מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום

סיכום

תעלות יונים Mechanosensitive נלמדים לעתים קרובות במונחים של זרימת נוזלים/הטיה רגישות כוח עם תיקון-קלאמפ הקלטה. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, התוצאה על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מספקים שיטות מניעת ותיקון שגיאות כאלה עם בסיס תיאורטי.

תקציר

זרימת נוזלים היא גירוי סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזלים. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל/הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, רגולציה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating יכול לתרום באופן ביקורתי. לכן, זרימת נוזל/הטיה הרגישות בכוח של תעלות יונים נחקרה בטכניקה תיקון-קלאמפ. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, תוצאות ופרשנות של נתונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מציגים ראיות ניסיוני ותיאורטי עבור שגיאות הקשורות זרימת נוזל מספקים שיטות להערכת, מניעת של תיקון שגיאות אלה. שינויים בצומת פוטנציאלי בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה נמדדו עם פיפטה פתוח מלא עם 3 מ' אשלגן כלורי. זרימת נוזלים יכול ואז shift mV פוטנציאליים כדי כ 7 את צומת נוזלי/מתכת. לעומת זאת, על ידי מדידת משמרת מתח הנגרמת על ידי זרימת נוזלים, אנחנו מעריכים את ריכוז יון בשכבת הגבול unstirred. במצב סטטי, ריכוז יון האמיתי סמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה או יון הערוץ לים על פני קרום התא יכול להגיע נמוך כמו כ- 30% זה מצב זרימה. הנחת agarose של 3 מ' אשלגן כלורי גשר בין האלקטרודה נוזל והפניה רחצה עשוי למנוע את הבעיה של צומת פוטנציאלי הסטה. עם זאת, האפקט שכבה unstirred סמוך פני קרום התא לא היתה אפשרות לתקן בדרך זו. כאן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ, המדגיש את החשיבות של שימוש agarose של מלח-גשר תוך כדי לימוד תקנה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים יון. לכן, גישה חדשנית זו, אשר לוקח בחשבון את ריכוזי יונים בשכבת הגבול unstirred אמיתי, עשוי לספק תובנה שימושי על עיצוב ניסיוני ועל פרשנות הנתונים הקשורים ויסות נוזלים גזירה של תעלות יונים .

מבוא

זרימת נוזל זה הסימן סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזל נוזל הטיה תלויי-כוח וסקולרית שיפוץ ופיתוח^{1,2, 3,4,5}. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, הוא האמין כי תקנה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating עשוי לתרום באופן ביקורתי תגובות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל^{5 , 6 , 7 , 8}. לדוגמה, הפעלת המתקן פנימה אנדותל Kir2.1 ו- Ca^{2 +}-activated K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) ערוצי לאחר Ca^{2 +} זרם על ידי זרימת נוזל כבר הציע לתרום נוזל זרימה-induced vasodilation^6,7,8. לכן, רבים תעלות יונים, ערוצי במיוחד מופעל מכנית או - עכבות, נחקרו מבחינת זרימת נוזל/הטיה רגישות כוח עם^{9,10 6,}טכניקה תיקון-קלאמפ ^{, 11}. עם זאת, בהתאם פרוטוקול נסיוני שבוצעה במהלך תיקון-קלאמפ הקלטה, תוצאות ופרשנות של הנתונים על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים^10,11.

מקור אחד של חפצים הנוצרות על-ידי זרימת נוזל בהקלטה תיקון-קלאמפ היא מצומת פוטנציאלי בין נוזל אמבטיה Ag/AgCl הפניה אלקטרודה¹¹. בדרך כלל הוא האמין כי הצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה היא קבועה כמו ריכוז Cl^– של נוזל רחצה נשמרת יציבה, שוקל את התגובה הכימית בין הפתרון רחצה Ag/AgCl אלקטרודה להיות:

Ag + Cl^–↔ AgCl + אלקטרון (e^–) (משוואה 1)

עם זאת, במקרה שבו התגובה הכוללת אלקטרוכימי בין פתרון רחצה אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (משוואה 1) ממשיך משמאל לימין, ריכוז Cl^– של נוזל רחצה צמוד Ag/AgCl הפניה אלקטרודה (שכבת גבול unstirred^12,13,14,15) עשוי להיות נמוך בהרבה מאשר בעיקר רחצה פתרון, אלא אם כן מספיק תחבורה convectional מובטחת. באמצעות אלקטרודה Ag/AgCl ישנים או לא אידאליות הכלרה לקוי של Ag עשוי להגביר סיכון כזה. החפץ הקשורות זרימת נוזל על האלקטרודה הפניה, למעשה, יכול להיות מהכלל על-ידי פשוט הנחת גשר מלח agarose המקובלת בין נוזל רחצה לבין התייחסות אלקטרודה, מאז החפץ מבוסס על שינויים אמיתיים Cl^– ריכוז הסמוך ה Ag/AgCl אלקטרודה¹¹. פרוטוקול שהוצגו במחקר זה מתאר כיצד למנוע את השינויים אפשריות הקשורות זרימת צומת ולמדוד את ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred.

לאחר הנחת agarose של אשלגן כלורי גשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, יש גורם מכריע נוסף שיש לשקול: Ag/AgCl אלקטרודה רק כהפניה מתנהג כמו אלקטרודה Cl^– , תעלות היונים גם יכול לתפקד כמו אלקטרודה יון סלקטיבי. המצב של שכבת הגבול unstirred בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה מתעוררת במהלך תנועת יונים בין הפתרונות חוץ-תאית, תאיים דרך תעלות היונים ממברנה. זה מרמז כי יש להשתמש בזהירות כאשר לפרש ברגולציה של יון ערוצי על ידי זרימת נוזלים. כפי שפורט המחקר הקודם שלנו¹¹, התנועה של יונים דרך פתרון שבו הדרגתי אלקטרוכימי קיים יכול להתרחש באמצעות שלושה ייחודי מנגנונים: דיפוזיה, הגירה, הסעת חום, איפה דיפוזיה התנועה המושרה על ידי ריכוז הדרגתי, ההעברה היא התנועה מונע על ידי מעבר חשמל צבע, הסעת חום הוא התנועה באמצעות זרימת נוזל. בין המנגנונים האלה תעבורה שלוש, הסעת חום מצב תורם לרוב את תנועת יונים¹¹ (> 1,000 פעמים גדול יותר מאשר דיפוזיה או ההעברה תחת הגדרות תיקון הרגיל-קלאמפ). זה מהווה את הבסיס התיאורטי של הסיבה צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה יכול מאוד תחת תנאים שונים סטטי ו זרימת נוזל¹¹.

לפי ההשערה המוצעת לעיל, כמה תופעות facilitatory של זרימת נוזלים בערוץ יון הנוכחי ניתן להסיק מן המחודשת הכנת ריכוז יון האמיתי סמוך לים ערוץ על פני הממברנה (שכבת גבול unstirred) ¹⁰. במקרה זה, ההשפעות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל על יון ערוץ זרמי פשוט שהתעוררו מאירועים אלקטרוכימי, לא מן התקנון של gating ערוץ יון. רעיון דומה הוצע בעבר על ידי בארי ועמיתיו^12,13,14,15 בהתבסס על השיקולים התיאורטיים קפדני ועל ראיות, הידוע גם בשם השכבה unstirred או אפקט מספר תחבורה. אם כמה תעלות יונים יש מספיק מוליכות ערוץ אחד, מספיק זמן פתיחה-זמן לספק תחבורה מספקת שיעורי דרך הערוצים (מהירה יותר תחבורה תעריף של ממברנה מאשר על גבי המשטח ממברנה unstirred), אפקט בשכבת הגבול שעשויות להתעורר . לפיכך, התעבורה תלויי-הסעת חום יכול לתרום facilitations נוזל-זרימה-induced בסופו של דבר של יון הנוכחי^{10,12,13,14,15}.

במחקר זה, אנו שמים דגש על חשיבות באמצעות אגר או agarose מלח-גשר תוך כדי לימוד נוזל-זרימה-induced רגולציה של זרמי יונים. כמו כן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הסמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, הממברנה תעלות היונים. יתר על כן, הפרשנות תיאורטי של אפנון הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים ערוץ יון (קרי, הסעת חום השערה או שכבה unstirred התחבורה מספר אפקט) יכולה לספק תובנות בעלות ערך עבור עיצוב ופרשנות מחקרים על הטיה הכוח-ברגולציה של תעלות יונים. על פי האפקט תעבורה בשכבת הגבול unstirred מספר, אנו צופים כי יון זרמי ערוץ דרך כל סוגי הממברנה תעלות יונים ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים, באופן עצמאי את רגישותם ביולוגי לכוח הטיה זרימת נוזלים, אבל רק אם תעלות היונים יש מוליכות ערוץ אחד מספיק פתוח-זמן רב. צפיפויות הנוכחי של ערוץ יון גבוה יותר עשוי להגביר את האפקט unstirred בשכבת הגבול על פני קרום התא.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדי של אוניברסיטת Konkuk.

1. Agarose מלח גשרים בין פתרון אמבט Ag/AgCl הפניה אלקטרודה

הערה: Agarose 3 מ' אשלגן כלורי, מלח גשרים מיוצרים כאמור תיאר¹² עם הבדלים קלים.

1. היווצרות גשרים
   1. כיפוף צינורות נימי זכוכית אש כדי ליצור צורת U לפי הצורך. הקוטר הפנימי של נימי הדם צריך להיות גדול מספיק כדי להפחית את התנגדות סדרה בעת הקלטת הזרמים יון גדולים. צינורות בקוטר הפנימי 2-5 מ מ מקובלים בדרך כלל.
2. הכנת agarose 3 מ' אשלגן כלורי פתרון
   1. להכין 100 מ של 3 מ' אשלגן כלורי פתרון (1 מ' או 2 מ' הוא גם מקובל).
   2. שוקלים דור 3 של agarose.
   3. להמיס את agarose ב 100 מ של אשלגן כלורי (קרי, 3% agarose) על פלטה חמה בין 90 ל- 100 מעלות C.
3. טעינת הגשרים עם 3 מ' אשלגן agarose
   1. לטעינה קלה, לטבול את הגשרים זכוכית בצורת U הפתרון agarose-אשלגן כלורי.
      הערה: קל לחפור החוצה את הגשרים זכוכית אם הפתרון agarose-אשלגן כלורי מוכל במיכל רדוד ורחב.
   2. להשאיר אותם ללילה בטמפרטורת החדר (RT) עבור agarose לקבוע וכדי להקשיח.
   3. בזהירות לחפור החוצה את הגשרים זכוכית agarose-אשלגן כלורי-טעון מהמלח מוקשה/סט agarose-
4. אחסון הגשרים
   1. להכין כמות גדולה מספיק (קרי, 500 מ ל) של הפתרון אשלגן כלורי 3 מ' בבקבוק צוואר רחב.
   2. אחסן את הגשרים agarose מלח מוכן בבקבוק במקרר.

2. יישום בכוח גזירה זרימת נוזל לתאים תא מחבר תיקון-חובק למעקה

הערה: תרשים כללי של הגדרת ניסיוני תיקון-קלאמפ מוצג באיור1.

1. המקום מכולה עמוסה רחצה פתרון (גובה ונפח יש כבר למדוד) מעל תא תיקון-קלאמפ.
2. למלא את התא תיקון-קלאמפ הפתרון רחצה מאת suctioning הצינור.
3. כדי להפסיק את זרימת הנוזלים, קליפ השפופרת בצד המכל כדי לחסום את זרימת הנוזלים ולאחר מכן קליפ הצינור לצד היניקה כדי לעצור את היניקה באותו זמן. . זה התנאי שליטה "נייח"
4. כדי להחיל זרימת נוזל הטיה כוח, לפתוח שני צינורות בצדדים המכיל ולא שאיבה באותו זמן.
5. לפני או אחרי החלת הכוח הטיה זרימת נוזל התא, למדוד את קצב הזרימה ב- mL/min.
6. לחשב את קצב הזרימה על ידי מדידת הירידה בנפח נוזלים במשך זמן נתון.
7. קצב הזרימה נמדד, גיאומטריית לחדר הרחצה (מבנה), הכוח הטיה לתא שהחיל את זרימת הנוזלים צריך להיות מוערך (עיין בסעיף הדיון).
8. לחלופין, כדי לקבוע את קצב הזרימה (עבור השלבים 2.3-2.6), להשתמש משאבה זלוף. במקרה זה, להיות זהירים כדי להבטיח קבוע ולא זרימה פועמת.

3. מדידת שינויים בפוטנציאל צומת נוזלי-מתכת על ידי זרימת נוזל בין פתרון אמבט אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (איור 3 א)

1. השתמש Ag/AgCl אלקטרודה או גלולה, אשר זמין מן המוצרים מוכנות מראש, בלי הגשר מלח agarose.
2. היכונו של תמיסת מלח פיזיולוגית לחדר הרחצה (למשל, 143 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ₂PO NaH₄, 5 מ מ HEPES, MgCl 0.5 מ מ₂, CaCl 1.8 מ מ₂, 11 מ"מ D-גלוקוז; pH להתאים ל- 7.4 עם NaOH).
3. מניחים על פיפטה תיקון המכיל פתרון אשלגן כלורי 3 מ' בבית הבליעה כדי למזער את משמרת צומת פוטנציאלי בין פיפטה פתרונות הרחצה.
4. לתקן את מגבר מתח-קלאמפ למצב קלאמפ הנוכחי ("אני = 0" או "CC").
5. וישכח את הפוטנציאל ההיסט ההתחלתי, למדוד שינויי מתח המושרה על ידי תעריפים זרימה שונים.
6. כדי לוודא כי שינויי מתח הן פוטנציאל צומת נוזלי/מתכת, לבחון מחדש את ההשפעה של זרימת נוזלים על הפוטנציאל צומת באמצעות הגשר מלח agarose בין פתרון אמבט Ag/AgCl אלקטרודה.

4. ניסיוני אומדן ריכוז Cl אמיתי^– בשכבה Unstirred הסמוך Ag/AgCl אלקטרודה בתנאי סטטי (איור 3B)

1. התוצאות של שלב 3, לצייר את קשרי הגומלין פוטנציאל-ספיקה צומת, לאמוד את ערכו מקסימלי (קולח) של צומת shift פוטנציאליים על ידי קצב הזרימה העל-נוזל.
2. להכין פתרונות עם ריכוזים שונים של Cl (קרי: 50 ', ' 99 ', ' 147 ', 195, 288 מ מ של NaCl).
3. על-ידי שינוי של Cl^– הריכוז בנוזל רחצה, לצייר צומת פוטנציאלי-[Cl^–] הקשר. שים לב הקצב הנוזלים צריכה להיות קבועה וגבוהה מספיק (> 30 מ לדקה) כדי למנוע את הירידה של ריכוז Cl^– לזה של האלקטרודה הפניה Ag/AgCl סמוכים.
4. מן העקומות שני היחסים, להעריך את השינויים בריכוז Cl^– של משמרת פוטנציאליים צומת נמדד.

תוצאות

התא כולו תלויי-מתח Ca L-סוג^{2 +} ערוץ (VDCC_L) זרמי נרשמו ב עכברוש enzymatically התפזרו מצע המעי העליון עורקי נייטרלים, כפי שתואר לעיל¹¹. השריר עורקי היו דיאליזה עם פתרון פיפטה Cs-עשיר תחת תצורת ניסטטין מחורר עם פתרון רחצה ללא הקטיון כלט כדי להקל על הזרם הנוכחי דרך VDCC_L^11,16. קצר depolarizing רמפות מתח או שלבים מתח, על פוטנציאל החזקה של-70 mV, הוחלו שמעודדים את הזרמים VDCC

דיון

במחקר זה, הפגנו שיטה למדידת ריכוז Cl^– אמיתי בשכבה unstirred הסמוך האלקטרודה הפניה Ag/AgCl על-ידי קביעת לצומת נוזלי-מטאל פוטנציאלי עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ מלא של אשלגן גבוהה ריכוז. משמרת של צומת פוטנציאל השינוי בריכוז Cl^– בשכבת הגבול יכול לגרום כאשר מחליפים מ סטטי ותנאים של זרימת נוזל. פשוט באמצעות agarose של אשלגן כלורי גשר בין אלקטרודה הפניה נוזל רחצה יכול למנוע את שגיאות הקשורות ריכוז Cl^– או חפצים במהלך ההקלטה תיקון-קלאמפ.

מלבד הדגשת החשיבות של גשר המלח אגר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RC-11 תא אמבטיה פתוח	Warner Instruments, ארה"ב	W4 64-0307
Ag / AgCl גלולת אלקטרודה	מכשירי דיוק עולמיים, ארה"ב	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, ארה"ב	A9793
מגבר מהדק מתח	HEKA, גרמניה	EPC8
מגבר מהדק מתח	התקנים מולקולריים, ארה"ב	Axopatch 200B
משאבה נוזלית	KNF Flodos, שוויץ	FEM08