כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לגרום כיבים בעור הרלוונטית קלינית לחץ (מוגלה) במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה (מדע). מודל זה יכול לשמש במחקרים קליניים למסך הרפוי שונים עבור הריפוי מוגלה בחולים SCI.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הלחץ כיבים (מוגלה) נפוצים מתישה סיבוכים של פגיעה בחוט השדרה טראומטי (מדע), נוטים להופיע ברקמות הרכות סביב הפטמתיים. עם זאת, מעט ידוע על ההשפעה של מדע בדיוני על העור פצע ריפוי בהקשר של הגדרות ניסויים מבוקרים במודלים חייתיים. במחקר זה, מוצג מודל עכבר פשוטה, לא פולשנית, הדירים הרלוונטית קלינית של מוגלה בהקשר של מדע שלם. עכברים זכרים בוגרים (Balb/c, בן 10 שבועות) היו מגולח, depilated. לאחר אפילציה (24 שעות), עכברים היו נתונים laminectomy ואחריו חיתוך בחוט השדרה מלאה (T9-T10 חוליות). מיד לאחר מכן, קיפול העור בחלק האחורי של העכברים הרים, דחוקה בין שני דיסקים מגנטי שנערך במקום במשך 12 שעות הבא, וכך ליצור אזור איסכמי שהתפתח פו במהלך הימים הבאים. האזורים הפצועים הפגינו בצקת רקמות והעלמות עוריות על-ידי יישום מגנט שלאחר יום 3. מוגלה באופן ספונטני פיתח, נרפא. הריפוי היה, עם זאת, ביחס איטי בעכברים SCI לשליטה עכברים שאינם-SCI כאשר הפצע נוצר מתחת לגובה של הפוליטיקה לעומת זאת, אין הבדל ריפוי נראתה בין עכברים שאינו מדע בדיוני SCI ושליטה כאשר הפצע נוצר מעל מפלס לביוטכנולוגיה המודל הזה הוא כלי שעשוי להיות שימושי כדי ללמוד את הדינמיקה של התפתחות PU העור וריפוי לאחר SCI, כמו גם כדי לבחון גישות טיפוליות שעשויים לעזור לרפא פציעות כאלה.
מבוא
הלחץ כיבים (מוגלה) הם לסיבוכים המשניים של SCI טראומה1. מוגלה הן פציעות מקומי בעור ו/או כבסיס רקמות המתרחשות בדרך כלל מעל הפטמתיים משקל הגוף איפה מרוכזים כאשר המטופל יושב או שוכב1. עור, שומן, שריר חשופים ללחץ הזה שמוביל להתפתחות של איסכמיה המותאמות לשפות אחרות, דלקת, פגיעה מכנית ונמק2,3.
התפתחות מוגלה מושפע במספר גורמים מקומיים, כולל את סדר הגודל של הלחץ, הטיה, טעינת משך, הלחות בעור, טמפרטורה, ופוגעות פגיעה עור כללי היגיינה. ישנם גם גורמים מערכתית כי תפקיד, כגון הגופני הכללי, עצם, מורפולוגיה רקמת שריר, כוח4, גיל החולה, אמצעי hematological, מגדר גורמים אפילו הסוציו-אקונומי, כולל מצב משפחתי, השכלה, הכנסה4,5.
הטיפול של מוגלה ומניעת נותרו אתגרים משמעותיים בחולים SCI. חולים SCI לפתח מוגלה ~ 30-40% של המקרים, עם קצב re-מופע של 60-85%, כנראה עקב רקמת צלקת חלשה וחוסר תחושה מגן1. לפיכך, מוגלה מובילה לעיתים קרובות אשפוז מחדש של חולים SCI, בסך הכל מהווים נטל כלכלי משמעותי (80% יותר לעומת SCI בלבד) מערכת הבריאות5,6,-7,-8,-9 , 10.
לפי מיטב ידיעתנו, היו מחקרים לא בהגדרות ניסוי מבוקר כדי לחקור את ההשפעה של מדע בדיוני על תהליך הריפוי PU בשל היעדר בדגמים בעלי חיים מסוימים. כאן, מתואר דגם העכבר הרלוונטית קלינית הדירים של פו בעור. מודל זה יכול לשמש כדי ללמוד את הדינמיקה של תחילת PU וריפוי הבאים, כמו גם לבחון גישות טיפוליות אפשריות כדי למנוע פוליאורטן או לשפר את פו ריפוי בהקשר של הפוליטיקה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לטיפול בבעלי חיים וכל הניתוחים בוצעו לפי פרוטוקול אושרה על ידי רוטגרס אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים שימוש הוועדה. עכברים הואכלו בתזונה רגילה ומים ad libitum.
1. הכנת וכלי ניתוח כירורגי
- לחטא את ניתוח וכלי ניתוחי ב החיטוי.
- לנקות שולחן הניתוחים כירורגית עם 70% אתנול וחם כרית החימום כדי 37 מעלות צלזיוס.
- הניחו כרית החימום על שולחן הניתוחים, לכסות אותו. עם וילונות כירורגי סטרילי.
הערה: בכל ההליכים הישרדות, הטכניקה "לא לגעת" משמש כאן כדי לשמור על עקרות.
2. הכנת חיות וביצוע Laminectomy בעמוד השדרה את T9-T10
- להביא עכברים (Balb/c) זכר בן שבוע-10 למבוגרים. לגרום הרדמה של כל בעל חיים באמצעות התחלה של משאף עם 5% איזופלוריין ולאחר מכן להקטין ל 2-3% כדי לשמור על הרגעה עד לתום ההליכים.
- לאשר הרדמה מלאה על ידי העלאת אין תגובה גירוי nociception זנב/כפה קמצוץ המושרה.
- לגלח את השיער מעל dorsum (ראש אל הזנב) קוצץ חשמלי, ולאחר מכן החל את קרם depilatory (3 דקות) כדי להסיר את השיער הנותר. לבסוף, לשטוף את dorsum עם זורמים מים/רטוב לשפשף, ולחזור החיות לכלובים.
הערה: הדבר נחוץ למנוע גירוי נוסף אל העור ואל זיהום כימי בזמנו של העור ופצעו - למחרת, להחיל משחה אופטלמולוגיות קרניות להגן על העיניים מפני ייבוש במהלך ההליך הכירורגי ולאחר מכן, לשפשף את העור עם 3 ההכנות חלופי betadine סקראב ו- 70% אתנול.
- עם איזמל, לבצע חתך בעור (~1.0-1.5 ס מ) לאורך הקו האמצעי על הגב ברמה של חוליות T8-טי12.
הערה: הרמה של חוליות מזוהה על ידי חזרה ספירת החוליה מ- T13 באמצעות המיקום של הצלעות צף התואמים ל- T13 חוליה11,12. - נקה את רקמת השומן התת עורית כדי לקבל גישה אל השרירים paraspinal, ואז לנתח אותם לאט כדי לחשוף את תהליכי קוצניים, סחוס בשני הצדדים.
הערה: לבצע הליך זה בזהירות רבה, כדי למנוע דימום עודף או לכל פגיעה בחוט השדרה, בשלב זה. - לבצע laminectomy לחשוף חוט השדרה (T9-T10 חוליות) על ידי בעדינות מתקלפת הנדן בעמוד השדרה באמצעות מלקחיים microdissecting.
הערה: לבצע את laminectomy כך עודף של חוט השדרה חשוף כדי להקל על היצירה של הפגיעה. בקבוצת הביקורת, מבוצע רק laminectomy.
3. ביצוע של הפגיעה בחוט השדרה מלאה T9-T10
- באמצעות מלקחיים, אבטח השדרה-T8 ומעלית למעלה כדי שיוריד את עקמומיות בעמוד השדרה.
- באמצעות מספריים בסדר, סעיף חוט השדרה בין החוליה T9, T10 כל הדרך עד הרצפה של תעלת השדרה, כדי להבטיח חיתוך מלאה.
- לאחר התבוננות להחיל חיתוך מלאה תחת מיקרוסקופ כירורגי, חתיכת שומן תת עורית מעל האתר laminectomy כדי לספק הגנה נוספת בעמוד השדרה לפני סגירת האתר כירורגית.
- לבסוף לסגור את הפצע, תפר את השרירים הבין-חולייתיים, fascia שטחית, באמצעות בתפר רצוף, ולאחר מכן סגור את העור באמצעות תפרים קליפים12.
- פוסט-SCI, לבחון את תנועת המעיים ביום הבא; עם זאת, ניהול על שלפוחית השתן על ידי פינוי שלפוחית השתן ידנית.
הערה: גודל העכבר באסו (BMS) יכולים להיות בשימוש כדי לעקוב אחר ההתקדמות של hindlimb שחזור פונקציונלי פוסט-SCI-יום 2, ואז שבועי, ראה משלים איור 111,12,13.
4. אינדוקציה של העור פצע לחץ לאחר SCI מלאה
- מיד לאחר הניתוח SCI, לסבן את הגב של החיה עם betadine ו- 70% אלכוהול.
- עבור משחק פאזל להלן האתר SCI, להזריק בעור הגבי ליד עצם העצה, נפח קטן מאוד (10 µL) של 0.125% נמשך פתרון באמצעות מחט 25 גרם ב ס ~0.5-1.0 קו מקביל מקומות רחוקים, אליפסה סביב האתר יישום מגנט.
הערה: עבור משחק פאזל מעל האתר SCI, להזריק בעור הגבי ליד האזור צוואר הרחם. - בעדינות הרם קיפול העור בחלק האחורי של העכבר, כריך זה בין 2 דיסקים מגנטי (5 × 12 מ"מ קוטר, 2.4 g, כוח מגנטי 3800 גר') (איור 1). 11 , 12
- מיד לאחר יישום מגנט, החזרה חיות בכלובים יחיד להציב על גבי כרית החימום עד הכרה מלאה חזרה (איור 1).
- לאחר 12 שעות של יישום מגנט, בקלות ראש עזים ומתנגד חיה עם איזופלוריין ולהסיר את המגנטים. לקחת תמונה של האתרים הפצע, כדי להקליט את המראה הראשוני של פו (יום 0 זמן הצבע). לכסות את הפצע עם רוטב שקוף סרט (3 מ') כדי למנוע ייבוש או זיהום.
5. לאחר הניתוח טיפול בבעלי חיים, המתת חסד, אוסף רקמה עבור כפפות
- מיד לאחר הניתוח, להחדיר את החיה 1 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% subcutaneously לטיפול בהתייבשות.
- Subcutaneously להזריק הבופרנורפין-SR (1 מ ג/ק ג) מיד על שיכוך כאבים.
- מזריקים subcutaneously בעלי חיים meloxicam יומי (1 מ"ג/ק"ג), צפאזולין (50 מ"ג/ק"ג 3-7 ימים), ואת פינוי שלפוחית השתן ידני מדי יום פעמיים.
- מקום חיות בכלובים יחיד לספק מזון נגיש, מים ad libitum. עכברים עם מדע שלם ניתן ללכת באמצעות forelimbs שלהם, הגישה של מזון ומים ללא קשיים כל.
- הסר כירורגיים 7 ימים לאחר הניתוח SCI.
- בנקודות הזמן הרצויים לאחר SCI ופצעו העור, המתת חסד בבעלי חיים על ידי שאיפת2 CO (3-5 דקות), בהתאם להנחיות AVMA על המתת חסד14.
- לאסוף דגימות עור פצוע, לתקן בפורמלין 10% במשך 24 שעות ולאחר מכן לאחסן ב- 70% אתנול ב 4 ° C עד חלוקתה.
- כדי לעבד רקמות, להטביע פרפין וצור מקטעים דק (5 מיקרומטר) מיקרוטום. כתם ועם hematoxylin אאוזין (H & E) כדי להמחיש את רקמת מורפולוגיה (איור 3). ללימודים אימונוהיסטוכימיה (איור 4), כתם למקטעים באמצעות נוגדנים המתאימים עבור Ki67 (הפצה), CD31 (אנגיוגנזה), ואני אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA) כפי שמתואר קומאר ואח12
הערה: התמונה ניתוח תוכנה ניתן לכמת תכונות התמונה12.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה יוצר משחק פאזל בסביבה של הפוליטיקה מלאה בקצרה (כמופיע באיור1), עכברים כל עם או בלי SCI מלאה נסבל את המגנטים. טוב מאוד, אשר נותרו למיקום המקורי שלהם במשך 12 שעות (דמויות 1 ג, 1 ד, 1f, 1 h המלא ). כל העכברים פיתחו שני פצעים עגולים המופרדים באמצעות גשר של רקמה נורמלית (איור 1e, 1 g, 1i). התגובה הראשונית wounding היה דומה אצל עכברים ללא SCI (איור 1e), או עם SCI מתחת האתר SCI ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול במחקר זה מתאר מודל ניסיוני הרומן של מוגלה כדי להעריך את ההשפעה של מדע בדיוני על ריפוי הפצע. העור מוגלה היו המושרה באמצעות יישום 12 שעות של שני 12 מ מ, קוטר דיסק מגנטים על קיפול בעור הגבי, להגדיר מעל או מתחת האתר SCI. הנתונים מציגים SCI מאיטה ריפוי הפצע העור בעכברים. חשוב לציין, תצפיות אלה נעשו במיוחד פצעי העור מתחת לרמת העצבוב של מרכז הסטטיסטיקה, כמו פצעים עשה מעל הרמה SCI, וכך זה נשאר innervated, היה מושפע במידה רבה בדפוס הריפוי שלהם בהשוואה לעכברים ללא-SCI.
פרוטוקול PU המתוארים בזאת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו מומן בחלקו על ידי הנציבות ניו ג'רזי על חוט השדרה מחקר (CSCR15IRG010), מחלקת ההגנה של ארצות הברית (SC160029) של ייל המחלקה של ניתוח Ohse גרנט תכנית המחקר. אנו מודים O' שון לירי מן המרכז קק W.M. שיתוף פעולה מדעי המוח, רוטגרס לקבלת סיוע טכני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מגנטים | מאסטר מגנטקס, בע"מ, קאסל רוק, CO | CD14C | 3800 גרם עכברי כוח מגנטי |
| דיאטה סטנדרטית | PMI תזונה בינלאומית, ברנטווד, מיזורי | גלולת מזון סטנדרטית | |
| איזופלורן | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | מק"ט 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | תוכנה לניתוח תמונות | |
| BETADINE פילינג כירורגי HENRY | SCHEIN בריאות בעלי חיים | ||
| משחת עיניים | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | מק"ט 008897 | |
| NAIR-Hair Remover Lotion | Church & דווייט ושות', בע"מ פרינסטון, ניו ג'רזי | ||
| הזרקת ELOXIJECT (מלוקסיקם) | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | מק"ט 049755 | 5 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ל |
| צפזולין נתרן | HENRY SCHEIN בריאות בעלי חיים | מק"ט | 054846 1 גרם, בקבוק 10 מ"ל |
| בופרנורפין-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0.9% הזרקת נתרן כלורי USP | BRAUN, אירווין, CA | S8004-5384 | |
| 10% פורמלין ניטרלי חוצץ | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C עכבר זכר | צ'ארלס ריבר מעבדה., ווילמינגטון, MA | 28 | |
| מוליך כותנה סטרילי | פוריטן, גילפורד, ME | מק"ט#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה | 12040-01 | |
| תפר כירורגי, ארה" | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 101-2636 |
מקורות
- Rappl, L. M. Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing. International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).
- Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. Animal models in pressure ulcer research. The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).
- Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).
- National Pressure Ulcer Advisory Panel. Prevention and Treatment of Pressure Ulcers: Clinical Practice Guideline. , Cambridge Media. Osborne Park, Western Australia. (2014).
- Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries. Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).
- Krause, J. S. Skin sores after spinal cord injury: relationship to life adjustment. Spinal Cord. 36 (1), 51-56 (1998).
- Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. Pressure ulcers: more lethal than we thought? Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).
- Kruger, E. A., Pires, M., Ngann, Y., Sterling, M., Rubayi, S. Comprehensive management of pressure ulcers in spinal cord injury: current concept and future trends. The Journal of Spinal Cord Medicine. 36 (6), 572-585 (2013).
- Lala, D., Dumont, F. S., Leblond, J., Houghton, P. E., Noreau, L. Impact of pressure ulcers on individuals living with a spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (15), 2312-2319 (2014).
- Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury. Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers. Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models. Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).
- Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois, USA. (2013).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
