שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר של הרומן נטו מבוסס-עובש שיטה קלה ליצירת תלת-ממדיים (3-D) רקמות הלב ללא חומר נוסף לגרדום. Pluripotent אנושית-induced גזע-תא-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), fibroblasts הלב האנושי (HCFs), יפתור תאי אנדותל (HUVECs) הם מבודדים, המשמש ליצירת השעיה התא עם 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, ו- 15% HUVECs. . הם תרבותי משותף במערכת "התלויים טיפה" מצורף נמוך במיוחד, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת. התאים צבירה ויוצרים באופן ספונטני המכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות משותפת. Spheroids שנקטפו, נזרע לתוך החור עובש הרומן, תרבותי על מטרף בחממה. Spheroids להפוך רקמה תפקודית בוגרת כ 7 ימים לאחר זריעה. הרקמות מרובה שכבות הנובעת מורכב מאוחה spheroids עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני. שיטה חדשה זו יש פוטנציאל מבטיח כשיטה לשחזור וחסכונית ליצירת רקמות מהונדסים לטיפול באי ספיקת לב בעתיד.

מבוא

המטרה של הנדסת רקמות הלב הנוכחית היא לפתח טיפול כדי להחליף או לתקן את המבנה והתפקוד של רקמת שריר הלב הפצוע¹. שיטות ליצירת דגמים תלת-ממדיים ברקמת הלב מפגין המאפיינים כויץ ו אלקטרופיזיולוגיות חשוב של רקמת הלב יליד במהירות הרחבת^2,3. מגוון רחב של אסטרטגיות חקר ומשמשת מחקרים^4,5. אלה שיטות נע בין שימוש ספציפי טבעיים וסינתטיים ביו hydrogels, כגון ג'לטין, קולגן, פיברין, פפטידים⁶, ביו-דיו התצהיר טכנולוגיות² ו- bioprinting טכנולוגיות⁷.

הוכח, כי שיטות לגרדום ללא יכול לייצר רקמות דומות כמו שיטות מבוססות biomaterial, ללא החסרונות של שילוב חומרים זרים פיגומים⁸. אורן כספי. et al. הוכיח כי שילוב של סוגים שונים של תאים מאפשרת את הדור של vascularized מאוד אנושי ברקמת הלב מהונדסים⁹. הסנטר. ואח פיתח שיטה הדפסה תלת-ממדי עבור יצירת תיקון הלב של spheroids. תיקונים וכתוצאה מכך הם מורכב cardiomyocytes fibroblasts, תאי אנדותל יחס 70:15:15¹⁰. Spheroids הוכחו להיות יעיל "אבני בניין" הבריאה ברקמת הלב ללא לגרדום, כפי שהם עמידים נגד היפוקסיה ושולט מספיק מכנית השרשה^11,12. מחקרים קודמים הדגימו מספר שיטות ייצור ספרואיד הבריאה, כולל השימוש של התליה זרוק שיטה, טווה מבחנות¹³, microfluidic מערכות¹⁴, משטחים שאינם מחסידי תרבות מצופה עם או ללא ציפוי מיקרו-עובש agarose¹⁵. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים התליה טיפה התקן, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת.

מחקר זה מציג של הרומן ובאיזו שיטה לגרדום ללא יעיל הבריאה ברקמת הלב, אשר כולל זריעה ידנית את spheroids לתוך חור מרובע עובש המקננת הרקמה על מטרף עבור ההבשלה. בתנאים הרגילים תרבות סטטי, דיפוזיה חמצן מוגבלת להיבטים החיצוניים של הבונה רקמות, וכתוצאה מכך נמק במרכז. עם זאת, עם העובש נטו, כל spheroids נזרע לתבנית שקועים בתקשורת עם תנועה fluidic קבוע, המאפשר פעפוע מוגברת של חומרים מזינים וחמצן. בנוסף, שיטה זו מבוססת על עובש מתיר יצירת סימולטני של רקמות בגדלים שונים מדבקות במינימום מאמץ ידנית, הרקמה הנובעת ניתן להסיר בקלות התבנית. שיטה חדשנית זו מאפשרת יצירת לשחזור ויעילה של מדבקות לב נטולת לגרדום, מרובה שכבות.

פרוטוקול

1. הכנת Cardiomyocytes

1. מעיל טוב 6 צלחות עם קרום המרתף מטריקס ותרבות אנושית-induced גזע pluripotent (hiPSCs) כפי שתואר לעיל¹⁷.
2. להבדיל hiPSCs אל תוך שימוש בשיטות שתוארו¹⁸hiPSC-CMs.
3. ב- 16-18 d פוסט-בידול, להשעות את cardiomyocytes בשטיפת בכל טוב עם 2 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום, ואחריו הדגירה 1 מ"ל/טוב של ריאגנט דיסוציאציה של טריפסין או תא-(ראה טבלה של חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) תא מדיה בתוספת B-27 (מדיה תא RPMI/B-27). פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים מודבקת.
5. לאסוף את cardiomyocytes מושעה עם פיפטה סרולוגית 10-mL ומעבירים אותם אל צינור חרוטי 50-mL.
6. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה התא.
7. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיה תא RPMI/B-27.
8. לשלב 20 µL תא השעיה עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
9. השתמש hemocytometer ידני של סופרים ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.

2. הכנת Fibroblasts

1. ליזום תרבות של פיברובלסט הלב האנושי (HCF) (סוג חדרית למבוגרים) קו תא כפי שתואר לעיל¹⁶.
2. להשעות את HCFs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר¹⁶. בשביל בקבוקון T175, שימש 10 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא.
3. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר את הדגימה אל צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל גלולה.
4. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול פיברובלסט (ראה טבלה של חומרים).
5. לשלב 20 µL של התליה תא HCF עם כמות שווה של 0.4% trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
6. להשתמש מונה תא אוטומטית או ידנית hemocytometer נחשב ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא חדש.

3. הכנה של תאי אנדותל

1. ליזום תרבות של קו תא אנדותל (HUVEC) הוא יפתור כפי שתואר לעיל¹⁷. להשעות את HUVECs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) למשך 3 דקות על טמפרטורת חדר¹⁷. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב 250 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה.
   הערה: עבור בקבוקון T175, 10 מ של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא שימש.
2. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול תא אנדותל (ראה טבלה של חומרים).
3. לשלב 20 µL של ההשעיה HUVEC, את הכתם עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
4. השתמש מונה הניתן תא אוטומטית או hemocytometer ידני של ספור ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.

4. יצירה של תלויים טיפה Spheroids

1. במקום לבלות את המכשיר טיפה אשר מכיל micropores 850 (כל אחד בקוטר של 350 מיקרומטר) לוחות 6-ובכן סטרילי.
2. לבודד את שלושת סוגי תאים כמתואר לעיל: hiPSC-CMs, HCFs ו- HUVECs. לשלב אותם ביחס של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs 50-mL צינור חרוטי עם מדיה תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ.
3. לוותר על 4 מ"ל של התליה תא (2,475,000 תאים לכל mL) על כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי מערכת טיפה (בקוטר micropore של 350 מיקרומטר) לתוך צלחת 6-. טוב.
4. Spheroids יהוו באופן ספונטני בתוך 12 שעות של מחלק התליה תא לתוך התליה המכשיר טיפה. נמשכות לתרבות עבור סכום כולל של 72 h (3 יח)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 95% לחות ההבשלה של spheroids.
5. לאחר 72 h של תרבות, לקצור את spheroids דרך הנקבוביות בתחתית התליה להפיל את המערכת על-ידי הצבת המכשיר לתוך קערה בינונית מתערבל אותו בעדינות כדי לשחרר את spheroids מן התליה המכשיר טיפה.

5. יצירת תיקון תלת-ממדי משתמש בתבנית נטו הרומן

1. הבסיס, צלחת מרובע התחתון, התחתון נטו, ואת הצד בשכבות 10 רשתות הם התאספו כדי ליצור את התבנית הרומן בסיועם של זוג מלקחיים סטרילי. ראשית, מחסנית ליישר את הבסיס, צלחת מרובע התחתון ו למטה נטו באמצעות ההודעות בפינה. לאחר מכן, מחסנית, שכבה הרשתות בצד 10 מתחלפים כיוונים כדי ליצור רשת של צדדים נירוסטה משובחים.
2. לרוקן את הבסיס עם PBS או בינוני כדי להפחית את המתח, אז, העברת כייר שהורכב על גבי הבסיס מילוי המילוי.
3. הרטב את חלל עובש רשת PBS או במדיום באותה השיטה. לאט לאט למלא את spheroids לתוך חלל presupposed בגודל הרצוי (2 x 2 x 1 מ מ, 4 x 4 x 1 מ מ, או 6 x 6 x 1 מ מ).
   הערה: ודא כי 120% נפח הצפויה של spheroids מוזן לתוך החלל כך מצרפי תא יש קשר הדוק, נשאר סטטי.
4. להרכיב את העליון נטו ואת הפלטה מרובע על ההודעות בפינה ולאבטח פקקים וצינורות אחזקות כדי למנוע כשלון של spheroids.
5. להעביר את המערכת מלא עובש נטו צלחת 6-ובכן עם 6 מ של RPMI/B-27 תא מדיה או לתוך מיכל סטרילי עם מדיום מספיק כדי לכסות את התבנית שהורכב כולו.
6. תקופת דגירה לצלחת 6-ובכן עם מערכת מלא עובש על מטרף מתנדנדים של 7-10 ימים ב 3000-4000 x g.
   הערה: משך הדגירה הוא החליט לפי גודל המדבקות הלב. טלאים גדולים יותר זמן הדגירה צריך להיות מוגברת על תיקון הלב ההבשלה.

6. הסרת התיקון של העובש נטו הרומן

1. להסיר את המערכת עובש התקשורת ומניחים אותו על המשטח טיפול סטיריליים בקערה ס מ-10 סטרילי.
2. הסר את הצינור אחזקות, פקקים, הפלטה מרובע, הרשת העליונה. החלק בזהירות את הרשתות בשכבות בצד אחד עם זוג מלקחיים סטרילי. לאחר decannulation, תיקון הלב שלם מתקבל על גבי התחתון נטו.
3. להרים התחתון נטו עם התיקון באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר התחתון נטו לתוך תבשיל 35 מ מ 5 מ של RPMI/B27 מדיה. בעדינות שחרר את התיקון מלמטה נטו מאת לאט מתערבל נטו בצלחת, או עם המגרד של התא סטרילי. לאחר ניתוק מלמטה נטו, רקמת הלב יכול להיות מחונן עם RPMI/B27 מדיה
4. להמשיך דגירה התיקון לב לתרשים תלת-ממדי בצלחת 35 מ מ. מכות סינכרונית פונקציונלי יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 24 שעות לאחר הסרת של העובש.
5. לאחר הסרת התיקון כייר נטו, לבחון את צורתה נשמר עם יושרה, את עוצמת המכות סינכרונית גדל עם הזמן.
   הערה: תלת-ממדי נטו מבוסס-עובש לב המדבקות הציג שילוב חשמלי של רכיב cardiospheres לאחר decannulation. הבחנו תדר הכאה ועד 60 80 פעימות לדקה. זה נמשך יותר מ- 60 יום.

תוצאות

בניסויים שלנו, אנחנו מנוצל השעיה תא של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs בתקשורת תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ. לאחר יצירת התליה תא, וויתרנו 4 מ"ל של התליה תא כדי כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי במערכת המסירה, כפי שמתואר בשלב 4.3 של הפרוטוקול. השימוש של התליה מערכת טיפה, גרמו היווצרות ספונטנית של מאות להכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 95% לחות. Spheroids נצפו בקלות כדי להיות פועם תחת מיקרוסקופ אור בבית 4 X 10 X הגדלה עם קוטר ממוצע של מיקרומ...

דיון

המשמעות של שיטה זו נעוץ הפארמצבטית שלה ואת האפקטיביות של רקמת הלב הנובעת מרובה שכבות. בתחום של הנדסת רקמות הלב, אחת המטרות הנוכחית היא לזהות שיטה לבנות מכות מרובה שכבות, פונקציונלי תיקונים לב תלת-ממדי. . מדווחים שיטה לשחזור ויעילה של יצירת רקמות הלב מרובה שכבות על ידי זריעה ידנית ישירה של spheroids מורכב cardiomyocytes, תאי אנדותל ו fibroblasts לתוך תבנית נטו הרומן. כייר נטו להשתמש בשיטה זו יש מגוון רחב של גדלים שונים ליצירת רקמות 2 x 2 x 1 מ מ ועד 6 x 6 x 1 מ מ. כן, ניתן לשנות את הטכניקות שתיארנו צורות עובש שונים ולמערכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיברובלסטים לבביים אנושיים (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 מורכב ממדיום בסיסי	Sciencell	2331	HCF מדיום תרבית
טבורי אנושי (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC מדיום E8 מדיה
	Invitrogen	A1517001	מדיום תרבית HiPSC
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher	12604013	טריפסין וריאגנט דיסוציאציה
של תאים מדיה RPMI	11875093	Invitrogen	עם תוסף B-27 היא מדיום תרבית hiPSC-CM
תוסף B-27 (פי 50)	Thermo Fisher	17504044	RPMI עם תוסף B-27 היא מדיום תרבית hiPSC-CM
טריפאן כחול פתרון, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
עובש רשת חדשני	TissueByNet ושות', בע"מ	NM25-1
צלחת טיפה תלויה	Kuraray ושות', בע"מ	MPc350
6 באר צלחות	סיגמא-אולדריץ'	CLS-3516