השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Summary

פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.

Abstract

Microscale אוטומטיות ריאקטורים (15 מ ל) יכול להיות כלי שימושי עבור מהנדסים תרבות התא. הם מאפשרים ביצוע בו זמנית מגוון רחב של תנאי הניסוי תוך מזעור פוטנציאלי תהליך השתנות. יישומים של גישה זו כוללים: שיבוט ההקרנה, משמרות טמפרטורה, pH, מיטוב התקשורת והן את התוספת. יתר על כן, אמצעי האחסון כור קטן הם תורמת גדולה לעיצוב של ניסוי לחקור מגוון רחב של מצבים. זה מאפשר תהליכים במעלה שיש למטב באופן משמעותי לפני הסולם שבו ניסויים יותר מוגבל בהיקפו בשל אילוצים כלכליים וזמן. Microscale אוטומטיות ביוריאקטור מערכות מציעים יתרונות שונים מעל מידה קטן מסורתי תא תרבות יחידות, כגון טלטול מבחנות או טווה מבחנות. עם זאת, במהלך טייס סולם תהליך פיתוח משמעותי יש לנקוט כדי להבטיח כי יתרונות אלה הם הבינו. בעת הפעלה עם טיפול, המערכת יכול לאפשר אוטומציה ברמה גבוהה, ניתן לתכנת להפעיל של DOE עם מספר גבוה יותר של משתנים, יכולים לקצר את משך דגימת כאשר משולב עם מנתח מזין או תא מונה. שילוב של אלגוריתמים נגזר מומחה המובאים כאן, עם ניסויים ביוריאקטור microscale האוטומטי הנוכחית באפשרותך למזער מלכודות נפוצות המעכבים תוצאות משמעותיות. בצורה קיצונית, כישלון לדבוק העקרונות המפורטים כאן יכול לגרום נזק ציוד הדורש תיקונים יקרים. יתר על כן, המערכות microbioreactor יש תרבות קטנים כרכים מקשה על אפיון תנאים התרבות התא. המספר ואת כמות דגימות שנלקחו בתהליך אצווה מצב התרבות מוגבל כמו אמצעי ההפעלה לא נופלים מתחת 10 מ"ל. שיטה זו ידונו היתרונות והחסרונות של מערכות ביוריאקטור microscale.

Introduction

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) יוצרו לראשונה בתאים עכבר-ליפידים-1975¹. מאז, עלייה בהתפתחות של ייצור חלבון רקומביננטי התרחש לאינוש mAbs עלייה ויוו בטיחות, יעילות-^2,-^3,-⁴. רוב תהליכי הייצור חלבון רקומביננטי להעסיק השחלה אוגר סיני (CHO) תאים עבור הקלות שבה הם ניתן להתאים מדיה פנויה סרום, וביכולתם לייצר חלבונים עם שינויים post-translational דומה לזה של אדם מולדת חלבון והאמינות שלהם בתור המארח תאים^5,6.

הביקוש גדל כדי לספק את המוצר, ויותר לאוכלוסיות המטופל גדול יותר עם איכות עקבית. בנוסף ליתרונות הכלכליים, הרפרטואר של מחלות שטופלו על ידי mAbs גוברת, עכשיו כולל מחלות אוטואימוניות, סיבוכים שלאחר ההשתלה, דלקת פרקים, סרטן⁷. היבול הממוצע עבור קווי ייצור מודרניים mAb מסחרי בדרך כלל בטווח של 5-6 g/L, ימשיכו לעלות⁵. זה הושג דרך הנדסה תא צ'ו, קו הייצור של שיפור ההקרנה משתמש בתפוקה גבוהה ריאקטורים⁸. עם זאת, רוב העלאות ייצור החלבון יוחסו לעבד שיפורים, כולל החידושים בקידום אתרים במדיה, תנאי התרבות תאים, משופרת האכלה אסטרטגיות^7,9,10. תוספי מזון חיוני לא רק לצמיחה התא הנכון אלא גם לייצור חלבון איכותי ויעיל. יתר על כן, תאים דורשים תוספת stoichiometric של חומרים מזינים מסוימים, הדורשים הבנה נוספת האכלה אסטרטגיה ואופטימיזציה^6,11. שיטות אופטימיזציה המסורתית כוללים טיטור רכיב המדיה האינדיבידואליים ומדיה מיזוג עם תערובת עיצובים. עם זאת, שיטות אלה הן זמן רב, עבודה אינטנסיבית, כרוכים סיכונים הקשורים טעות אנוש^12,13.

לימודי התקשורת אופטימיזציה בעבר התבססה על שייק מבחנות, ריאקטורים 1-2 L אשר עשוי להיות יקר מדי מבחינת חומרי גלם והון אנושי. Microplates גם שימשו אך בשיטות אלה מספקים מדרגיות מוגבלת. יתר על כן, זה עדיין עשוי לדרוש מרובים פועל זמן רב להציג השתנות אצווה-כדי-אצווה אשר מטשטש ההשתנות CQA הנגרמת על ידי מדיה קומפוזיציה האכלה אסטרטגיה^14,15,16. לכן, הצורך ביוריאקטור מקביל בתפוקה גבוהה ועקבית מאוד מערכות המתגלים^17,18,19,20.

עם ההוצאה משמעותיים הקשורים עם המבצע של ספסל מסורתי-סולם ריאקטורים (0.5-5 L), microbioreactors מציעים חלופה בהפחתת עלויות עבור הערכת הייצור ביולוגית נגזר סמים. ריאקטורים מנוער-טאנק ²¹ ספסל בקנה מידה מהימן ומספקים צפופה נתונים באמצעות מערכי חושית. מערכות בקרת משוב לאפשר פיקוח קל של המבצע. עם זאת, ההרכבה, כיול, ניקוי, עלויות העבודה, עלויות המצע ודרישות עיקור להפוך ספסל-סולם מנוער-טאנק ריאקטורים יקר, עבודה אינטנסיבית כדי לפעול. טלטול מבחנות וצלחות microtiter להסיר חלק העלות, עבודה בעיות הקשורות ריאקטורים בקנה מידה גדול יותר, אך חלופות אלה לספק שליטה חלש על תנאי עיבוד ולייצר נתונים בצפיפות נמוכה, לעתים קרובות רק מובילים מדידות. ²²

לחלופין, microbioreactors לנצל את אמצעי העבודה קטן כדי לספק הגישה של סולם-מטה שורת התאים והתפתחות תהליך במעלה הזרם. קנה המידה של ניסויים microbioreactor יכול להפחית באופן משמעותי פועל עלות נמוכה יותר ניצול של כוח, המצע, דיני עבודה, שטח, עזרי. ²³ Microbioreactors הם כמו צלוחיות לנער כי הם קל לטפל עקב גודלם, אבל הם שומרים את היתרונות של ספסל מסורתי-סולם ריאקטורים באמצעות שליטתם משוב מקוון של pH, טמפרטורה, התפרקה חמצן, ועל בסיס/חומצה צריכת, כמו גם שלהם פלט נתונים בזמן אמת של מדדי איכות כולל את ההרכב גז. Microbioreactor סולם מאפשר יכולת הקרנה תפוקה גבוהה, אשר יכול להיות שימושי עבור שכפול הבחירה ותהליך הפיתוח. ²⁴

ביוריאקטור Microscale מתקדם הוכח להיות כלי יעיל עבור צ'ו תא תרבות בתהליך אפיון, פיתוח¹⁸. במסמך זה, מערכת אוטומטית ambr15, המורכבת microbioreactors 48 במקביל, אשר הוכחו להיות דומים במהירותם קלאסי מעורבב טנק כורים בקנה מידה על מחקרים,²⁵ רגיל באופן מקביל עבודה מוקדמת ממוטבת התקשורת ההרכב עבור צ'ו-DG44 תא קו ייצור דגם IgG1 chimeric⁶. השפעת משתנים התנאים מדיה על הצמיחה, כייל נוגדנים היו יחסית, מנותח. נייר זה הוצג קו מנחה כללי כדי להפעיל את מערכת microbioreactor וניתוח של דוגמיות גולמי.

Protocol

1. זרעי הרכבת הרחבה

הערה: פרוטוקול זה משתמש 1 מ"ל רקומביננטי צ'ו DG44 תא מניות אוחסנו בו צפיפות של ~ 3 x 10⁷ תאים/מ ל.... דילולים ולוחות זמנים עבור שורות תאים בודדים של צ'ו ישתנו. למדוד עקומות גדילה של הקו הסלולרי כדי לשמש מראש, משתנות בהתאם. התאים בתחילה הקרת לתוך מבחנות טלטול, עברה לבית בקבוקון ספינר. לקבוע את מספר מבחנות טלטול, טווה מבחנות הדרושים עבור הניסוי המבוסס על מספר microbioreactors אשר יופעלו לבין המטרה זריעה צפיפות.

1. במהירות להפשיר vial(s) מלאי של תאים צ'ו במועט באמבט מים 37 ° C עד רק רסיס קטן שרידי קרח. Decontaminate החיצוני של המבחנה באמצעות פתרון אתנול 70% וטישו נטולת מוך. העברה אבטחה בארון.
2. להשעות מחדש תאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה ולהעביר 1 מ"ל בקבוקון טלטול פרקו סטרילי 125 מ ל המכיל מדיה מראש ומחוממת 29 מ ל בתוספת 8 מ"מ-גלוטמין ו- 1 x פניצילין/סטרפטומיצין.
   הערה: אלא אם צוין אחרת, המונח 'מדיה' ב פרוטוקול זה, להלן יוגדרו כ OptiCHO מדיה.
3. המקום לנער flask(s) בתוך אינקובטור ומתוחזק על CO 37 ° C ו- 8%₂. השתמש של תפקודי לב / נשימה כדי להתסיס את התאים במהירות של 130 סל ד.
4. לנטר את צפיפות התאים קיימא (VCD) כל יום באמצעות תא אוטומטית ספירה התקן או באופן ידני עם hemocytometer, trypan blue. תת-תרבות (שתדללו) התאים 72 שעות לאחר חיסון בתקשורת טריים (לחמם את המדיה 37 ° C בכל פעם זה יש להוסיף תאים) כך שאמצעי האחסון הסופי 100 מ ל בקבוקון טווה 125 מ ל. דגירה טווה תרבויות-באותם התנאים לשימוש לנער את הבקבוק תרבויות במהירות של 70 סל ד.
   הערה: לאחר תת-תרבות, תאים צריך להיות צפיפות של 0.7-1 x 10⁶ תאים/מ ל.... ודא כי צפיפות הסופית אינה מתחת 0.5 x 10⁶ תאים למ"ל. תת-תרבות לאחר 96 שעות. אם לא ניתן להשיג את הצפיפות תא היעד של חיסון ב- spinners.
5. ביום השלישי (יום אחד לפני ההכנות inoculum), להוסיף מדיה טריים, מראש ומחוממת ספינר-flask(s) כדי לשמור על יכולת הקיום של 90% ≥. לא יעלה על הנפח הכולל של 125 מ. ⁶

2. הפעלת מערכת אוטומטית microbioreactor

תנאים מוקדמים: המשתמש חייב לקבל את ההכשרה המתאימה מהיצרן, עליך להיות בקיא בטיחות, לתנאי התפעול של המערכת.

1. מאתחל וחיבור מונה תא
   1. לאתחל את מערכת ההפעלה תוכנה. לפני פתיחת התוכנה, ודא שהדלפק תא (ראה טבלה של חומרים) פועל יחד עם התוכנה המתאימים. הדלפק תא משולב עם המערכת.
   2. להתחבר חיבור מרוחק מונה תא לפני פתיחת התוכנה. לחץ על סמל שולחן עבודה מרוחק, לחץ על "התחבר". לאחר שולחן העבודה המרוחק מחובר, לפתוח את התוכנה מונה התא. התקנת חדש ריאגנט ערכת, ריק הכחול trypan לבזבז, ראש המערכת.
   3. למזער את החיבור המרוחק ופתח את התוכנה ביוריאקטור מיקרו באמצעות ניסוי קיים כתבנית ליצירת התנסות חדשה. שם ולשמור את הניסוי. ודא הדלפק תא האוטומטי מחובר תחת הכרטיסייה מצב בתוכנה. ניתן גם לבדוק את המצב על התוכנה מונה התא.
2. הגדרת לוחות וטעינה כלי
   הערה: נא עיין באיור 1 כדי להציב הטעינה של חומרים מתכלים, ריאגנטים על תחנות תרבות ו decks. הלוחות קלאמפ צריך להיות בלוק על מחזור (משמש עבור חומרים מוצקים) כוח המשיכה לכהן להשתמש.
   1. לפני שמתחילים לרוץ, מגדירים את הצלחות בשימוש במהלך הריצה במקטע מחקים של התוכנה. שם שהלוח בשימוש ולייעד כל צלחת על סיפון על תחנת תרבות microbioreactor.
   2. השתמש צלחת 24-ובכן לטעינה מדיה ומניחים על סיפון תחנת תרבות המיועד. מקום 1 mL ו- 4 מ"ל pipet עצה התיבות בסעיפים כמצוין באיור1.
   3. מניחים צלחת 24-ובכן חיסון על סיפון בהתאמה של תחנת תרבות. במקום ה 1 יחיד-ובכן X צלחת (PBS) מלוחים פוספט באגירה מלאה על הסיפון 1. במקום את הצלחת NaOH של 1 מ' יחיד-ובכן על הסיפון 2, את הצלחת antifoam 24-ובכן בסיפון 7 (עמדות כמצוין באיור1). המספרים הסיפון מוצגים diagrammatically תחת הלשונית "לחקות" בתוכנה.
   4. לפרוק את כלי תרבות (מצויד sparger) בתוך המנוע בארון הבטיחות. במקום 12 כלי סטרילי תרבות לכל תחנת תרבות. המקום בלוק תהדק את לוחיות הרישוי על כלי. ודא כי החורים מוסיף סיפק את כל חימום/קירור מול באותו הכיוון עבור מיקום קל יותר.
      הערה: שימוש בסמן קבוע, לסווג את כלי תרבות לפני הכנסתם תחנת תרבות כדי לחסוך זמן ולמנוע בלבול בזמן הקציר.
   5. צלחת קלאמפ טבעות O הם החלק הראשון כדי להתיש לאחר autoclaving חוזרות ונשנות, לכן בדוק אותם לפני autoclaving לפני כל ניסוי. להשאיר צלחת קלאמפ סטרילית כמו לגיבוי במקרה של כשל o-ring מומלץ.
   6. מקם את הצלחות מערבבים על גבי הלוחות קלאמפ, הבטחת כל סיכה מוכנס בצורה מאובטחת. לאבטח צלחות קלאמפ עם ברגים וידיות מסופקים. להדק את ידיות עד יום ביד צר. להדק את ידיות ימינה ושמאלה לחלופין עבור מיקום אפילו צלחת קלאמפ.
      הערה: אם המלקחיים אינה צמודה פני השטח, או אם הברגים בסוף הצלחת קלאמפ הם הידקו לצר, כלי יחוו בעיות שליטה חמצן מומס (DO). אם התאמות אלה לא פותרות את הבעיה לעשות, בדוק את טבעות O כמו איטום לא שלם של צלחות יכול להוביל ההמתה לא יעיל של תרבות.
3. הפעלת התוכנה אוטומטית ביוריאקטור מיקרו
   הערה: לשימוש "תהליך צעדים" tab כדי לערוך או ליצור צעדים חדשים. צעדים שצריך להיות מתוכנת בנפרד כדי להפעיל או לעצור את כל תהליך. לחץ על לחצן "הוסף צעד" תחת הלשונית שלבי התהליך כדי ליצור צעדים חדשים או לחיצה כפולה על שלב קיים כדי לערוך את הצעד הזה. השלבים תוכנית מחולקים 10 אזורים עיקריים: הפעלה, מדיה טעינה, Antifoam בנוסף, לעשות / pH שליטה, רקע בסיס תוספות, pH מושהה, חיסון, ספירת התאים X 5, ספירת התאים X 10, מזין מנתח דגימה, תרבות תחנת הכיבוי. משך הריצה הוא בדרך כלל בין 7-9 ימים בעת הפעלה במצב אצווה.
   1. המערכת אתחול ובדיקה לנוכחות של כלי המתאים. סרוק את הברקוד סיפק כלי תרבות. ניתן להחיל את הברקוד באותו לתחנות תרבות עם כלי ריק או כלי אינו בשימוש.
   2. המערכת תחל עם התוכנית מעוצבת לאחר בדיקת לעשות בקרה, ההמתה, חיבורים אחרים.
      הערה: המשתמש יכול להמשיך עם התוכנית גם אם מתרחשת שגיאה, אך עושים זאת על הסיכון של המשתמש ואם שממשיכים קדימה אינה פוגעת במערכת תקטע את הניסוי. לדוגמה, ההמתה מבוטלות בוודאות כלי לא נעשה שימוש בניסוי אשר יופיע כשגיאה אבל יכול להיות עקף.
4. הפעלה וטעינה מדיה
   1. הגדרת היום הראשון את המערכת או במדיה טעינה יום מיועדת כמו יום 0 זמן תרבות.
   2. בסעיף הפעלה, pipet טען הראשון טיפים, עצות 1 מ"ל והן 4 מ"ל, כפי מתוכנת. אם כבר, לחץ על המשך. למקם את המדיה צלחת, 1 X PBS, 1 מ' NaOH, antifoam צלחת, צלחת טעינה מדיה וצלחת חיסון הסיפון המיועד לכך, או, אם הניח כבר, הקש על המשך לעבור לשלב הבא.
   3. במסגרת פרוטוקול האתחול, להתחיל בקרת טמפרטורה וכדי להגדיר טמפרטורה 37 מעלות צלזיוס. . הפעילי את ערבוב 1000 סל ד. ותעשה את / ה-pH לפקח.
   4. לאחר מכן, לבצע התקשורת לחייב את התוכנית. המטפל נוזלי של מערכת אוטומטית microbioreactor אחלק את המדיה מהצלחת מדיה כלי התרבות כפי ממופה בתוכנית. התקשורת נוסף הוא OptiCHO עם משתנה תהליך תנאים.
      הערה: שתי בארות מצלחת 24-ובכן נדרשים למלא לכלי אחד תרבות קיבולת (13 מ ל), כל טוב יכול להכיל רק 8 מ של מדיה. השתמש mL 7-8 כל היטב כדי למנוע אוויר הציור כאשר התקשורת היא להיות מעורב על ידי המטפל נוזלי לפני טעינה.
   5. ברגע המדיה ההטענה נעשית, 35 µL של antifoam לשעבר תאים יתווספו מהצלחת antifoam לכלי השיט תרבות. לאפשר 30 דקות תרבות בינוני לערבב טוב ולעשות אופטי / חיישני ה-pH hydrated.
      הערה: באותו אמצעי אחסון של antifoam נוסף לסירוגין לאורך זמן תרבות כאשר קצף מזוהה. ⁶ Foaming מזוהה מבחינה ויזואלית, כלי הכור נבדקים כל יום קצף. Antifoam נוסף מיד על הגילוי.
   6. בצע / pH שליטה פעילה ואז להתחיל הקלטות ו- pH של המדיום תרבות. אפשר לעשות להגיע לנקודה סט של 50%, אשר לוקחת לפחות שעתיים.
   7. לאחר equilibration לעשות, הפעל שנוספו בסיס רקע כדי להשיג נקודה ערכת pH של 7.1 עבור כל כלי תרבות. אפשר לעשות ו- pH equilibrate בין לילה וכדי להיות להתייבש לחלוטין.
5. PH מושהה - יום 1 pH היסט
   1. למחרת (מסומן כיום 1), לבצע הצעד pH מושהה לפיה בחר תרבות כלי ניתוח, היסט תיקון pH נקבעת.
      הערה: המספר של כלי ה-pH מתחננות שיטעמו ולעטיפת ה-pH הוא משתמש נקבע. מדגם כל כלי השיט של הכור, ייתכן שלא יהיה צורך אם יש לך ייצוג טוב של האוכלוסייה ביוריאקטור.
   2. המקום בעל שפופרת מדגם צלחות על הסיפונים המיועד וצינורות צנטריפוגה מיקרו עומס עם כמוסות לפתוח והכנסתי לידם. המטפל נוזלי אחלק 600 µL של הנוזל התרבות התא לתוך הצינור כפי ממופה בתוכנית.
   3. להסיר לאלתר את ה-pH מדגם ולמדוד על bioanalyzer מזין זה כוילה כראוי, אשר QCs הפעלת (ראה להלן, "יומי מזין מטבוליט וניתוח").
      הערה: דוגמאות פועלים באופן אינדיבידואלי, מיד לאחר ציור, כדי למנוע שינויים pH עקב חשיפה לאוויר, כפי degassing של CO₂ מדגם יכול לגרום לשינויים pH.
   4. לאחר כל דגימה, אחרת שהשלב הבא לא תבוצע, פגע "המשך".
   5. הזן את ערכי pH חיצוני, פלקס-derived בתוכנה, "הידור" ההיסטים עבור כלי שנדגמו באופן אוטומטי. באופן ידני ממוצע ההיסטים השיג עבור כלי הדגימה והזן את המספר תחת המשתמש pH היסט העמודה תחת הלשונית "כלי נתונים". ההיסט הממוצע ואז יהיה ליישם את כל כלי. לאפשר את ה-pH ל equilibrate לפחות 2-3 שעות, אחרי אשר יכול להיות מחוסן כלי תרבות.
6. חיסון
   1. לאחר מדידה VCD, להעביר את כל התוכן של תיבת הטווח-flask(s) לתאים סטרילי, 250 מ ל צנטריפוגה חרוט צניפה ובשעות מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב g x 140 בטמפרטורת החדר. Decant התקשורת הישן, מחדש להשעות בתקשורת טריים מספיק כך הצפיפות הסופי צריך להיות עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל לאחר הוספת את inoculum לכלי השיט תרבות.
   2. להוסיף את התאים מושעה לתוך איזור טוב של צלחת 24-ובכן מכסה סטרילי. להוסיף 3 מ"ל של inoculum בכל טוב, מתוכם 2 מ"ל תוסר inoculum עבור כל כלי תרבות.
   3. מקם את הצלחת inoculum על סיפון ייעודית בתוך המנוע. ודא לרסס החיצוני של צלחת inoculum מכסה עם אלכוהול 70% לפני הנחתו בתוך המנוע.
7. בתא לספור באמצעות כלים אוטומטיים מונה תא
   1. לאחר חיסון, תן את כלי התרבות equilibrate לפחות שעה. אחרי שעה, לבצע 5 X תא ספירת שלב בתוכנית. 5 X מציין את הגורם לדילול נהג לקרוא. ספירת.
      הערה: ספירת התאים X 5 משמש בתחילה, כאשר התאים נמצאים בשלב השהיה. לאחר התאים להגיע אל השלב מעריכי שלהם ישמש את 10 X ספירת תאים. בהתבסס על מדגם כרכים diluent המכשיר באופן אוטומטי חשבונות עבור הגורם דילול ומתאים את הערך הסופי בהתאם.
   2. המטפל נוזלי מוסיף קודם µL 480 ל- 1 X PBS בגביע מונה תא ואחריו התוספת של 120 µL של הנוזל תרבות תא מכלי הקיבול תרבות. . ספירת ואז נקראים באמצעות הדלפק תא אוטומטית. שלב זה חוזר על עצמו עבור כל כלי.
   3. ספירת הדם היא השלב האחרון ליום 1 של הזמן תרבות. יחד עם הנתונים לעשות ו- pH. ספירת נתונים (צפיפות התאים קיימא ואת הכדאיות) גם נרשם מדי יום על-ידי התוכנה.
      הערה: לנקות את גביע מונה תא לפחות פעמיים במהלך משך ובורחים עם 70% IPA כדי למנוע סתימת של קווים. קווים ו זרימה-cell מנוקים באופן אוטומטי לאחר כל ספירת התאים.
8. PH מושהה - יום 2 pH היסט
   1. ביום 2 של זמן תרבות, חזור על השלב "מושהה pH" באמצעות כלי תרבות שונים מאלה אשר היו לטעום מן במהלך השלב הראשוני pH מושהה.
      הערה: דגימה יותר של האוכלוסייה קיבול עבור pH מושהה תספק אופסט טוב יותר לתיקון ה-pH. לפיכך, לא לטעום אותם כלי-דם המשמש pH מושהה של היום הקודם.
9. מזין יומיות וניתוח מטבוליט
   1. יילקח לניתוח מזין היום 2 של תרבות עד תום הניסוי ודוגמאות נותחה באמצעות מזין bioanalyzer.
   2. המקום בעל שפופרת מדגם צלחות על הסיפונים המיועד וצינורות צנטריפוגה מיקרו עומס עם כמוסות לפתוח והכנסתי לידם. המטפל נוזלי אחלק את הנוזלים התרבות התא לתוך הצינור כפי ממופה בתוכנית.
      הערה: עבור הראשונית כמה ימים (2-4 ימים) הסכום של שנלקחה מכלי הקיבול תרבות הוא 300 µL. זה מדולל עם 300 µL ל- PBS X 1 על ידי המטפל נוזלי. זאת במטרה לשמר את עוצמת הקול של תרבות ולמנוע את רמת יורד מתחת 10 מ"ל. בנוסף, הערכים התזונתיים של הימים הראשונים נמצאת בטווח זיהוי כלי לאחר דילול.
   3. מקם את הדגימות במגש מנתח לביצוע ניתוח חומר מזין.
      הערה: להקפיא דוגמיות זה לא ינותחו באותו יום.
10. כיבוי מערכת
    1. כדי לסיים את ההפעלה, לבטל תחילה את הפקד טמפרטורה ואחריו התסיסה. שנית, תפסיק לעשות / pH שליטה ורקע לבסס תוספות. שלישית, לעצור כל הפקדים האחרים. לבסוף, להפסיק את צג המערכת.
    2. לפרק את המלחציים, מערבבים צלחות ולהסיר כלי תרבות. לנקות מבפנים של תחנת תרבות עם מגבון נטולת מוך. מניחים את הצלחות ייבוש על תחנת תרבות, לדפוק אותם.
       הערה: מחזור ייבוש נדרש עבור גירסת המערכת מקורר והוא אינו הכרחי עבור הגירסה הרגילה של המערכת.
    3. לבצע מחזור ייבוש שעתיים על התוכנית. לנקות הצלחות קלאמפ באמצעות הנדסה גנטית מים ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל (IPA) כדי להסיר אפשרי נוזל מרוכז בשורות. לשטוף עם אוויר כדי להסיר את כל נוזל שיורית.
    4. לחץ על "עצור" בתוכנה ביוריאקטור פעם סיים מחזור ייבוש.

3. תא תרבות קציר

1. להעביר את הנוזל תרבות תא כלי הכור, גלולה תאים ב- g 1,962 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. Decant את תגובת שיקוע. באמצעות 0.22 מיקרומטר PVDF מסנן סטרילי מסנן הנוזל תרבות יצק התא.
3. Aliquot 1 מ"ל של נוזל סטרילי תא תרבות לתוך 1.5 mL גלאים צינורות לניתוח כייל נוגדנים. לאחסן את צינורות 1 מ"ל ב-20 ° C. לטהר את שאר הנוזל תרבות תא שנקטפו באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר. ⁶

4. מדידת אג Titers

הערה: זוהי סקירה חפוזה של הפעלת וניתוח דגימות באמצעות מערכת ביוסנסור בתזונה. Assay כל הפרמטרים ( כגון טמפרטורה, זמן קריאה, סל ד, וכו ' ) צריכה להיקבע מדעית לכל סוג הדגימה.

1. להפעיל את המערכת ולאפשר את המנורה להתחמם לפחות 1 ה' להסיר דגימות מן המקפיא להפשיר, equilibrate לטמפרטורת החדר.
2. במערכת תוכנה, הגדר את הטמפרטורה צלחת 26 ° C. מראש משרים את המספר של חלבון A טיפים לשימוש במטריצת מדגם (למשל תא מדיה) לפחות 30 דקות.
   הערה: טמפרטורה אופטימלית צריך להיקבע מדעית. לטמפרטורה של 26 ° C משמש כאן למזער את הדגימה אידוי בתקופות ניתוח יותר ולאפשר את המכשיר להחזיק חום עקבית (על-ידי להיות כמה מעלות מעל טמפרטורת הסביבה של). דוגמאות חייב להיות equilibrated מראש לטמפרטורה assay שבחרת לפני המדידה על-ידי המקננת את הצלחת מדגם על הבמה לדוגמה עבור ≥ 10 דקות.
3. לבנות עיקול רגיל חלבון באמצעות נוגדן אותו מרוכז 10 מ"ג/מ"ל ו באופן סדרתי לדלל המטריצה מדגם (קרי מדיה) בטווח שצריך להתגלות.
   הערה: זה חשוב לקבל ריכוז גבוה של נוגדנים. למזער השפעות מטריקס עקב דילול, אך חשוב גם לא על הריכוז הנוגדן ואת זירוז צבירה. מפעיל מעגל סטנדרטי בצלחת על כל צלחת מדגם עדיפה. מינימלית, יש להשתמש בפקד חיובי להביא בחשבון השתנות עצה-אל-קצה וצלחת צלחת-כדי. חדש עיקול רגיל חייב להיווצר עבור כל הרבה חלבון המשמש טיפים חדשים.
4. לעצב את הצלחת מדגם (לדוגמה, ראה איור 2). חלבון A assay המשתמשת התחדשות, עד 80 דגימות יכול להיות מנותח, אשר כוללת דוגמאות תרבות לא ידוע, תקנים ופקדים. על כל צלחת מנותח, טיפ חלבון יחיד א' ישמש כדי למדוד עד 10 דוגמאות מעבר לצלחת (עמודים 1-10), עם התחדשות מחזור בין כל דגימה.
   הערה: מומלץ כי השורה הראשונה כולה של הצלחת (row A) לשמש בקרה שלילית והפניה. ב וזמינותו שנדונו כאן, שורות B ו- C משמשים שני פקדים חיובי; אחת נמוך יותר, ואחת נוספת על הגבול העליון של התגובה ליניארי. פעולה זו מבטיחה שכל עצה מודד פקדים שליליים או חיוביים לפני ניתוח דגימות. זה גם מפשט את הפניה חיסור בתוכנת ניתוח. הבארות הנותרים משמשים ואז דגימות לא ידוע. אם יש פער לדוגמה באחת השורות, חייב להיות מטריצה בתוך הבאר הזו כדי למנוע התייבשות של הקצה (קרי בארות A2 עד G2 יש מדגם H2 אינה. H2 להבטיח מכיל מדגם מטריקס כדי להבטיח עצה לא יתייבש לפני שתמשיך כדי לדגום H3). לבסוף, לא פליטה טיפים באמצעות אחת להגדיר לנתח לוחות מרובים. משתמש חדש, שאינו מחדש ערכה עבור כל צלחת מומלץ.
5. הכנת דוגמאות לניתוח על ידי ערבוב בעדינות , גם על-ידי היפוך או pipetting, ואחריו ספין הדופק כדי לאסוף דגימת בתחתית הצינורית. לדוגמאות מרוכז, ליצור משכפל דילול המתאים על ידי דילול במטריצת מדגם.
   הערה: הטווח ליניארי של איגוד עבור נוגדן החלבונים מידות אינטרפרומטריה (בלי) ביו-שכבה ישתנו על ידי נוגדנים, תנאים assay, והן מטריקס. זה צריך להיקבע מדעית מראש כדי להבטיח מדגם המתאים דילולים משמשים.
6. הכנת לוחות דגימה 96-ובכן קרוב assay זמן ככל האפשר. להבטיח ישנם אין בועות אוויר מכל הבארות. להסיר בועות אוויר עם טיפ פיפטה נקי או על ידי צנטריפוגה.
7. לטעון את הצלחת לתוך המערכת ולהפעיל assay באמצעות ברירת המחדל גבוהה רגישות Assay עם ה"התחדשות" בתוכנה קירור והקפאה. לנתח באמצעות ניתוח נתונים HT תוכנה.
   הערה: אם הצלחות להיות מוכנים מראש בשל אילוצים, חותם בצורה מאובטחת עם סרט כדי למנוע התאיידות. בהתאם titers הצפוי, רכישת המחירים ושעות ייתכן שתצטרך לכוונן. עיין במדריך של הדרכה.
8. שימוש בתוכנת ניתוח נתונים, הפניה לחסר ולחשב את הריכוז של הדגימות לא ידוע באמצעות עיקול רגיל והפונקציה מדרון הראשונית (IS) עם נקודה-לנקודה לינאריות מתאים.

Results

פיקוח על תהליך קריטי פרמטרים ופרמטרים אחרים תא תרבות במהלך המבצע של תרביות תאים הוא היבט חשוב של bioprocessing. תא מונה מנתח מזין שימשו כדי לכמת את חמש התכונות המאפיינות צמיחת תאים, צריכת מזון ויצירת לוואי. ספירת התקבלו מדי יום עבור כל התנאים תרבות. צפיפות התאים קיימא הממוצע ואת viabilities הם כפי שניתן לראות באיור 3 יחד עם מרווח ±1 SD שלהם. הפרופיל התזונתי, לוואי מוצגים גם עם המרווח SD ±1 באמצעות שלב נייח של התרבויות. השיפוע של פרופיל זה מייצג את הממוצע גלוקוז, גלוטמין צריכת וייצור לקטט, המחירים הנמוכים. באופן כללי, תוצאות אלו ממחישות את הכדאיות של ניטור מאפיינים אלה במערכת microbioreactor; כמו גם היכולת של המערכת microbioreactor לשמור על פרמטרים אלה בטווח צר.

הפרודוקטיביות הכולל של התרבויות תא היה לכמת באמצעות מערכת ביוסנסור בתזונה אחרי התקשורת התרבות התא שנקטפו הועבר דרך מסנן PVDF 0.22 מיקרון. הפרודוקטיביות ספציפיים עבור כל תא נע בין 0.87 pg/תא-d אל 1.15 pg/תא-d כפי שניתן לראות באיור4. בהתבסס על תוצאות אלו מגוון רחב של תנאים יכול ייחקרו כדי לבחור קומפוזיציה מדיה, האכלה האסטרטגיות למקסם את כמות חלבון המיוצר עבור השקעה מינימלית בהליכים ניסיוני.

איור 1 : הפריסה של מערכת microbioreactor עם 4 תחנות תרבות (CS) יש 12 כלי הכור, לכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

איור 2 : דוגמה מה השטויות צלחת מדגם כימות בסיסי עם התחדשות ניסוי במערכת ביוסנסור בתזונה. שורה 1 (אדום "R") היא שמורה לדגימה (כלומר מטריצה נעדר analyte); שורה 2 (תרשיש) היא קבוצה של סטנדרטים (ריכוזים נמצאים ב- µg/mL); שורות 3 ו- 4 (כתום) הן קבוצות של פקדים חיובי נמוך וגבוה ("PL" ו- "PH," בהתאמה); שורות 5 עד 10 (סגול) מכיל דגימות לא ידוע; שורות 11 ו- 12 (אפור) הם עמדות תוכנית ברירת מחדל עבור התחדשות ("R") ואת מאגרי ניטרול ("N"). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

איור 3 : ) ממוצע צפיפות התאים קיימא ופרופילי הכדאיות מעל הגיל של אצווה. ± 1 SD מוצג גם כדי לציין שליטה הדוקה של צמיחת תאים במערכות microbioreactor. ב) פרופיל התזונתי הממוצע גלוקוז, גלוטמין, כמו גם את פרופיל לוואי הממוצע לקטט. ± 1 SD מוצג גם כדי לציין שליטה הדוקה על מדיה הרכב במערכות microbioreactor. (N = 3, כל התנאים היו הפעלת דולר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : נציג תיבת-חלקת הממוצע פרודוקטיביות מסוים התנאים מדיה שונים. (N = 3, כל התנאים היו הפעלת שהפקידים) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Discussion

הפעלת מערכת ממוכנת ביוריאקטור מיקרו כראוי, ביעילות כרוך בזמן ביצוע מרובי שלבים אוטומטיים. אחד החלקים החשובים ביותר של הפעלת המערכת הוא תכנות בתוכנה. אם יש שגיאות בעת כתיבת התוכנית, יהיו שגיאות חמורות לניסוי שעלולים לגרום לשינויים לא צפויים בתהליך, האכלה אסטרטגיה, דגימה אסטרטגיה או איכות המוצר הסופי, אשר עלול לפסול את הממצאים של המחקר. היבט חשוב נוסף של הפעלת המערכת היא מקום והדק את הצלחת קלאמפ כראוי כדי להבטיח שליטה לעשות. הסימן השכיח ביותר הצלחת קלאמפ הודקה לצר הוא לא צפוי בווריאציות לעשות מדידות עבור כלי 1, 6, 7 ו- 12 (פינת הכור כלי). בסך הכל עושה יציבות מציין להתרופפות אטמים על הקווים כניסת הגז לוחית קלאמפ. תרחיש זה עלול להכשיל מגיעים לנקודה סט לעשות. כנחותים נפוץ אחר כדי להימנע בעת מתחילה ניסוי נותן את התאים לשבת זמן רב מדי במהלך השלב חיסון, גורם להם להתיישב. פחות מבלה התאים ישיבה, פחות סיכויים יש כי בהדרגה התחתון inoculum תא ספירת מתווספים באופן כרונולוגי כלי הכור אשר יכול לגרום הטיה משמעותית כך מבלי משים פוגעת תוצאות המחקר. עדיף לחסן בשלבים מרובים, קרי לחסן בכל תחנה תרבות אחת אחרי השניה עם הפסקה מדרגות בין כך התאים לא יושבים בצלחת חיסון יותר מ-15 דקות.

בנוגע לשימוש יומיומי, שמירה על עקרות היא חיונית. למרות המערכת נמצאת במצב בטיחות ביולוגית cabinet, עקרות אינה מובטחת עקב התנועה תכופים בין מכסה המנוע. כתוצאה מכך, כל דבר עובר בשכונה חייב ריסוס עם 70% IPA. שנית, זה חיוני כדי להבטיח כי קצף מינימלי מתרחשת במהלך התרבות; מדיה ניתן לסתום ההמתה, פליטה קווים, מוביל לפגיעה של קלאמפ צלחת, אפילו רכיבי הליבה להלן. תוספת אנטי-קצף מונעת שלבים הם קריטיים בתכנון תוכנית כלשהי ביוריאקטור מיקרו. במקרה של קצף"החוצה" זה יהיה מועיל לעקוב היצרנים ניקוי פרוטוקול, יכול למנוע נזק בלתי הפיך של קלאמפ צלחות. לחלופין, השימוש בכלי שאינו sparged עשוי להיות מועיל עבור צפיפות התא התחתון או בעת הפעלה במצב אצווה כמו משטח גבוה יותר ליחס נפח מאפשרת חמצן יעילה גם עם חוסר sparger. עם זאת, כלי שאינו sparged ייתכן שימושי עבור תרביות תאים גבוהה צפיפות או זלוף כמו המרחב הראשי אינה מספיקה לשמור על קשר עם התרבויות גדלה צריכת החמצן.

ישנם יתרונות רבים הניתנים על ידי מערכת microbioreactor, כיוון שהוא מאפשר תרבויות רבות מבוקרת לפעול במקביל בקנה מידה קטן, עם שליטה רבה יותר מאשר לנער מבחנות. ¹⁷ לכן, המערכת מקלה על הביצוע של הקרנת מחקרים, האם, תפוקה גבוהה שיבוט מחקרים ולימודים תרביות תאים. טיפול בנוזלים אוטומטית גם מפחית אנליסט-כדי-אנליסט השתנות תוך מזעור בו זמנית עבודה מייגעת וגוזלת זמן עבור צוות מיומן. אמנם ישנם מספר יתרונות למערכת, ישנם מספר חסרונות מפתח הנחשבות. ראשית, נפח תרבות של 15 מ"ל באופן משמעותי מגביל בתהליך הדגימה חומר הקציר הסופי ואת ריאקטורים בקנה מידה קטן אלטרנטיביים מרובים (עד 500 mL) לאחרונה הופכים לזמינים. אחת האחרונות לקידום למערכת הוא השילוב של ביוריאקטור microscale אוטומטית במנתח BioProfile FLEX 2 מנובה ביו, אשר מפחית את הסיכון של הנושא בתוך תהליך דגימה על-ידי צמצום נפח דגימה לניתוח צפיפות, מזין תא . יתרונות באפשרותך לכלול התקנה מהירה, כמעט אין המוביל ניקוי חיסכון תפעולי, אולם העלות של יחידות חד פעמיות צריך להיחשב לפרויקטים לטווח ארוך ככל שיהיה costlier לרכוש היחידות מאשר המערכות המקובלת לשימוש חוזר.

השיטה המתוארים במסמך זה מתאים בעיקר תרבית תאים במצב אצווה, אך יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של המשתמש. בכל תחנה תרבות יש שליטה עצמאית של טמפרטורה, בעוד לעשות ו- pH יכולים להיות מגוונים ברמה של כלי הכור בודדים. החייטים מציע גם DoE תכנון תוכנה שתוכננה במיוחד כדי לאפשר ניסויים כדי להתאים את המערכת ביוריאקטור מיקרו. מחקרים DoE בקנה מידה גדול באמצעות התוכנה החדשה DoE המסופקים על ידי היצרן יכול לסייע בתקשורת, תוספת אופטימיזציה. אמנם לא משמש כאן, מערכת microbioreactor מאפשרת גם מחקרים האכיל-אצווה. עדיין לא מוטבה המערכת עבור תרביות תאים זלוף. עם זאת, היו מוגבלים מחקרים וניסויים לחקות זלוף תא תרבות מבצע במערכת ביוריאקטור מיקרו הנוכחי. ²⁶ בשיטה זו ניתן לשנות לחקות תרבויות זלוף צפיפות גבוהה על ידי תא ליישוב. על ידי שינוי הגובה שאליו pipet מוכנס לתוך הכור ועל -ידי אופטימיזציה של זמן הייבוש, התקשורת ניתן יהיה להסיר, מתחדש למצב שמלבלב מראה של תרבות. ישנם מוצרים חדשים בתחום המתפתח יכול לעבוד טוב יותר המערכת המוצגת כאן אם זלוף מצב של תרבות רצוי.

לסיכום, מחקר זה מדגים את השימוש מיקרו אוטומטיות-ריאקטורים ומקושרת אנליטי לפעולות תרבות תא צ'ו לייצר, לאפיין נוגדן IgG1 Monoclonal מודל. זה מדגיש את משחק התפקידים מיקרו-ריאקטורים בקנה מידה קטן bioprocess הייצור, שלהם השפעה על התפתחות התרבות תא ההקרנה מדיה. אמנם ישנם יתרונות רבים לשימוש מערכת ממוכנת בקנה מידה קטן, הבנו את היתרונות שלהם לעבד הבנה, אפיון אנליטי הכרחי. מחקר זה מספק את המשתמש עם קו מנחה לשימוש מערכת הכור microscale אוטומטית, כי ניתן פיתחה השתפר לכל הצרכים מחקר אישיים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO DG44 Cell Line	Invitrogen	A1100001
ambr 15 מערכת מיקרו-ביו-ריאקטור אוטומטית	Sartorius	001-2804	מיקרו-ביו-ריאקטור אוטומטי
ambr 15 תרבית תאים 24 ביו-ריאקטורים חד פעמיים - Sparged	Sartorius	001-2B80
1 מ"ל קצות פיפטה חד פעמית, מעוקר	Sartorius	A-0040
5 מ"ל פיפטה חד פעמית טיפים, מעוקר	Sartorius	A-0039
24 צלחות באר עמוקות היטב	Sartorius	A-0038
1 צלחות באר	Sartorius	A-0068
Vi-Cell XR דלפק תאים	בקמן קולטר	731050	מונה תאים אוטומטי
EX-CELL  נוגד קצף (מוקרן גמא)	Sigma-Aldrich	59920C-1B
CD OptiCHO AGT בינוני	תרמו פישר A1122205
מדעי 200 מ"מ L-גלוטמין	קורנינג	25-005-CV
100X פניצילין/סטרפטומיצין	קורנינג	30-001-CI
125 מ"ל צלוחיות שייק תחתונות (סטרילי, מאוורר)	פישר סיינטיפיק	PBV12-5
125 מ"ל זכוכית ספינר צלוחיות	קורנינג מדעי החיים זכוכית	4500-125
250 מ"ל PP צינורות צנטריפוגה חרוטיים (סטריליים)	Nalgene (תרמו מדעי)	376814
TC20 מונה תאים אוטומטי	BioRad Laboratories, Inc.
טריפן כחול	סיגמא-אולדריץ'	T8154
10x PBS	קורנינג	46-013-CM
BioProfile FLEX מנתח	נובה ביו-רפואי	49418	מנתח חומרים מזינים
שמינייה אדומה 96	Pall Forté ביו	99-0042	חלבון A חלבון חיישן ביולוגי
טבילה וקריאה חיישנים	ביולוגיים Pall Forté ביו	18-5010
פוליפרופילן 96 בארות מיקרופלייט, תחתית F, בסגנון ארובה, גריינר שחור	Bio-One	655209