קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

תקציר

בשנים האחרונות, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבוסס מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה (SMFS) להרחיב את ההבנה שלנו של תכונות מולקולאריות ופונקציות. זה נתן לנו הזדמנות לגלות את ריבוי של מנגנונים biophysical, למשל, adhesins איך חיידקי, לאגד מארח קולטנים משטח בפירוט רב יותר. בין היתר, ההצלחה של ניסויים SMFS תלוי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות ריבית על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים סיליקון משטחים באמצעות silane-פג-carboxyls והכימיה N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ומבוססת על מנת כדי לחקור את האינטראקציה של pilus-1 adhesin RrgA חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס' pneumoniae) עם fibronectin חלבון (Fn) מטריצה חוץ-תאית. התוצאות שלנו להראות כי functionalization פני השטח מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על קצה זיז AFM, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך SMFS מדידות חשף כי RrgA נקשר Fn עם כוח רשע של 52 pN. ניתן לכוונן את הפרוטוקול הזוג באמצעות קבוצות אתר ספציפי תיול חינם. זו התוצאה כיוון חלבון או מולקולה מראש והיא מתאים ליישומי biophysical אחרים מלבד SMFS.

מבוא

לצד פינצטה אופטית, מגנטי,^1,(AFM) מיקרוסקופ כוח אטומי² התפתחה כלי שימושי כדי לנתח ולטפל מולקולות, לחקור את תכונותיהם ואת פונקציות, כולל את תגובתם כוח חיצוני^{3 ,4}. לעומת שיטות כמו וזמינותו immunosorbent מקושר אנזים (אליסה), על פני השטח פלזמון תהודה (SPR) או קריסטל קוורץ microbalance (QCM) כיוונונים, AFM מאפשרת למדוד אינטראקציות על מולקולה בודדת (SMFS)⁵ , רמת תא בודד (SCFS)⁶ . טכנולוגיות אלה הניבו יקר תובנה איגוד מנגנונים כמו הקשרים לתפוס לא מצאה את האינטראקציה של e. coli pilus חלבון ש-fimh עם מנוז⁷או טנדם β-הרוכסן חוזר הנוצרת על-ידי Fn מחייב חלבונים מן S. aureus על איגוד Fn⁸. הצלחנו לאחרונה מראים את pilus-1 adhesin RrgA^9,10 מן חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס' pneumoniae)¹¹ היא היכולת לאגד fibronectin¹² עם תחומים מסוף שני שלה. זה התגלה מנגנון מחייב שני-תחום חדש אשר נבדל טנדם β-הרוכסן עשוי לאפשר piliated pneumococci וכושרם משטחים של המארח קשר כדי המכילים fibronectin ארעי¹³.

להצלחת הניסויים SMFS תלוי באופן ביקורתי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כמו כוחות גבוהה עלולה להתרחש במהלך המדידות SMFS, החלבונים כדאי רצוי להיות covalently יחד אל פני השטח. ישנם מספר רב של שיטות צימוד שונה לאימוביליזציה של חלבונים אחרים מולקולות, וכן תאים שלמים על משטחים מוצקים (אורגניים), ננו חלקיקים והתקנים אחרים המתוארים בספרות^{14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27}. פרוטוקולים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש בחומרים מסוכנים, שקשה לבצע ו/או דורשים ציוד מיוחד (למשל, פלזמה נקי). דרך פשוטה כמה מולקולות הזכוכית היא לצרף שכבה פולימר עבה של heterobifunctional crosslinkers עם קבוצת silane-תגובתי מצד אחד לבין קבוצה אמין-תגובתי בצד השני שלהם. בהתאם ליישום, הסוכנים צימוד יכולות לכלול רשתות הידרו-פחמן גמישה באורך משתנה, למשל., polyethylenglycol (PEG). לדכא את האינטראקציות שאינם ספציפיים של משטחים שונה (למשל, הידרופוביות, אלקטרוסטטית ואינטראקציות ון-דר-Waals) והם עשויים לספק את החופש המסתובבת של מולקולה בשילוב.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כללי עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים המכילים אחד או יותר קבוצות אמינו חופשית (-NH₂) על זכוכית צף, סיליקון ניטריד AFM טיפים ויה heterobifunctional ethoxy silane-פג-carboxyl (-COOH). פרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים SMFS, אשר הוא דוגמה המבוססת על האינטראקציה של RrgA ושל החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn (ראו איור 1 סקירה כללית).

השלב הראשון הוא silanization של פני השטח^28,29,30,31. היא כוללת את הידרוליזה של הקבוצות ethoxy של סוכן צימוד כדי ליצור קבוצות SiOH תגובתי. אלה יכולים להגיב עם קבוצות SiOH על המצע. הריכוז העיקרי צעד, קשרי מימן טופס אלה silanols, על המצע. בתגובה התעבות משנית (אשר בדרך כלל מחייב חום או ואקום להסיר את המים), אגרות חוב siloxane נוצרות. התוצאה היא שכבה אורגניות המצורפת covalently-silane.

השלב השני הוא צימוד של החלבונים פונקציונליות (-COOH) קבוצות אשר להאריך הפולימר³². ראשית, החומצה מומר תגובתי N-hydroxysuccinimid (NHS) אסתר ביניים, אשר הושג באמצעות ומבוססת NHS/EDC (1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid כימיה³³ ועוברים התמרה נוקלאופילית סוף סוף לטופס אמיד להיקשר אמינים העיקרי על החלבונים.

בדרך זו, RrgA היה בשילוב סיליקון ניטריד AFM טיפים, Fn אנושי כדי זכוכית מצעים בשנת כיוון אקראי, כוחות האינטראקציה שלהם נותחו על רמת מולקולה בודדת. התוצאות שלנו מראים כי הכימיה השטח המתואר מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על הטיפ, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך המדידות SMFS. כימיה זו מפחיתה את האינטראקציות שאינם ספציפיים רקע רלבנטי קטן במהלך איסוף הנתונים, ולכן מתאימה מצוין לניסויים SMFS מדויק.

פרוטוקול

1. בטקטיקות של חלבונים ויה Silane תפקודית צימוד סוכנים

הערה: איור 1 נותן מבט כולל על הכימיה משטח יושמו פרוטוקול זה.

התראה: בפרוטוקול הבא, כימיקלים שונים עם מאכל והעור מעצבן מאפיינים משמשים. ללבוש כפפות (עמידי חומצה) מספקת בטיחות משקפי מגן, מעיל מעבדה ועבודה מתחת למכסה המנוע fume בעת הכנת פתרונות כדי למנוע שאיפת אדים.

1. Functionalization של משטחי זכוכית, זיז ניטריד סיליקון עם silane זיווגים סוכנים
   1. להסיר אבק גס, מציג משקופיות זכוכית עם אלכוהול איזופרופיל ודיוק נטולת מגבונים, גזור את השקופיות (אופציונלי) יגיע לגודל הרצוי.
      הערה: לצד זכוכית, השטח מלא יכול להיות סיליקה, קוורץ ו את תחמוצות של אלומיניום, נחושת, בדיל, טיטניום, ברזל, כרום, זירקוניום, ניקל, אבץ.
      התראה: חיתוך בשקופיות זכוכית עשוי לגרום קצוות חדים.
   2. הזכוכית שקופיות בתוך צנצנת מכתימים את המקום מלא חומצה הידרוכלורית (33% HCl) מדולל עם מים מזוקקים כפליים (ddH₂O) ל- 3-5% (v/v), סוגרים את הצנצנת עם מכסה המתאים ולמקם אותו באמבט אולטרא במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הצנצנת משומש כולל בקוטר של 6 ס מ גודל משוער של 65-70 מ. אמצעי אחסון המתאים של HCl מדולל על הצנצנת הוא 50 מ ל המכיל 5 מ ל 33% HCl ו 45 מ של ddH₂O. ביעילות, HCl מסיר יונים מתכתיים מחייב, בעיקר נתרן, אשלגן וסידן ומפחית הסיליקון כדי ליצור משטח זכוכית רווי הידרוקסיל.
      התראה: HCl הוא מאכל, גירוי העור. ללבוש כפפות עמידי חומצה נאותה, משקפי בטיחות והמעבדה מעיל ולעבוד מתחת למכסה המנוע fume בעת הכנת הפתרון כדי למנוע שאיפת אדים.
   3. מקם את ניטריד סיליקון AFM זיז הגששים על משטח זכוכית נקי עם קצה פונה מעלה, להאיר עם אולטרה סגול בהיר מלמעלה לפחות 90 דקות.
      הערה: לקבלת מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה cantilevers עם קבוע קפיץ הנומינלי של 0.01 ל 0.1 N מ^-1 מתאימים. הקרנה של המשטח זיז עם אור UV להסיר מזהמים אורגניים, בעיקר שומן חומרים, ותעשה אותו לבלתי הידרופילית בצד אחד. אם הצד השני מזוהם בכבדות - אשר לא צריך להיות המקרה, או אם הגששים זיז משמשים טריים מהקופסה הספקים - זה עשוי להשפיע על המדידה SMFS. ניקוי יסודי של השבב זיז כל שימוש בפתרון פיראניה, אשר שימש במחקרים רבים³⁴, עשוי לעזור.
      התראה: אור UV מזיקה לעיניים; לכן, הקרנה של הגששים זיז צריכה להתבצע בתוך חדר אטום אור UV. פיראניה פתרון מאוד תגובתי, עלול לצרוב עור, נייר וחומר אורגני אחר. אל תשתמש מיכלי פלסטיק. אם מניחים מנות או צנצנות אפילו עם כמויות קטנות של מציג משטח אורגני (למשל, השימוש הקודם), זה עלול להגיב במהירות.
   4. החלף חומצת מימן כלורי בצנצנת מכתימים עם ddH₂O בלי לתת את משטח זכוכית יבש ומניחים את הצנצנת בחזרה באמבט אולטראסוני עבור עוד 10 דקות להחליף המים שני פעמים נוספות עבור 10 דקות בהתאמה לשטוף היטב את הידרוכלורית . חומצה.
   5. בינתיים, להמיס חומצה פוליאתילן גליקול ethoxy (או מתוקסי) silane (Si (OC₂H₅)³-פג-COOH) בתערובת של אתנול וביו -ddH₂O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 מותאם עם חומצה אצטית) כדי ריכוז סופי של 0.1 מ"ג מ"ל ^-1. אחסן את הפתרון הרמטית על מנת למנוע האידוי של האתנול.
      הערה: Silane צימוד סוכנים רגישים לחות וטמפרטורה. לכן, הם צריכים להיות מאוחסנים תחת גז אינרטי (N₂), בטמפרטורה נמוכה (-20 ° C) ולא בתנאים יבשים. לפני שפתח את הבקבוק, ודא כי חשמל סיליקון הגיעו בטמפרטורת החדר כדי למזער הידרציה וע י כך פסיבציה של קבוצות תגובתי. Heterobifunctional. פג צימוד סוכנים זמינים עם מספר קבוצות פונקציונליות שונות של אורכים שונים מרווח. קיבעון אקראי של חלבונים באמצעות שלהם חינם אמינו קבוצות (NH₂), כפי שמתואר פרוטוקול זה, הקבוצה הפונקציונלית נוספים כדי silane ethoxy/מתוקסי חייב להיות אסתר NHS. לצד רכישת סוכן silane עם אסתר NHS, דרך פשוטה להרוויח אסתר NHS כזה הוא להפעיל את הקרבוקסיל של (-COOH) עם 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) ו- NHS (ראה 1.2.1. ואת 1.2.2.).
      התראה: אתנול הוא דליק, גירוי העור. חומצה אצטית הוא דליק, מאכל. הקפידו לא מקבל חשמל סיליקון ריאקטיבי אל עור או בעיניים. ללבוש כפפות נאותה, בטיחות משקפי מגן, מעיל מעבדה ועבודה מתחת למכסה המנוע fume כדי למנוע שאיפת אדים.
   6. נכנסים הפתרון silane שתי צלחות פטרי נפרדים, למקם את המחקרים זיז מוכן וכל שקופיות זכוכית אחד פטרי בהתאמה, לסגור הרמטית (למשל, מצלמות-מיקרוסקופים) כדי למנוע אידוי של האתנול דגירה נייחים במשך 90 דקות- בטמפרטורת החדר.
      הערה: גודל אופטימלי הפטרי תלוי המספר של הגששים זיז ואת גודל השקופיות זכוכית אשר צריך להיות functionalized. גודל קוטר עבור טיפול טוב ונפח ריאגנט נמוך הוא 50-60 מ מ. כדי למנוע כיפוף רצויה הזיז תוך כדי לחדור דרך הממשק מים אוויר הזיז יוחזקו בזווית של 90° ממשק מים אוויר. הדגירה של שקופיות זכוכית (אך לא את הגששים זיז) יכולים באופן אופציונלי להתבצע ב תפקודי לב / נשימה.
   7. יש לשטוף את השקופיות זיז וזכוכית ב שלושה בקבוקונים רצופים המכיל אתנול טהור לשטוף לחלוטין את תרכובות silane לא מאוגד.
      הערה: כדי למנוע כיפוף רצויה הזיז תוך כדי לחדור דרך הממשק מים אוויר, הזיז יוחזקו בזווית של 90 מעלות.
   8. מקם את השקופיות זכוכית functionalized את הצנצנת מכתימים והזיז על שקופיות זכוכית נקי עם התרופה ב 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: ריפוי עם החום גורם להיווצרות חוב siloxane קוולנטיות, סילוק מים. כמו הכוס שקופיות היו functionalized רק בצד אחד, הקפידו לציין כראוי את הצד מצופה.
   9. לאחסן את הדגימות זכוכית silanized, זיז הגששים ב desiccator ואקום עד שבוע.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
2. קיבעון אקראי של חלבונים על זיז ניטריד זכוכית, סיליקון silanized
   הערה: כדי למנוע כיפוף רצויה הזיז, החללית זיז יוחזקו בזווית של 90 מעלות תוך חדירה בכל ממשקי אוויר מים.
   1. להכין פתרון המכילה 42 מ ג מ ל^-1 של EDC 20 מ ג מ ל^-1 NHS בתוך תמיסת מלח רגיל פוספט buffered (PBS; 137 מ מ NaCl, 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ נה₂HPO₄, מ מ 1.8 ח'₂PO₄, pH 7.4).
      התראה: EDC הוא מאכל, גירוי העור והוא יכול לגרום נזק עיניים חמורות. ללבוש כפפות נאותה, בטיחות משקפי מגן, מעיל מעבדה.
   2. לכסות את השקופיות silane מצופה זכוכית עם הפתרון ו להכניס silanized זיז הגששים טיפה של הפתרון EDC/NHS-תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: עבור הדגירה של הגששים זיז, תיבת זיז המקורי הוא מתאים. עד כמה חלבונים באמצעות קבוצות אמינו חופשית שלהם כדי carboxyls (-COOH) heterobifunctional silane-יתד הסוכנים, הקבוצה - COOH מופעל בכימיה EDC/NHS בשימוש נרחב. EDC זוגות NHS לחומצה קרבוקסילית, ויוצרים אסתר NHS של "יציבות", המאפשרת ההטיה יעיל כדי אמינים ראשי ב- pH פיזיולוגיים בשלב הבא.
   3. לשטוף את השקופיות זיז וזכוכית ביסודיות עם PBS ב שלושה בקבוקונים רצופים כדי לשטוף לחלוטין EDC מוגזמת/NHS.
      הערה: שלב זה כביסה הוא קריטי כמו הנותרים EDC/NHS יכול crosslink חלבונים, ובכך לשנות את הפונקציונליות שלהם.
   4. דגירה של שקופיות זכוכית מופעל עם, הזיז רגשים ב- droplet של הפתרון הרצוי חלבון בחדר רטוב בטמפרטורת החדר. ריכוז החלבון וזמן הדגירה צריך להיות מותאם כדי לענות על הדרישות של הניסוי. ריכוז של בין 0.5-1 מ ג מ ל^-1 והדגירה פעמים מ- 30 דקות כדי 2 h מתאימים באופן כללי, רוב החלבונים. במקרה של fibronectin (בשקופית זכוכית), pilus-1 עצה חלבון RrgA (על זיז), ריכוז מולרי של מיקרומטר 1.5 ו- 3 מיקרומטר, בהתאמה זמן הדגירה של 2 h הן מספיקות.
   5. רוחצים את השקופיות זכוכית את הזיז רגשים ביסודיות עם PBS ב שלושה בקבוקונים רצופים כדי לשטוף חלבונים לא מאוגד.
   6. עיתוני אסתר NHS הנותרים עם טריס (hydroxymethyl)-aminomethan על-ידי הצבת את הגששים בתוך באגירה טריס תמיסת מלח (TBS; 50 מ"מ טריס, 150 מ מ NaCl, pH 7.6) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: שלב זה מפחית צימוד קוולנטיות רצויה של חלבונים בין פני השטח functionalized של קצה AFM ו הזכוכית, כי קבוצות אמינו של טריס ניתן לאגד הקבוצות הנותרות COOH שהופעל על פני זיז, המצע.
   7. רוחצים את השקופיות זכוכית את הזיז רגשים ביסודיות עם PBS וחנות אותם נפרדים פטרי מכוסה PBS עד השימוש.
      הערה: הדגימות צריך להיות מוכן טרי, להשתמש באותו היום.

2. מיקרוסקופ כוח אטומי המבוסס על מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה

הערה: בעבודה זו, מיקרוסקופ כוח אטומי מכלים JPK שימש ולהגדיר את עליות עבור קבלת כוח-המרחק עקומות הוגדרה באמצעות RampDesigner כוח.

1. כיול זיז עם שיטת רעש תרמי³⁵
   הערה: לצורך כיול זיז, בצע את הצעד במדריך של היצרן. רוב cantilever הספקים מצב קבוע של האביב משוער, אשר מחושב בדרך כלל מהצורה זיז נומינלית (אורך, רוחב, עובי), ולכן לא אמינים מאוד. כמו קבוע הקפיץ הנכון הוא מכריע, מומלץ לבצע את הכיול זיז המתוארים להלן שהפקידים להשתמש בערכים אכזרי של ידית אופטי רגישות ואביב קבוע. זה יכול להיות שימושי להקליט את סטיה זיז ב וולט (V) במהלך הניסוי ואת המר זה כדי לכפות (pN) לאחר מכן, באמצעות הרגישות ידית אופטי האביב קבוע אומר ערכים. הרגישות ידית קבועה, אופטי האביב ניתן לקבוע לפני ו/או לאחר הניסוי, כל עוד מיקום לייזר אינו משתנה על שלוחה (המיקום של הלייזר משתקף יכול להיות והשתלב על פוטודיודה).
   1. לתקן זכוכית נקי, רענן את המחזיק לדוגמה AFM, לכסות אותו. עם מאגר PBS.
      הערה: הכיול צריך להתבצע על משטח קשה (למשל, זכוכית), במאגר של אותו כמו הניסויים בפועל.
   2. לתקן את המכשיר מוכן זיז-בעל זיז, למקם אותו בראש AFM ורטוב בקפידה הזיז עם טיפה של מאגר PBS
      הערה: הרטבה הזיז מפחית את מתח הפנים המופיעים במהלך חדירה למאגר הציבורי על השקופית זכוכית כיול וכיפוף ובכך לא רצויים הזיז.
   3. לאט הניעו את הזיז לכיוון פני השטח כיול עד הזיז הוא שקוע לגמרי במאגר PBS אבל עדיין מהמשטח כיול.
   4. השתמש במיקרוסקופ אופטי מבט מלמעלה של AFM או (אם זמין) המיקרוסקופ הפוכה מתחת AFM כדי למקם את הלייזר של AFM על הישבן של הזיז. מניחים את הלייזר ספוט ליד הקצה של הזיז קרוב שבו ממוקם בקצה.
      הערה: במקום לייזר אמור להימצא קרוב לסוף הזיז, אך עדיין צריך להיות לגמרי על הזיז. אם אין במיקרוסקופ אופטי זמין, להשתמש פיסת נייר עבור דיודות לייזר גלוי או כרטיס גלאי לייזר דיודות לייזר אינפרא-אדום, מתחת לראש AFM ולעבור במקום לייזר לעבר הקצה של הזיז-השבב, שבו ממוקמים וזיזי , עד שתראה את המקום בכרטיס נייר או גלאי. לאחר מכן להזיז את הלייזר במקביל לקצה. כאשר הנקודה נעלמת, זה על זרוע התמיכה המוכרת. עבור cantilevers ליניארי, להזיז את המקום לקראת סוף זרוע מנוף עד שיופיע על כרטיס נייר/גלאי, להעביר אותו בחזרה עד שזה שוב על זרוע המנוף (נעלם מהכרטיס/הנייר). עבור משולש, למקם את הנקודה באמצע בין שתי זרועות הזיז ולהעביר אותה לקראת סוף שלוחה, עד שהוא נעלם מהכרטיס/הנייר. בדוק כי אתה באמצע הזיז על-ידי הזזת את הספוט בניצב לציר הארוך של הזיז.
   5. להתאים את מיקום פוטודיודה גלאי ארבעה רבעים של AFM בצורה כזאת, כי קרן הלייזר משתקף ממוקם במרכז פוטודיודה.
      הערה: כדלקמן: להשתמש את הברגים מיקרומטר ליד גלאי דיודות כדי להזיז את דיודת אופקי, בכיוון אנכי, עד האות סכום של כל ארבעת הרבעים מוגדל. ואז להזיז את דיודת בכיוון אנכי, עד האות הסטה אנכית הוא אפס, להזיז את דיודת בכיוון אופקי, עד האות סטיה לרוחב הוא אפס. סיליקון ניטריד cantilevers בדרך כלל יש ציפוי זהב, ולכן הם מתכת bimetal עם שני המקדמים שונים של הרחבה תרמי. התוצאה בשלג תרמי (לכאורה בתוך האות הסטה אנכית) במיוחד בפתרון. כדי להפחית את הסחף הזה במהלך המדידות, תן את כל המערכת equilibrate לכמה דקות לפני שמתחילים את הכיול.
   6. פתח את מנהל כיול בתוכנה AFM, לכייל את רגישות זיז, קבוע הקפיץ הזיז את שיטת רעש תרמי כדלקמן.
   7. בזהירות לגשת על פני המצע והקלטה של עקומת כוח-המרחק.
   8. לקבוע את הרגישות ידית אופטי ב- nm/V על ידי התאמת קו ישר לחלק התלולים של עקומת כוח הכחשה, איפה הטיפ במגע עם המשטח המצע. הרגישות מאפשרת להמיר את קבוע הקפיץ של זיז pN/nm.
      הערה: השיפוע של העקומה הכחשה היא אלמנט פייזו לנסוע מרחק vs. שינוי מתח פוטודיודה (נמדד ב- nm/V).
   9. שיא מספר ספקטרה רעש תרמי הזיז את מיקרומטר זיז כ 100 או יותר מהמשטח כדי לא לכלול כל המתלים משטח.
   10. לקבוע את קבוע הקפיץ של הזיז ב- pN/V על ידי התאמה של מתנד הרמוני שמספקת התוכנה AFM ספקטרום רעש תרמי.
   11. לאט לאט. משכי הזיז ולסגת זה הפתרון.
   12. תחליף משטח זכוכית לשימוש כיול זיז עם משטח הדגימה המכיל את החלבונים קיבוע. ודא הזיז והמשטח מדגם (וע י כך החלבונים) לא מתייבשים תוך שינוי בשקופיות זכוכית.
2. האינטראקציה לכפות ניסויים על רמת חלבון יחיד
   1. לאט הניעו את הזיז לח לכיוון פני השטח הדגימה עד הזיז מכוסה לגמרי על ידי PBS מאגר אבל עדיין מהמשטח המצע.
      הערה: כדי לצמצם את הסחף תרמית במהלך הניסוי, תן את כל המערכת להגדיר כמה דקות לפני תחילת המדידות ספקטרוסקופיה כוח.
   2. הגישה השטח ולהקליט עקומות כוח-המרחק מרובים (≥ 500) במקומות שונים של פני השטח לדוגמה, עם קשר לכח 250 pN, זמן מגע של 1 s, באורך הכחשה של 2 מיקרומטר והמהירות הכחשה של מיקרומטר 1 s^-1.
      הערה: לקבלת התאמות ספקטרוסקופיה הכוח כלליות, פעל ידני של היצרן. גרסאות: המהירות הכחשה יכולים להיות מגוונים בין 0.1 ל 5 מיקרומטר s^-1 כדי לחשב נתונים kinetical העומס הגובר בכוח. אינטראקציה עם הזמן יכולים להיות מגוונים כדי לנתח חיזוק הקשר תלוי זמן. במקום לשמור על מהירות הכחשה מתמדת, אחד רשאי לשמור על כוח קבוע (כוח קלאמפ מצב).
3. ניתוח נתונים
   הערה: ניתוח הנתונים בוצע שימוש בתוכנת עיבוד נתונים. בהתאם את החלבונים קיבוע, את הזמן קשר או את המהירות הכחשה, אם טביעת סופחה או לא פרמטרים משתנים אחרים, העיקולים כוח-המרחק מכילים מידע שונים מרובים. ניתוח נתונים ופרשנות משתנות בין ניסויים SMFS שונים, ולכן לא ניתן לתאר בפירוט כאן. ולגבי האינטראקציה של RrgA ו Fn, הפרוטוקול הבא יכול להיות צעד ראשון לניתוח של נתונים SMFS.
   1. לפתוח את הקבצים עקומת כוח נמדד על-ידי בחירה בסמל פתוח אצווה של כוח לסרוק ולעבד את עקומות כוח-המרחק כדלקמן:
   2. להמיר את סטיה זיז (V) ביחס ישר כוח (נ) על-ידי בחירה בסמל כיול (מחדש) V-סטיה על ידי התאמת רגישות ו קבוע קפיץ .
      הערה: אם זיז כיול בוצע לפני הניסוי, הערכים נשמרים קבצים סריקה כוח ומשמשים באופן אוטומטי במהלך כיול נ'-הטיה. אם הכיול בוצע לאחר הניסוי, התוכנה משתמשת ערכי ברירת מחדל, אשר ניתן לשנות את הערכים נמדד.
   3. להחסיר את התוכנית הבסיסית של הערוץ נסיגה באזור של עקומת כוח רחוק השטח כדי להגדיר את רמת כוח אפס על-ידי בחירה בסמל בסיסית חיסור.
      הערה: במקרים מסוימים, הכחשה ייתכן שאין ערך קבוע כוח זהה ולהציג עקומת עשוי הטיה ליניארי, אשר ניתן להסירו על ידי בחירת אופסט + הטיה.
   4. הגדר את הנקודה כאן הטיפ נהיה במגע עם הדגימה על-ידי בחירה בסמל קשר עם נחישות הצבע .
   5. להמיר את האות גובה הטיפ-sample ההפרדה על-ידי בחירה בסמל עצה-Sample ההפרדה . בנוסף הפחתה את מיקום נקודת קשר, הליך זה גורע הזיז כיפוף כדי לחשב את המרחק בין משטח המצע AFM-טיפ.
      הערה: עבור התאמת דגמים אלסטי פולימרי, כמו הדגם תולעת-כמו-שרשרת להרחבה ונחישות באורכים אינטראקציה, ההפרדה עצה-לדוגמה, אשר תתוקן על זיז הכיפוף, נדרשת. כדי לקבוע את כוח טעינה שיעור מן המדרון של עקומת כוח ומהירות z-piezo, העיקולים כוח שלא תוקנו אמור לשמש.
   6. מסך עקבות כוח-המרחק עבור פסגות כוח המתרחשים קרע אורכי מעל nm (באורך של מרווח נמתח פג) 70³⁶ כדי למיין את האינטראקציות ספציפי ולהחיל המודל תולעת-כמו-שרשרת להרחבה על הפסגות שנבחר על-ידי בחירה סמל מתאים מודל שרשרת הפולימר , בחרה Extensible מודל שרשרת תולעת. הפסגות בתוך עקומת כוח הכחשה להיות מצויד מודל זה, וכוחות קרע אורכי מתקבלים, יחד עם הפרמטרים אלסטי של הפולימר.
   7. מציגים את הנתונים היסטוגרמות מציג ההפצות כוח ואורך. להשתמש לפחות 100 אירועים unbinding היסטוגרמות.

תוצאות

הפרוטוקול המתוארים כאן תוצאות קיבעון קוולנטיות של חלבונים באמצעות שלהם אמינים העיקרי נגיש עם אוריינטציה אקראי (איור 1). איור 2 מציג תמונה AFM של משטח זכוכית silanized עם (משמאל) והקליט ללא Fn (מימין) משותק, לאחר להתייבשות של הדגימות תחת זרם עדין של חנקן. השכבה פולימר silane מראה רק קטן משטח corrugations בגובה של 2-5 nm (איור 2, נכון), ואילו על פני השטח functionalized עם Fn, כ 10 nm גבוהה Fn מולקולות הן לכאורה (איור 2, משמאל). ב צילומי תקריב, ניתן לזהות את המבנה dimeric של Fn. מולקולות Fn. נראה קומפקטי לגובה של 4-5 nm מעל הציפוי משטח פג, באורך של ~ 120 ננומטר (ראה מוסיף).

כדי לחקור את כוחות האינטראקציה של RrgA עם Fn, אשר לאחרונה תוארה בפירוט על ידי שלנו קבוצה¹³, RrgA היה בשילוב סיליקון ניטריד AFM עצה ו Fn האנושית אל המצע זכוכית (איור 3 א). איור 3 מראה עצה נציג מדגם עקומות ההפרדה של אינטראקציה RrgA עם Fn הקליט במהירות מושך של מיקרומטר 1 s^-1. הכימיה משטח בשימוש הוביל אינטראקציה עם רקע נמוך ואירועים דמויי אינטראקציה בודדת (או זוגי) (איור 3 א), אשר היו מצוידים באמצעות של תולעת להרחבה כמו מודל שרשרת (eWLC) (אדום ' עקומות '). התוויית התוצאות של התאים (קרע כוח ואורך, ראה איור 4) מראה כי לאחר התגברות על אינטראקציות משטח שאינם ספציפיים בין עצה AFM ו המצע, מתיחה של linkers פג (> 70 ננומטר), עד ~ 19% של עקומות כוח הראתה קרע אירועים עם קרע מתכוון לכפות על RrgA - Fn האינטראקציה של ~ pN 52 במרחקים עצה-דוגמה של 100 ננומטר. לעומת זאת, כימיה פני השטח המיותר (כאן, הושמט שכבתה עם טריס נאגר מלוחים איור 3b) יפריע הערכה ברורה של אינטראקציה בודדת אירועים בגלל אינטראקציות לא ספציפי, חלבון מרובים מחייב (trace 2 ו-3) ו/או צימוד קוולנטיות של חלבונים בין פני השטח דוגמת קצה זיז AFM. זה מוביל לכוחות להיקרע גבוהה (trace 1) יכול להיות מלווה התגלגלות של חלבון (Fn) קבוצות המחשבים (trace 4 ו- 5).

איור 1: סקירה על פני השטח הכימיה. הידרוליזה של ethoxy silane-פג-carboxyl ואחריו שלה עיבוי על משטח זכוכית hydrated ואת היווצרות siloxane crosslinks. התגובה של EDC עם קבוצות carboxyl תוצאות תגובתי o- acylisourea, ביניים אמין-תגובתי עם מחצית חיים מאוד קצר בתמיסה המימית (הידרוליזה). הביניים מיוצב על ידי היווצרות של אסתר NHS אשר עובר התמרה נוקלאופילית להקים סוף סוף של בונד אמיד עם ראשי אמינים על החלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: קיבעון של fibronectin על זכוכית המצע ויה heterobifunctional ethoxy silane פג carboxyl צימוד הסוכן. AFM תמונות של זכוכית functionalized צף עם (משמאל), בלי (מימין) Fn. המספרים מציינים מולקולות Fn בודדים, אשר מופצים homogeneously על פני המצע (מוסיף). המולקולות לאמץ מבנה dimeric, קומפקטי בגובה של 4-5 nm מעל המקל ציפוי והאורך > 100 ננומטר. זה דומה למבנה Fn בתמיסה, עולה בקנה אחד עם הנתונים הקודמים AFM על משטחים אחרים, למשל, נציץ (סרגל קנה מידה של אינליי = 500 ננומטר)³⁷. AFM תמונות להלן גובה פרופילים לאורך הקווים המצוין של AFM תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: איור של הניסוי SMFS וכן נציג כוח עקומות מרחק של RrgA - Fn אינטראקציה. (א) RrgA, Fn היו מקושרים covalently דרך silane ethoxy heterobifunctional פג carboxyl צימוד הסוכן כדי ניטריד הסיליקון AFM זיז עצה, משטח זכוכית, בהתאמה. נציג SMFS בכוח מרחק עקומות השיג עבור RrgA - האינטראקציה Fn במהירות הכחשה של s 1 מיקרומטר^-1 עם הנייח תיאר RrgA ו Fn מוצגים. עקומות אדומים מייצגים את שרשרת תולעת להרחבה. מתאים מיושם כדי להשיג כוחות קרע אורכי. האיור השתנה Becke, et al., ACSnano 2018¹³. (ב) SMFS נציג כוח עקומות מרחק שהושג עבור RrgA - Fn אינטראקציה ללא שכבתה עם טריס buffered מלוחים. במקרה זה, נעדר אמין העיקרי של טריס כך שנותרו פעילים NHS אסטרים נותרו רוויה במהלך הניסוי. זה הוביל רב חלבון מחייב (trace 2 ו- 3), לבצע את חסימת העורקים של חלבונים בין פני השטח בקצה AFM אשר הביא להיקרע גבוהה כוחות תחום מלווה (Fn-) התגלגלות (trace 1, 4 ו- 5; הערה על סולמות שונים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: חלוקת כוח ואורך RrgA יחיד - Fn אינטראקציות. קרע כוח, המתאימים היסטוגרמות אורך של קרע, המתקבל RrgA - Fn SMFS אינטראקציה מדידות (n = 1400) במהירות הכחשה של s 1 מיקרומטר^-1. היסטוגרמות לחשוף הסביר ביותר קרע כוח f_MP של 51.6 pN (גאוס להתאים, קו שחור) ואת הצטברות של קרע אורכי סביב 100 ננומטר. האיור השתנה מ Becke, 2018. et al., ACSnano,¹³. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

מאז כניסתה של AFM מבוסס SMFS, זה התפתח טכניקה בשימוש נרחב כדי לחקור ישירות אינטרה ולכוחות הבין-מולקולרי של בודדים חלבונים, חומצות גרעין אחרות^4,3,מולקולות⁵. לניסויים SMFS מוצלח, פני השטח המתאים צימוד אסטרטגיה היא תנאי הכרחי. כדי לחקור את הכוחות התפלגות פולימרים טבעיים וסינתטיים, פולימרים עשוי להיות ישירות מצמידים את המצע השטח ואת AFM עצה^{36,38,39,40,41}. חקירה של האינטראקציות הבין-מולקולריות, כגון המולקולארי, זאת, רצוי להשתמש גמיש מקשר מולקולות כגון הטרו-bifunctional linkers פג או שרשראות מפוליפפטיד, לצרף השותפים לאינטראקציה בין קצה AFM ו משטח המצע, כדי לאפשר הכיוון הנכון של השותפים מחייב, כדי להתגבר על כוחות משטח לטווח קצר וכדי למנוע דנטורציה של התגלגלות של חלבונים^{21,22,23, 24,25,26,27,42}. אנחנו ולכן תיאר עבור הנייח קוולנטיות של חלבונים באמצעות פרוטוקול פשוט וגלוי שלהם אמינים העיקרי נגיש באמצעות מפרידי פג הטרו-bifunctional.

להדגים את תחולתן עם החקירה של האינטראקציה כוחות בין adhesin RrgA מ ס pneumoniae החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn, לאחרונה מתוארות בפרוטרוט במקום¹³.

הכימיה משטח וותיקה, גישות דומות שנותחה שימשו בהצלחה מרובים SMFS ניסויים^{19,42,43,44,45}. Silylether המשמש צימוד הפולימר silane אל פני השטח, כפוף הידרוליזה. מידת הידרוליזה תלויה מידת siloxane נוצר חוב, אשר ניתן לשלוט בתהליך silanization. אם כוחות האינטראקציה גבוהה (≥ 1000 pN) צפויים במהלך המדידות SMFS, silanization צריך להיות שבוצעו באמצעות אדים-שלב העדות³⁰ אשר גורמת להיווצרות של שכבה רציפה של siloxanes. לגבי ניסויים רבים (למשל, חלבונים רבים – אינטראקציות חלבון), כוחות האינטראקציה הן בטווח של כמה מאות pN, ההליך המתואר, אילו siloxane היווצרות הוא בוצע על ידי תצהיר של שלב מימית, לא מאוגדים דשן אורגני מינרלי-חשמל סיליקון בהרהור נשטף עם אתנול (שלב 1.1.7) ואחריו ריפוי עם חום (שלב 1.1.8), מספיקה.

עוד צעד קריטי לשטוף את EDC הנותרים, מולקולות NHS מספיק עמוק (שלב 1.2.3), כמו שאריות יוביל ההפעלה של קבוצות carboxyl על החלבונים. אולי זה גם התוצאה crosslinking של חלבונים על פני השטח אותו, אשר יכול לשנות את הפונקציונליות שלהם או covalently הזוג הפעיל חלבונים חלבונים אחרים על מול פני. זה עלול להוביל מחבר חובק למעקה של החלבונים בין פני השטח הטיפ AFM, דבר המתבטא כוחות להיקרע גבוהה מלווה יכול להיות על ידי תחום התגלגלות (ראה איור 3b, מעקב 1, 4 ו-5, התגלגלות של תחומים Fn)⁴⁶. אותה בעיה יכולה להופיע, אם האסטרים NHS פעיל של מרווח פג נותרו רוויים. לכן, הדגירה בתמיסת טריס buffered מומלץ (שלב 1.2.6), כמו אמין העיקרי של טריס המרווה הקבוצות הנותרות תגובתי אמינו.

בעקבות פרוטוקול stepwise מוביל בהתפלגות הומוגנית של Fn על הזכוכית silanized אל פני השטח (ראה איור 2) עוזבת צורה dimeric של החלבון. זה דומה Fn´s מבנה בתמיסה, עולה בקנה אחד עם הנתונים הקודמים AFM על משטחים אחרים דוגמת³⁷. בנוסף, הריכוז המתאים של RrgA בקצה AFM מתקבל, אשר יוצרת ערך יעד של ~ 20% של אירועים מוגדרים היטב אינטראקציה במהלך המדידות SMFS (איור 3 ו- 4 באיור). דרך אלגנטית אחרת כדי לקבוע את כמות מולקולות בשילוב בין מדגם המצע ו שלוחה קצה חוץ משתנה הפעמים ריכוז ו/או הדגירה חלבון, הוא השילוב של silane-סוכנים עם קבוצות פונקציונליות שונות משני. על-ידי שינוי היחס בין חלבון קבוצות תגובתי המשתרעת פג-פולימר, מספר חלבונים קיבוע יכול להיות מבוקר^15,16,17,18.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כדי לשתק מולקולות המכילות₂ אחרות -NH או להתאימם כמה חלבונים אחרים משטח סיליקון-תחמוצת חוץ ניטריד זכוכית וסיליקון. בהתאם לעיצוב חלבון, תגובתי amine הקרבוקסיל ניתן לשנות קבוצה ראקטיבית sulfhydryl (למשל, maleimide או אורתופדיה-pyridyl דיסולפידי) עד כמה את חלבון באמצעות חינם שלו – קבוצות SH. עבור Fn, התוצאה^17,13,20כיוון מוגדר מראש.

לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשרת דרישות שונות ומתאים עבור יישומים biophysical אחרים מלבד מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה ניסויים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>חומר
2-פרופנול	קארל רוט	6752
1-(3-דימתיל-אמינופרופיל)-3-אתילקרבודימיד	סיגמא-אולדריץ'	03450	EDC
חומצה אצטית	קארל רוט	3738	100%; טוהר אנליטי
			מזוקקים כפולים
אתנול	Carl Roth	9065	≥ 99.8%; טוהר אנליטי
אתוקסי סילאן פוליאתילן גליקול חומצה	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acid	Carl Roth	X896	32 %
N-Hydroxysuccinimid	Merck	804518	NHS; לסינתזה
תמיסת מלח חוצצת פוספט - Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
מולקולת בדיקה e. פיברונקטין, פלזמה אנושית	Sigma-Aldrich	F1056
מולקולת בדיקה למשל RrgA			מיוצר במעבדה
סודיום כלוריד	קארל רות'	9265	NaCl
Tris (הידרוקסימתיל)-אמינומטן	קארל רות'	AE15	≥ 99.3%; טריס; מאגר דרגה
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>ציוד
כוסות
זכוכית חותך
זכוכית זכוכית שקופיות	קארל רוט	0656
מייבש גז אינרטי	Sicco
מיקרוסקופ הפוך - Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM ותוכנת DP	JPK Instruments
תנור מעבדה	קלסר בוחש
	מגנטי IKA
מיקרו מרית
מיקרו צינורות מיקרוצנטריפוגה
מיקרוסופט אקסל	מיקרוסופט
פרפילם M	מותג	701606
פטרי צלחות
pH-meter	Knick
Pipettes	Starlab		10-100 ומיקרו; l, 50-200 ומיקרו; l, 100-1000  ומיקרו; l
איזון מדויק	Acculab
סיליקון ניטריד שלוחה - MLCT	Bruker AXS S.A.S		קבוע קפיץ ≤ 100 pN/nm
אמבט סוניקציה	צנצנת
מיקרוסקופ סטריאו - Zeiss Stemi	Zeiss
Stir bar
מגבונים מדויקים של Kimtech Science	Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	ספקטרום כספית עם אנרגיה ראשונית ב-254  nm
			ואקום
משאבת
מערבל מערבולת	VWR
נייר שקילה	Carl Roth	TP64