| (40 x 40 x 5 מ"מ) | n/a | מותאם אישית | |
| Germfree | BVBI | יצוק | |
| בבית אקדח | |||
| אוויר60° תנור | |||
| מייבש | |||
| איזון | ל-0.1 גרם | ||
| מכונת פלזמה | Diener | יכולת | פלזמה ננו חמצן היא קריטית |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) ערכת בסיס/חומר ריפוי | Ellsworth Adhesives& נ.ב.פ; | ||
| הקפידו על אוורור נאות בעת טיפול בפרה-פולימר עקב רמות נמוכות של מזרק אתילבנזן | |||
| 1 מ"ל | VWR | 10099-395 | |
| מגבונים לחדר נקי | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | VWR | 48311-703 | |
| סרט אריזה | VWR | 500043-724 | |
| סקוטש | קלטת VWR | 500026-873 | |
| רצועות פוליאוריטן חתוכות (PU) אטם | אטיק, בע" | מותאם אישית: AGWI2X3 | 1/8 אינץ' עבה; 60 דורומטר פוליאוריטן שחור; 2 אינץ' x 3 אינץ' |
| סרט פוליקרבונט בעובי 0.005 אינץ' | מקמאסטר-קאר | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 מ"מ צלחות פטרי מרובעות מרושעות | VWR | 60872-480 | |
| רדיד | |||
| ציוד אופציונלי | |||
| Thinky PDMS מיקסר | Thinky | ARE-310 | |
| ג'יג דחיסה מהדק | בורג | בבית | |
| יצרן ממברנה אוטומטי (AMF) | מערך בוכנות דחיסה פנאומטי פנימי |
מקורות
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147(2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017(2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהתיקון
Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 5/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
The References section has been updated from:
- Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
to:
- Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).