גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

סיכום

במסמך זה, אנו מתארים שיטה עבור בידוד, הרחבה, הבידול של גזע mesenchymal מרקמות השחלה הכלביים.

תקציר

עניין גזע mesenchymal (MSCs) גדל בעשור האחרון בשל הקלות שלהם של בידוד, הרחבת והתרבות. לאחרונה, מחקרים הוכיחו יכולת התמיינות רחב שקיימים תאים אלה. השחלה מייצג מועמד מבטיח טיפולים מבוססי תאים בשל העובדה כי הוא עשיר ב MSCs וכי לעתים קרובות נמחקים לאחר ניתוחים ovariectomy כפסולת ביולוגית. מאמר זה מתאר נהלי הבידוד, הרחבה, ואת הבידול של MSCs נגזר מן השחלה הכלביים, ללא הצורך של מיון תא טכניקות. פרוטוקול זה מייצג כלי חשוב עבור רפואה רגנרטיבית בשל תחולתה רחבה של תאים אלה מאוד דיפרנציאבילית בניסויים קליניים, משתמש טיפולית.

מבוא

מספר מחקרים שפורסמו להתמקד בתאי גזע גדל באופן משמעותי בעשר השנים האחרונות, מאמץ המחקר כי הושגה על ידי המטרה הקולקטיבית של גילוי טיפולי רפואה רגנרטיבית עוצמה. תאי גזע יש שני סמנים המעצב הראשי: העצמי - שיפוץ ובידול. גזע mesenchymal אחראי על תחלופת רקמת רגיל, יש קיבולת מוגבלת יותר של בידול בהשוואה בתאי גזע עובריים¹. לאחרונה, מחקרים רבים הראו מגוון רחב של הבידול של MSCs, נושא בדיון אם קיימים הבדלים בין תאי גזע עובריים והוא בוגר כל².

Ovarium פני האפיתל היא uncommitted שכבה של תאים, יחסית פחות הבדיל, אשר מבטאת שני סמנים אפיתל, mesenchymal³, שמירה על היכולת להבדיל בין סוגים שונים של תאים בתגובה אותות סביבתיים⁴. המיקום המדויק של תאי גזע בשחלה אינה ידועה; עם זאת, שהוא הוצע כי אבות bipotential, albuginea tunica להצמיח בתאי הנבט⁵. מחקרים אימונולוגי יש שיערו כי תאים אלה יש מקור סטרומה⁶ או ממוקם או מקורב ביותר השחלה משטח⁷. מאז בתאי גזע mesenchymal אקספרס קולטנים רבים יש תפקיד חשוב ב תא אדהזיה⁸, תוכנן ניסוי כדי לבדוק את ההשערה כי בחירת אוכלוסיה של תאים עם הדבקה מהירה לבודד אוכלוסיה של תאים בבירור characterizable כמו mesenchymal בטבע. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחו על ההטיה של MSCs מרקמות השחלה בהתבסס על הקיבולת של הדבקה על משטח הפלסטיק של המנה תרבות ב ה 3 הראשון של תרבות, על מנת לקבל אוכלוסייה מטוהרים של תאים מפגין הדבקה מהירה⁹. כאן נתאר שיטת שפותחו עבור בידוד תאי גזע mesenchymal של רקמת השחלה.

פרוטוקול

הניסוי בוצע עם השחלות של ארבעה כלבי תערובת הנשי, שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי-תוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושרה על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של UNESP-FCAV (פרוטוקול מס 026991/13).

1. הכנה ניסיוני

1. להכין או לרכוש 500 מ"ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) ללא סידן או מגנזיום.
2. להכין את collagenase אני מדמין פתרון על ידי ערבוב µg 40 של האנזים ב 1 מ"ל של DPBS. סינון באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm ואחסן aliquots 2 מ"ל ב-20 ° C.
3. להכין את התקשורת התרבות הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז נמוך עם סרום עוברית 10%, 1% של אנטיביוטיקה.
4. לאסוף חומרים עקר: מנות מספריים, מלקחיים, בקבוקון תרביות רקמה, צינורות, פיפטות 10 מ ל ו מ ל.
5. השימוש בציוד מעבדה תרבות תא רגיל: בטיחות ביולוגית cabinet (BSC), חממה תרבות תא שוכן בגובה 5% CO₂ ו 38 ° C וצנטריפוגה.
6. לנקות את BSC: עם ידיים בכפפות, לעקר אותה עם 70% EtOH, באמצעות נורות UV.

2. בידוד של גזע Mesenchymal מן השחלה

1. לאחר הניתוח, שמור את השחלות PBS בקרח צינור חרוטי, עד להגעתם במעבדה.
2. ממלאים שתי צלחות פטרי 100 מ מ 10 מ"ל ל- PBS.
3. להסיר את השחלות מהצינור ולהעביר אותם הפטרי הראשון עם PBS. לשטוף אותם עם ערבוב תנועות.
4. בעדינות לאחזר את השחלה ולמקם אותו לתוך תבשיל אחר. עם פינצטה סטרילי, מספריים, מינצ הרקמה לחתיכות קטנות מאוד, בערך בגודל של 1 מ מ בלבד.
5. להעביר את רקמת השחלה 35 מ מ פטרי ולהוסיף 2 מ של collagenase. מינצ הרקמה קצת יותר.
6. מניחים על צלחת פטרי בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ומנערים בעדינות את צלחת פטרי עם תנועות מעגליות בכל 20 דקות.
7. לאחר 3 שעות, הסר את הפטרי של החממה.
8. העבר את התוכן של המנה צינור 15 מ"ל. הוסף 5 מ של התרחבות המדיה.
9. היפוך בעדינות את הצינור לפני צנטריפוגה. Centrifuge הצינור ב g 2100 x במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 3 מ"ל של התרחבות המדיה.
10. העברה בגדר בקבוק T25. מקם את הבקבוק בתוך החממה עם 5% CO₂ ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    הערה: החלק החשוב ביותר של ההליך היא לשנות את המדיה לאחר 3 שעות של דגירה.
11. הסר את הבקבוק של החממה ולהסיר את התקשורת עם הרקמה הנותרת. להוסיף 3 מ"ל של התקשורת הרחבה טריים של הבקבוק.
12. שינוי התקשורת כל 48 שעות, להתבונן בקבוק הנהרות הסלולר.
    הערה: השלבים העיקריים של ההליך יכול להיות שנצפו באיור1.

3. הרחבה של גזע Mesenchymal מן השחלה

1. מעבר תא
   1. כאשר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיה מהבקבוק.
   2. לשטוף את הבקבוק עם 3 מ"ל של PBS. הסר את PBS.
   3. להוסיף 1.5 מ של טריפסין ולשים הבקבוק בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות טפח בעדינות את הבקבוק כדי לסייע התאים כדי לנתק.
      הערה: תאים צריך להגיע למפגש כ 5 - 7 d לאחר ציפוי הראשונית.
   4. להוסיף 3 מ"ל של הרחבת מדיה ולהעביר את התוכן צינור חרוטי.
   5. Centrifuge הצינור ב x 2100 גרם במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.
   6. Homogenize בעדינות את התוכן של הצינור.
   7. קח את aliquot של µL 10 המדגם לבצע תא ספירת להחזיר את הצינור עם תאי החממה.
   8. מקום 10 µL של המיקס לתוך hemocytometer.
2. ספירת התאים
   1. להשתמש המטרה X 10 של המיקרוסקופ ולהתמקד קווי הרשת hemocytometer.
   2. לספור את התאים ב- 5 ריבועים קטנים (איור 2).
   3. הכפילו את המספר שנספרו ב- 50,000 כדי להעריך את מספר תאים למיליליטר.

4. הבידול של גזע Mesenchymal מן השחלה

הערה: מבחני בידול בוצעו על פי הנחיות נוסדה בשנת היל. et al. ⁹.

1. זרע 1.0 x 10⁴ תאים לכל טוב, שהפקידים, שימוש לצלחת תרבות 4-. טוב.
2. להוסיף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.
3. בעדינות להתסיס את המנה עם תנועות מעגליות.
4. לאחר 24 שעות, להחליף את המדיה תרבות התקשורת בידול רצוי.
5. עבור osteogenic, adipogenic, chondrogenic בידול, דגירה התאים עם התקשורת אינדוקציה עבור 30 d, עם החלפת מדיה בכל ערכות התמיינות ספציפיים ד 3 שימשו עבור כל אחד מבחני אלה.
6. על שושלת היוחסין neurogenic בידול, דגירה את התאים עבור 10 d בתקשורת אינדוקציה, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM גלוקוז נמוך, חומצה ולפרואית 2 מ מ, הידרוקורטיזון 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר forskolin, 5 מ מ אשלגן כלורי, 5 אינסולין µg/mL ומיקרומטר 200 butylated hydroxyanisole.
7. עבור מבשרי האנדודרם, תקופת דגירה של 5 d בתקשורת האנדודרם לפי הוראות היצרן מגיב.
8. עבור תא הנבט הקדמוני שושלת היוחסין בידול, דגירה התאים בתקשורת אינדוקציה עבור 14d, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM, 10% FBS, 1 מ מ נתרן פירובט, 10 ננוגרם למ"ל LIF, חומצות אמינו שאינן חיוניות 1 מ"מ, 2 מ מגלוטמין, 5 אינסולין µg/mL, 0.1 מ מ β-mercaptoethanol, putrescine מיקרומטר 60, transferrin µg/mL 20, 10 ננוגרם למ"ל העכבר גורם הגדילה באפידרמיס, 1 ng/mL אנושי בסיסי פיברובלסט גורם גידול, האדם ng/mL 40 גליה התא neurotrophic קו-derived factor פניצילין 15 מ ג/ליטר.

תוצאות

בידוד תאי גזע mesenchymal מן השחלה הכלבים:

ההליך בידוד MSC השחלות מסוכם באיור1. לאחר הניתוח, רקמות הא, collagenase עיכול, שינוי מדיה 3 שעות לאחר תחילת התרבות, אוכלוסיה MSC בשם עם מאפיינים פלסטיק-דבק מהיר הופרדה בהצלחה מרקמות השחלה הכלביים. התאים שנקטפו במהירות דבקה משטח הפלסטיק של המנה תרבות וגדל בתרבות מורפולוגית הומוגנית חד שכבתי עם MSC דמוי טיפוסי מורפולוגיה (

דיון

בזאת אנו מספקים ראיות כי MSCs ניתן לבודד מרקמות השחלה הכלביים, אשר נחשב פסולת ביולוגית לאחר ovariectomy. בשל העובדה כי ניתן למצוא סוגי תאים רבים בשחלה, הצענו פרוטוקול לבחירת MSCs בהתבסס על שדבקו מהירה פלסטיק, אשר בהצלחה נבחרים תאים שגדל טפט עם מורפולוגיה פיברובלסט דמוי.

הדוח הראשון של ההטיה של MSCs ממח העצם היה מבוסס על הקיבולת אדהזיה פלסטיק של MSCs במהלך ה 48 הראשון של תרבות¹¹; עם זאת, דווח כי שיטה זו יש הפוטנציאל לבודד אוכלוסיה הטרוגנית, phenotypically והן מבחינה תפקו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DPBS	תרמו פישר	14190144
קולגנאז I	תרמו פישר	17100017
בקבוק רקמות	קורנינג	CLS3056
DMEM גלוקוז נמוך	תרמו פישר	11054020
FBS	תרמו פישר	12484-010
TrypLE אקספרס	תרמו פישר	12604021
StemPro ערכת בידול Adipogenesis	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis ערכת בידול	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis ערכת בידול Thermo	Fisher	A1007201
STEMdiff ערכת אנדודרם סופית	StemCell	5110
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-טובולין	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F