מאמר שיטה

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58216

⸱

6 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

תקציר

מספר מצבים פתולוגיים של העין משפיע על הפונקציונליות ו/או ההישרדות של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). אלה כוללים כמה צורות של רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). טיפול בתאי הוא אחד אסטרטגיות טיפוליות המבטיחים ביותר המוצע כדי לרפא מחלות אלו, עם עידוד כבר תוצאות ראשוניות בבני אדם. עם זאת, שיטת ההכנה של השתל יש השפעה משמעותית על תוצאות תפקודי שלה בתוך vivo. אכן, תאי RPE הושתל כמו השעיה תא מתפקדים פחות מאשר אותם התאים המושתלים כמו רקמת רשתית. במסמך זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור מהנדס RPE רקמות, שלה לקראת ההשתלה ויוו . תאי RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושי הם נזרע על תמיכה ביולוגית, קרום מי השפיר אנושי (חזיר). לעומת פיגומים מלאכותי, תמיכה זו יש את היתרון של בעל קרום המרתף קרוב הממברנה של ברוך שבו תאי RPE אנדוגני מצורפות. עם זאת, מניפולציה שלה אינה קלה, פיתחנו מספר אסטרטגיות שלה culturing הנכונה והכנה הרכבה בתוך vivo.

מבוא

RPE חיונית הישרדות, הומאוסטזיס של photoreceptors אליו היא משויכת באופן הדוק1. מספר מצבים פתולוגיים לשנות פונקציונליות שלה ו/או הישרדות, כולל RP ו- AMD.

RP היא קבוצה של מוטציות monogenic בירושה המשפיעות על הפונקציות של photoreceptors או תאי RPE או שני2,3. ההערכה היא כי מוטציות המשפיעות באופן ספציפי את RPE תאים חשבון עבור 5% של RP2. AMD היא תנאי אחר שבו השכבה RPE היא שונה, אובדן ראייה בסופו של דבר מרכזי מוביל. AMD נגרמת על ידי פעולת הגומלין המורכבים בין גורמים גנטיים וסביבתיים, ומשפיעה על קשישים4,5,6. על פי התחזיות, AMD יהיה נוגע 196 מיליון חולים ברחבי העולם על ידי 20207. בהפרעות אלה, אין תרופה יעילה קיימת, באחת האסטרטגיות הציע השתלת תאי RPE חדשים כדי לפצות על המלח/מתפקד שישנו RPE תאים8.

המצב של ניסוח של המוצר הסופי כדי להיות הושתל חיונית כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר תפקודית. תאי RPE להזריק לפי השעיה תא, למרות היותו שיטה קלה וישירה של משלוח, להעלות חששות לגבי שלהם הישרדות, אינטגרציה, פונקציונליות9,10,11,12 , 13. מדענים מפתחים יותר כעת ניסוחים מורכבים כדי לספק מהונדסים רקמת רשתית9,13,14,15,16. בהקשר זה, פיתחנו שיטה מקורית ליצירת במבחנה רקמות RPE שיכול לשמש עבור השתלת9.

בנקים תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (ES) נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חלופה RPE תא בנקים ממקורות שונים תא (תאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם, תאי RPE העיקרי, וכו ') ו הבדיל בשיטה שונה מתאימים גם עבור פרוטוקול זה. היא כוללת התמיינות מכוונת פרוטוקולים בעזרת ציטוקינים ו/או מולקולות קטנות17,18,19,20,21,22.

כדי להיות מושתלים, להכין את רקמות מהונדסים על גרדום. בשנים האחרונות, פיגומים שונים פותחו בהתבסס על פולימר או על מטריצה של מקור ביולוגי13,23,24. כאן, המצע הביולוגי משמש החזיר, אבל מצעים אחרים, כמו ממברנות ברוך חשופה, ניתן ליישום. השיטה המתוארת במסמך זה יש את היתרון של שימוש לפיגום הביולוגי שהוא רלוונטי יותר לסביבה הטבעית RPE.

ES האדם הנגזרות תא תאי RPE מתורבתים לפחות 4 שבועות על מנת להיות מאורגן באופן מלא כמו טפט המרוצף. בשלב זה, האפיתל שהושג הוא פונקציונלי, מקוטב9. לבסוף, ככל רקמה זו מתקמט בקלות, זה מוטבע בשכבה דקה של נשאית הידרוג לתת לזה עוד קשיחות ואלסטיות וכדי להגן עליו במהלך ההליך הזרקה. מוצר זה מאוחסן אז ב 4 ° C עד הרכבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החומרים האנושי בשימוש פרוטוקול זה שימשו על פי תקנות האיחוד האירופאי. הקו תא ES האדם השתמשו במחקר זה היה נגזר של העובר ייחודי. השניים מי תרם העובר נמסר באופן מלא, נתנו את הסכמתם לקבלת תרומה אנונימית. קו תא קליני-כיתה ES האדם היה נגזר מן העובר הזה, הפקידה, מוסמך, מתועדים כהלכה על ידי רוזאלין תאים (בריטניה). ירכי היו רכש בתנאים סטריליים במהלך ניתוח קיסרי של אמהות חתמו על הסכמה מדעת לתרומה השליה לפי הקווים המנחים של בית החולים (APHP, Hôpital סנט לואיס).

1. הכנת ריאגנטים ומדיה תרבות

  1. הכנה של המדיום התרבות תאי RPE
    1. כדי להכין המדיום התרבות תאי RPE, להוסיף סרום 4% תחליף (20 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל), 1,000 x מדולל מרקפטואתנול (500 µL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל) ו 1% Eagle′s המינימום חיוני בינוני (מאמ) חומצות אמינו שאינן הכרחיות פתרון (5 מ"ל הסופי נפח של 500 מ ל) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז גבוהות (475 מ עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל).
  2. הכנה של המדיום תחבורה/שימור
    1. כדי להכין אמצעי תחבורה/שימור, להוסיף 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (5 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) CO2-עצמאית בינוני (495 mL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) ולשמור אותו ב 4 º C.
  3. Resuspension של האנזים thermolysin
    1. הכנת פתרון מניות של thermolysin
      1. כדי להכין פתרון מניות של thermolysin, להפשיר את האבקה thermolysin, שהיה מאוחסן ב-20 ° C, בטמפרטורת החדר.
      2. הפעילות האנזימטית מתרחשת עשויה להיות משתנה האצווה כדי אצווה, לחשב בהתבסס על האישור של ניתוח סיפק את האבקה thermolysin של אצווה כדי לשמש את הפעילות הזו. לחלק "פעילות Neutral פרוטאז פרוטאז מחושב = ANPC" (המצוין באישור של אנליזה) על ידי 181 (שהוא משקל מולקולרי של טירוזין). התוצאות המתקבלות מקביל הפעילות האנזימטית מתרחשת הכולל של האבקה שסופקו thermolysin (U/מבחנה).
      3. להכין פתרון מניות ב- 200 U/mL על-ידי הוספת נפח המים המקביל סך הפעילות האנזימטית מתרחשת (U/מבחנה) מחולק 200 (U/mL).
      4. להמיס את האנזים על-ידי pipetting המים שנוספה למעלה ולמטה. מערבולת הפתרון עבור 30 s ולבדוק האם האבקה לחלוטין הושעה. Pipetting יותר יהיה צורך פירוק מלא.
      5. Aliquot הפתרון מניות ואחסן אותו ב-20 ° C.
    2. הכנת הפתרון עובד של thermolysin
      הערה: הפתרון thermolysin צריך להיות מוכן ביום של הטיפול החזיר.
      1. להפשיר את aliquots מלאי של thermolysin-200 U/mL המאוחסנים ב-20 ° C. לדלל את הפתרון מניות 200 ב- x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על מנת לקבל פעילות אנזימטי הסופי של 1 U/mL. להכין 40 מ ל לטיפול תיקוני חזיר 1 – 4.
      2. לסנן את הפתרון thermolysin דרך מסנן 0.2 µm לכהן להשתמש.
  4. Resuspension של ג'לטין
    1. הכנה של 20% ג'לטין הפתרון של רחוב
      הערה: 20% ג'לטין הפתרון של רחוב עשוי להיות מוכנים למעלה 1 שבוע לפני השימוש.
      1. לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 ° C באמבט מים למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 10 גר' ג'לטין עד 40 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.
      2. להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. מערבולת כל 10 דקות כדי homogenize את הפתרון.
      3. לאחר הפתרון הוא הומוגני, להוסיף 4 מ"ל של הפתרון הג'לטין 20% ארבע המנות תרבות 6 ס מ. להימנע בועות. להוסיף סרט פרפין פלסטיק כדי להגן על המנות, ולאפשר את הפתרון שבמהלכו ב 4 º C.
    2. הכנה של 8% ג'לטין פתרון
      הערה: הפתרון 8% ג'לטין עשוי להיות להכין יום לפני השימוש ומאוחסנים ב 4 º C.
      1. לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 4 גר' ג'לטין עד 46 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.
      2. להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. להוסיף סרט פרפין פלסטיק להגן על הצינור ולשמור אותו באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C אם הוא רוצה לשמש באותו היום, או לשמור אותם ב 4 ° C אם זה לשימוש מאוחר יותר.

2. Thermolysin טיפול של קרום מי השפיר אנושי

  1. שטיפת קרום מי השפיר אנושי
    1. יש ירכי שסופק כמו חתיכות קטנות (כ 30 מ"מ x 30 מ"מ) קבוע לפיגום ניילון, גם כבר ב 4 ° C ב- PBS או קפוא. אם סופק קפוא, להפשיר את הקרומים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות.
    2. לשטוף את הממברנות:
      1. מקום 1 – 4 ממברנות בבקבוק 250 מ ל המכילה 80 מ ל- PBS. השתמש בקבוקים רבים כנדרש.
      2. לנער את כל בקבוק ב שייקר צלחת במהירות גבוהה למשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את PBS. מוסיפים 80 מ של PBS, אני חוזר.
  2. טיפול Thermolysin
    1. להוסיף 40 מ של הפתרון עובד של thermolysin (1 U/mL) עבור כל בקבוק המכיל את הממברנות (1-4 ממברנות לכל הבקבוקים; עד 3 בקבוקים בכל פעם).
    2. לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 rpm ולאחר מכן מערבולת אותם 30 ס חזור על 1 x.
    3. לבטל את הפתרון thermolysin ולהוסיף 80 מ ל- PBS.
    4. לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 סל ד. למחוק את PBS ולהוסיף 80 מ ל- PBS. חזור על 3 x.

3. קיבוע של קרום מי השפיר אנושי על הוספה תרבות

  1. להשתמש מלקחיים זמן סטרילי (זה יכול להגיע לתחתית הבקבוק) כדי להסיר את ירכי, אחד אחד, ולהעביר כל חזיר לצלחת תרבות 10 ס מ המכיל 10 מ"ל ל- PBS.
  2. ב- 10 ס מ תרבות תבשיל חדש המכיל 10 מ"ל ל- PBS, מקום אחד בקרום עם הניילון פונה כלפי מטה. ניתוק שני הקליפים ארבע המשמשים כדי לתקן את הממברנה כדי ניילון.
  3. הכנס את הטבעת קטנים יותר של תרבות הקדמי בין את הניילון הקרום.
  4. ודא כי הקרום מכסה לחלוטין את הטבעת קטנים יותר. קליפ החלק השני של תרבות הקדמי על גבי הקרום. קרום המרתף של הבשר המעושן פונה מעלה, בתוך תותב תרבות. לנתק את הקליפים שתי האחרונות.
  5. חותכים, עם מספריים סטרילי, עודף של הקרום החוצה תותב תרבות במידת הצורך. באמצעות מלקחיים, להעביר את הקרום קבוע את תותב תרבות על צלחת 12-ובכן, להוסיף PBS, ולאחסן את הצלחת באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.
  6. חזור על פעולות אלה (מתוך שלב 3.2-3.5) עם אחרים בקרום.

4. מפשיר, זריעת תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי

  1. הפשרתו של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית
    1. הבנק תאי RPE מוקפא-1 מיליון תאים לכל מבחנה קריוגני בחנקן נוזלי. להפשיר כמה בקבוקונים קריוגני כנדרש (תאים 350,000 הם נזרע לכל ממברנה).
    2. הכן צינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום RPE לכל מבחנה ההקפאה. ברגע מופשר הוא המבחנה, להעביר כל שפופרת התאים. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.
    3. Homogenize (פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend תאי RPE המדיום), קח 10 µL של הפתרון תא, להעביר אותו צינור 1.5 מ ל. להוסיף 10 µL של trypan blue. מקום 15 µL של פתרון זה כדורים הספירה, אז לספור את מספר התאים קיימא (לא נצבעים בצבע כחול) תחת מיקרוסקופ עם יעד X 4. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.
    4. בינתיים, centrifuge הצינורות 15 מ"ל ב x 110 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend התאים-תאים למ"ל 700,000.
  2. זריעה של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית לתוך קרום מי השפיר אנושי
    1. הסר את לוחית 12-ובכן המכיל את הממברנות של החממה.
    2. מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 500 µL של התליה תא מוכן בשלב 4.1.4 במרכז תותב תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מדיום RPE מחוץ הכנסת תרבות (בתוך הבאר). חזור על הממברנות אחרים.
    3. מקם את הצלחת 12-ובכן המכיל את הקרומים בחממה.

5. תחזוקה של תרביות תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי

  1. לחדש את המדיום 2 x בשבוע, בדרך כלל בימי שני ושישי, ולפחות עד ליום 30 של התרבות.
  2. האחות המדיום בתוך ומחוץ את תותב תרבות במשך כל וחידוש זה בינונית טרייה (1 מ"ל בחוץ תותב תרבות ו- 500 µL בפנים). מקם את הצלחת בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.

6. הכנה של התיקון אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת

הערה: החל ביום 30 של התרבות, הרקמה הוא מוכן השתלת.

  1. חם הפתרון 8% ג'לטין באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות למלא התא הפנימי של. vibratome עם CO קר2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C).
  2. למקם את הבלוק הג'לטין 20% vibratome.
    1. קח את הצלחת תרבות 6 ס מ המכיל את הבלוק של 20% ג'לטין מהמקרר. באמצעות אזמל, לגזור בלוק 5 ס מ x 5 ס מ. הדבק את הצד העליון של גוש לתמיכת עם דבק מגע, דבק או למקבילה שלה.
    2. מקום להב חדש vibratome.
    3. להתאים את רמת הרחוב עד שהיא באותה רמה של הלהב גילוח.
    4. למלא את האמבטיה סביב התמיכה CO טריים2-בינוני עצמאית ב 4 º C. חותכים את גוש עם vibratome באמצעות במהירות בינונית עד לבלוק חותכים בצורה אחידה, המוביל משטח חלק. להגדיר את המיקום 0.
    5. האחות המדיום מסביב לבלוק של ג'לטין עד שהכל יבש לחלוטין, ולאחר מכן לקחת את הצלחת. ובכן 12 תרבות המכיל הרקמות מן החממה ב 37 º C.
    6. בזהירות באמצעות מלקחיים, פתח את תותב תרבות מעל הרחוב ג'לטין. חותכים, עם המספריים, כל חלקי ממברנות שאינן מכילות תאים (מחוץ לזירה שבה התאים היו לא תרבותי). האחות המדיום שיורית כולו.
    7. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון 8% ג'לטין נוזלי ב 37 ° C על מנת לכסות את הקרומים. הסר בזהירות את העודפים. המתן 5-8 דקות כדי לאפשר הג'לטין לגבש.
    8. להוסיף CO טריים2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C) לאמבטיה עד מכוסה הקרום.
    9. חותכים, עם vibratome במיקום של-100 מיקרומטר, עם מהירות בינונית, שנותרו על אופן הפעולה של הרחוב. בסוף המקטע, יש להקפיד לשמור על הכיוון של הרקמה.
    10. עם איזמל, לחתוך פינה כדי לזהות את הכיוון של המקטע.
    11. לאסוף את הקרום נעוץ ג'לטין עם מרית ולמקם אותו בצלחת 6-ובכן מלא עם המדיום שימור ב 4 מעלות צלזיוס, עד הרכבה זה לתוך העין הנמען.
    12. בזמנו של השתלת, להתאים את גודל השתל בהתאם לגודל העין הנמען תחת מיקרוסקופ כירורגי (3-1 על חולדות, 10 – 15 מ מ2 קופים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ירכי מכילים שכבת האפיתל יש להסיר לפני זריעת תאי RPE. טיפול אנזימטי של הקרום מבוצע עם thermolysin תחת רועדת. על מנת לא כדי לא לאבד את הקוטביות של הקרום (האפיתל היא מצד אחד), הוא קבוע על תמיכה הרכב אשר יכול להיות שונה, תלוי הספק (איור 1 א'). בדוק את הידבקות של הקרום לתמיכה שלה בשלב זה ולהוסיף קליפים במידת הצורך. בזמנו של קיבוע תותב תרבות, לעבוד בזהירות כדי להימנע לעשות חורים הקרום ולשמור את הקוטביות שלה עם קרום המרתף פונה כלפי מעלה (איור 1B...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנחנו תיאר שיטה התרבות של תאי RPE וביום לפיגום הביולוגי שלה לקראת ההשתלה במודלים של בעלי חיים. אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הוא שמירה על הכיוון של הבשר לאורך כל ההליך עד ההכללה שלו לתוך הג'לטין. אכן, האפיתל מקורית של הקרום יוסר ולא קרום המרתף שלו הופך להיות חשוף9. תאי RPE חייב להיות נזרע על גבי קרום המרתף הזה. על הכנה להטבעת ג'לטין, חשוב לעבוד עם כל המוצרים בטמפרטורה מוגדרת. אכן, ג'לטין יש את המאפיין להיות נוקשה 4 ° C, נוזלי גוף טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס)9. אם הטמפרטורה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אוליבייה Goureau הוא הממציא על ממתינים פטנטים הקשורים הדור של תאים ברשתית מתאי גזע pluripotent אנושי. המחברים האחרים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות ג'רום Larghero, ואלרי Vanneaux (Hôpital סנט לואיס, פריז, צרפת) לקבל את התשומה שלהם במהלך את ההגדרה של השיטה המתוארת כאן.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Médicale רשרש [תכנית הנדסת ביו - DBS20140930777] ומן LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73] אוליבייה Goureau, קריסטל Monville. זה נתמך על ידי NeurATRIS, המחקר translational תשתית (Investissements d'Avenir) עבור biotherapies מדעי המח [ANR-11-INBS-0011], INGESTEM, התשתית הלאומית (Investissements d'Avenir) הנדסה pluripotent ו הבדיל בתאי גזע [ANR-11-INBS-000] כדי קריסטל Monville. כרים בן M'Barek נתמכה על ידי מלגות Stempole דים ו LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73]. גזע הוא חלק של המכון Biotherapies מחלות נדירות נתמך על ידי les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM)-Téléthon.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ארון בטיחות ביולוגית סטריליTechGen Internationalלא ישים
מערכת פינוי פסולת נוזלית לשאיפהVacuubrandBVC 21
CO2 נשלט +37  ° חממת תאי CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  ומיקרו; פיפטה L: P200גילסוןF144565
1  פיפטה מ"ל: P1000גילסוןF144566
פיפט עזרדראמונד75001
+4  ° C מקררLiebherrלא ישים
VibratomeLeicaVT1000S
מספריים עדיניםWPI501758
מלקחיים (x2)WPI555227F
אמבט מיםמענק subaqua proSUB6
איזון דיוקSartoriusCP225D
צנטריפוגהEppendorff5804
מיקרוסקופאולימפוסSC30
שייקר נדנדה אופקיIKA-WERKEIKA MTS 214D
מערבולתVWRLAB DANCER S40
אזמל חד פעמיWPI500351
סרט פרפין מפלסטיקVWRPM992
0.200 ומיקרו; m מסנן מזרק חד פעמיSARTORIUS16532
מזרק ללא מחט 50 מ"לDutscher50012
בקבוקים 250 מ"לDutscher28024
15 מ"ל צינורות בז סטרילייםDutscher352097
50 מ"ל צינורות בז סטרילייםDutscher Dutscher352098
להכניסC00001N
60  מ"מ תרבית תאים: B6Dutscher353004
12 באר צלחת תרבית תאיםקורנינג3512
6 בארותקורנינג3506
סכיני גילוחטד פלה, בע"מ121-9
דבק ציאנואקרילטקסטורמה3178040670105
PBS 1x (500  mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoethanol (50  mM)Invitrogen31350-010
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen15140122
CO2 מדיום בלתי תלויGIBCO18045-054
ג'לטיןMERCK104078
קרום מי שפיר אנושיבנק רקמות בית החולים סנט לואיס (פריז, צרפת)לא ישים
סכיני גילוח

מקורות

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
  5. Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
  6. Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
  7. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  8. Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
  9. Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  10. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  11. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  12. Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
  13. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  14. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
  18. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  19. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  20. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
  21. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  22. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  23. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  24. Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669(2015).
  25. Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
  26. Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968(2012).
  27. Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
  28. Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
  29. Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
  30. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  31. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
  32. Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
  33. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  34. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  35. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  36. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  37. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  38. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים