Method Article

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקנה epigenetic ממלא תפקיד מרכזי ביטוי גנים. מאז שינוי היסטון התגלה בשנות השישים, תפקידיה פיזיולוגיים ופתולוגיים נחקרו בהרחבה. אכן, כניסתו של רצף עמוק הדור הבא, immunoprecipitation כרומטין (ChIP) באמצעות נוגדנים שינוי היסטון ספציפי יש מהפכה התפיסה שלנו לגבי רגולציה epigenetic ברחבי הגנום. לעומת זאת, רקמות בדרך כלל מורכבים של סוגי תאים שונים, תערובת מורכבת שלהם מציב אתגרים אנליטית כדי לחקור את epigenome בסוג לתא מסוים. כדי לטפל המדינה כרומטין ייחודיים לסוג התא באופן הגנום כולו, שפיתחנו לאחרונה טנדם כרומטין immunoprecipitation רצף (tChIP-Seq), אשר מבוססת על הטיהור סלקטיבי של כרומטין על-ידי הליבה מתויג חלבוני היסטון מתא סוגי ריבית, ואחריו שבב-תת סעיף. המטרה של פרוטוקול זה הוא ההקדמה של שיטות עבודה מומלצות של tChIP-תת סעיף. טכניקה זו מספקת כלי רב-תכליתי לחקירה רקמות ספציפיות epigenome שינויים היסטון מגוונים, מודל אורגניזמים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברקמות של בעלי חיים מורכבים של סוגי תאים שונים. הכונה בכל תא מגדיר את סוג התא. כרומטין שינויים - DNA מתילציה של היסטון-שינוי - ביסוד יחודיות תא-סוג של ביטוי גנים. לפיכך, המדידה של תקנה epigenetic בסוג התא כל רצונך בכך, אבל זה כבר אתגר טכני.

כדי לחקור את אפיגנטיקה בסוג לתא מסוים, היה רצף immunoprecipitation טנדם כרומטין (tChIP-Seq) פיתחה לאחרונה (איור 1)1. TChIP, מבוטא מתויג epitope הליבה היסטון חלבון ויזת עבודה H2B מ מקדם ייחודיים לסוג התא. תכונה זו מאפשרת את ניתוקה של chromatins את התאים של עניין, למרות החומר מתחיל תערובת של סוגי תאים שונים. השבב הבא-Seq — כרומטין טיהור באמצעות שינוי היסטון מארק בעלת רצף עמוק הדור הבא של מבודדים DNA – נוכל לעקוב אחר המצב epigenetic סוג התא יישוב באופן הגנום כולו.

בעזרת טכניקה זו, חקרנו לאחרונה נוירון ספציפי trimethylation של היסטון H3 חלבון-ליזין 4 (H3K4me3) סימני. במחקר זה, פיתחנו בטוק עכבר ב אילו C-סופני מתויג דגל ויזת עבודה H2B חלבון בא לידי ביטוי על רקומבינציה בתיווך Cre (Rosa26חטיבתי floxed-pA ויזת עבודה H2B-דגל...). על ידי מעבר עם עכבר אחזקת הגן רשת (ER) Cre-endoplasmic תחת השליטה של האמרגן CamK2a, הקו העכבר שהושג המושרה ויזת עבודה H2B-דגל בנוירונים פעיל עם טמוקסיפן הזרקה (Camk2aויזת עבודה H2B-דגל)1. החל מהמוח של הקו העכבר הוקמה, ביצענו tChIP-Seq עם נוגדן anti-H3K4me3. מאז H3K4me3 סימני לעיתים קרובות להתאים לאזורים יזם, נוכל לגלות מאות mRNAs במיוחד לידי ביטוי נוירונים1.

כאן, אנו מתארים שיטה tChIP טיפוסי-Seq שמכסה את השלבים של רקמות לנתיחה לבנייה הספרייה (איור 1). המטרה הסופית של פרוטוקול זה היא לשתף שלנו מומלצות עבור הביצועים של tChIP-Seq לבין היישום העתידי של שיטה זו על סוגי תאים אחרים והשינויים היסטון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות במסמך זה מאושר על ידי מחלקת הבטיחות של RIKEN (H27-EP071), שנערך עם רלוונטיות הנחיות ותקנות.

1. רקמות לנתיחה

  1. לנתח את רקמות עניין לחתיכות קטנות (כ < 3 מ מ2) באמצעות מספריים אביבי נאה.
    הערה: שברים גדולים יותר של רקמת להתארך להקפיא, חתיכות קטנות תישא על אחסון גדולים יותר מאגר, אשר שניהם עשויים להשפיע על התוצאות.
  2. להוסיף שברי רקמת ביתור במיכל נקי מלא עם חנקן נוזלי ולאסוף אותם לתוך צינורות 2 מ ל (1 חתיכה למחזור) מלא עם חנקן נוזלי.
    הערה: צינורות עם משטח הידרופילית מומלץ בשלב זה.
  3. הצב הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס עבור > חמש דקות עם הכיפה פתוח מתמוססות החנקן הנוזלי הנותרים.
    הערה: לאחר סגירת הכיפה, שברי רקמת שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפני השימוש.

2. התא קיבוע

הערה: השתמשנו מטחנה קריוגני שימושי עבור שלב זה. מנגנון חלופי יכול לשמש.

  1. מקום 2 מ"ל-חלבון נמוכה מחייב צינורות המכיל את דגימות רקמה על מתלה מתכת קרח צונן של חנקן נוזלי.
  2. מניחים כדור מתכת 1.5 mL-שפופרת, תירגע עם חנקן נוזלי. למקם אותו על המדף קרח מתכת.
  3. פתח הצינור-mL 2 ולמקם את כדור מתכת prechilled לתוך הצינור. לסגור את הפקק, להגדיר 2 מ"ל-הצינורות לתוך צינור בעל מטחנה קריוגני בהישג יד, מיד לטבול בעל שפופרת שהורכב בחנקן נוזלי עבור 1 דקות.
  4. הכנס בעל שפופרת קפוא בקלטת החיצוני של מטחנת קריוגני בהישג יד ומנערים נמרצות 60 פעמים ב-30 s.
  5. לפרק את מחזיק שפופרת, להוציא את הקליע מתכת, מקום 2 מ"ל-שפופרת על מדגם קריר יותר prechilled ב-20 ° C.
  6. מקם את הדגימה קריר יותר ב-20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות למניעת קיפאון של מקבע בשלב הבא.
  7. להביא את הדגימה קריר הספסל, פותחים את המכסה של הצינור, מיד לטפטף µL 900 של 1% פורמלדהיד לתוכו. לאחר pipetting מספר פעמים, להעביר את המתלים לתוך חדש 2 מ"ל-שפופרת המכילה µL 900 של 1% פורמלדהיד, תיקון עבור 10 דקות עם סיבוב עדין בתוך אינקובטור שוכן בגובה 23 ° C.
    התראה: פורמלדהיד הוא רעילים ואינם מזיקים.
  8. כדי להפסיק את התגובה קיבעון, להוסיף 100 µL של גליצין 2.5 מטר כל שפופרת של צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
  9. להוסיף 1 מ"ל תמיסת מלח קרה כקרח באגירה פוספט (PBS), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x-4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים (3 מנקי סה כ).
    הערה: דגימות קבוע יכול להיות קפואה על-ידי חנקן נוזלי, המאוחסנת ב- 80 ° c
  10. להוסיף 500 µL של פירוק מאגר 1 (50 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES)-קו (pH 7.5), 140 מ מ NaCl, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v גליצרול, 0.5% w/v NP-40, 0.25% w/v טריטון X-100, ו- 0.1 x מעכב פרוטאז קוקטייל) בגדר, pipet מספר פעמים, וסיבוב 10 דקות ב 4 º C.
    הערה: פירוק מאגר 1 צריך להיות מסונן ומאוחסנים ב 4 ° C לפני השימוש.
  11. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  12. להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר 2 (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.5 מ מ EGTA, ו- 0.1 x מעכב פרוטאז קוקטייל) כדי בגדר, מערבולת, וסיבוב 10 דקות ב 4 º C.
    הערה: פירוק מאגר 2 צריכה להיות מסונן ומאוחסנים ב 4 ° C לפני השימוש.
  13. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  14. להוסיף µL 800 radioimmunoprecipitation assay (ריפה) מאגר עם מעכב פרוטאז 1 x קוקטייל בגדר, resuspend בגדר על-ידי pipetting.
  15. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  16. להוסיף 500 µL ריפה מאגר עם מעכב פרוטאז x 1 קוקטייל.
  17. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 3000 g x ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  18. להוסיף 1 מ"ל ריפה מאגר עם מעכב פרוטאז x 1 קוקטייל. מיד להמשיך לשלב הבא.

3. כרומטין הטיה

  1. להעביר את lysate צינור sonicator ולאחר מכן מקם את הצינורית על ultrasonicator.
  2. הטיה של כרומטין עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה: 4 ° C; שיא האירוע כוח: 175 וואט; פקטור חובה: 10%; מחזורים/פרץ: 200; זמן: 2,400 s.
  3. להעביר את הדגימה mL-חלבון נמוכה איגוד צינור 1.5 ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 20,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
  4. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינור נמוך מחייב חלבון חדש.
    הערה: המדגם יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.

4. איכות הסימון של ה-DNA (Crosslinking הפוך)

  1. מיקס 20 µL של lysate ו- 180 µL שבב • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 300 מ"מ NaCl, 5 מ מ EDTA (pH 8.0), ו 1% w/v dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות)) צינור תגובת שרשרת (PCR) פולימראז. דגירה המדגם-65 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמית עבור 6-אייץ ' עם המכסה הצנטרפוגה תרמי הפתוחים. שמור את מכסה פתח הצנטרפוגה תרמית כדי למנוע דנטורציה יתר.
    הערה: המאגר • תנאי שבב צריך להיות מסונן, בטמפרטורת החדר לפני השימוש. ניתן להאריך את הדגירה ללון.
  2. להוסיף 1 µL של 10 מ"ג/מ"ל RNase, מערבולת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. להוסיף µL 6.5 של 15 מ"ג/מ"ל proteinase K, מערבולת, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  4. להעביר את התגובה צינור DNA קשירה נמוכה, להוסיף 4 µL של 5 מ"ג/מ"ל ו מערבולת. לאחר מכן, הוסף 200 µL של אלכוהול פנול/כלורופורם/isoamyl (25:24:1), צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g x 18,000 בטמפרטורת החדר.
  5. להעביר את תגובת שיקוע צינור נמוך איגוד ה-DNA. להוסיף 200 µL מאגר טריס-EDTA-NaCl (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 מ"מ EDTA (pH 8.0) ו-200 מ מ NaCl) תמיסת כוהל פנול/כלורופורם/isoamyl הנותרים, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 18,000 בטמפרטורת החדר. לאסוף את תגובת שיקוע ומערבבים עם תגובת שיקוע הראשון.
  6. להוסיף µL 900 של אתנול קר כקרח, תקופת דגירה של h 1 ב-20 ° C.
    הערה: הדגירה זו ניתן להרחיב ל 4 - 6 שעות.
  7. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 18,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
  8. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל אתנול 75% קר כקרח צניפה, צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 18,000 g x-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה (שני מנקי סה כ).
  9. למחוק את תגובת שיקוע ביסודיות, מילה נהדרת עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. הוסף µL 50 מאגר טריס-EDTA (TE), לפזר את ה-DNA על ידי המקננת זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להימנע vortexing או pipetting. לשמור את הדנ א "קלט" ולהשתמש בו עבור ספריית הכנה במידת הצורך.
  11. למדוד את ריכוז הדנ א עם fluorometer לפי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים) לבדוק את התפלגות גודל עם מכונה אלקטרופורזה microfluidic (ראה נציג נתונים המוצגים איור 2A)-שימוש 10 ng או פחות דנ א זה וזמינותו.
    הערה: קטעים של 100-500 בסיסים (bp) שתתפייס 50% או יותר של ה-DNA.

5. הזיקה טיהור על ידי נוגדנים אנטי-דגל

הערה: עבור נוירון tChIP-Seq, ברקמות המוח של עכברים 8 משמשים בדרך כלל עבור מדגם אחד של tChIP-Seq להכין 2 ng של DNA מטוהרים מאת טנדם החיסון-טיהור (ראה צעד 7.1). בידיים שלנו, ספריות DNA באיכות גבוהה ng של DNA עדיין מסופקים 0.1 עבור שבב-Seq (Kadota, לא פורסם). לפיכך, באופן תיאורטי, עכבר אחת עשוי להיות מספיק לבצע נוירון tChIP-תת סעיף צריך להיות מוטבת הכמות הדרושה עבור סוג הרקמה והתא עניין. עבור הפקד שלילי של הניסוי imumuno-טיהור, רקמת המוח lysate של עכברים ללא כל ביטוי ויזת עבודה H2B-דגל צריך להיות מוכן ולא להשתמש בו.

  1. פיפטה µL 200 של חרוזים מגנטי מצומדת כדי כבשים אנטי-העכבר אימונוגלובולין G (IgG) לתוך צינור חלבון נמוכה מחייב.
  2. מקם את הצינורית אל דוכן מגנטי ולחכות 1דקות. עבור תגובת שיקוע להתבהר. למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח, מערבולת. חזור על שלב זה (שני מנקי סה כ).
  3. הוסף 20 µL של נוגדן אנטי-דגל 1 מ"ג/מ"ל ולסובב עבור 5 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להרחיב את הדגירה ללון.
  4. לשטוף את החרוזים הבאים 5.2 שלב. מקם את החרוזים לתוך צינור 15-mL.
  5. Resuspend את החרוזים בשנת 1110 µL ריפה המאגר ולאחר מכן להוסיף µL 900 של 10 x חסימת ריאגנט 180 µL של 50 x הפתרון של Denhardt, µL 10 של 100 x מעכב פרוטאז קוקטייל, 6.8 מ ל lysate המוכנים בשלב 3. פצל תערובת זו 5 צינורות קשירה נמוכה של חלבון. לסובב עבור 6-אייץ '-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להרחיב את הדגירה ללון.
  6. מקם את הצינורית על גבי המעמד מגנטי ולחכות 1דקות. עבור תגובת שיקוע להתבהר. למחוק את תגובת שיקוע, מוסיפים 1 מ"ל של מאגר ריפה, ומערבבים בעדינות. חזור על שלב זה 5 פעמים (6 מנקי סה כ). מאגר כל החרוזים לתוך צינור נמוך מחייב חלבון יחיד.
  7. להוסיף 200 µL שבב • תנאי מאגר וסובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בדוק את איכות ה-dna כפי שמתואר בשלב 4.11 (ראה נציג נתונים המוצגים איור 2B ו- C). מיד להמשיך לשלב הבא.

6. זיקה טיהור ע י נוגדן Anti-H3K4me3 Crosslinking הפוכה

הערה: הבאים חרוז הכנת שהשלבים (6.1 – 6.4) צריכה להתבצע לפני שלב 5.7.

  1. פיפטה µL 40 של beads מגנטי מצומדת כבשים העכבר אנטי איג לתוך צינור 2 מ"ל-חלבון נמוכה מחייב.
  2. מקם את הצינורית על גבי המעמד מגנטי ולחכות 1דקות. עבור תגובת שיקוע להתבהר. למחוק את תגובת שיקוע, מוסיפים 1 מ"ל של PBS קר כקרח, ומערבבים בעדינות. חזור על שלב זה (שני מנקי סה כ).
  3. להוסיף 4 µL של נוגדן anti-H3K4me3 1 מ"ג/מ"ל ולסובב עבור 6-אייץ '-4 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף את החרוזים בעקבות צעד 6.2. מקם את החרוזים לתוך צינור 2 מ"ל-חלבון נמוכה מחייב.
  5. Resuspend את החרוזים ב- 1558 µL ריפה המאגר ולאחר מכן להוסיף 200 µL של 10 x חסימת ריאגנט, µL 40 של 50 x הפתרון של Denhardt, 2 µL של 100 x מעכב פרוטאז קוקטיילים ו 200 µL של eluate המבושלות שלב 5.7. סובב בין לילה ב 4 º C.
    הערה: זמנים תוססים במאגר • תנאי השבב היה מדולל יותר מ 10 פעמים ב הזה הדגירה.
  6. מקם את הצינורית על גבי המעמד מגנטי ולחכות 1דקות. עבור תגובת שיקוע להתבהר. למחוק את תגובת שיקוע, מוסיפים 1 מ"ל של מאגר ריפה, ומערבבים בעדינות. חזור על שלב זה 4 פעמים (5 מנקי סה כ). לאחר השטיפה האחרונה להעביר את החרוזים לתוך צינור נמוך איגוד ה-DNA, ולמחוק את תגובת שיקוע.
  7. להוסיף 200 µL שבב • תנאי מאגר וסובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את eluate bindingTube נמוך החדש ה-DNA.
    הערה: eluate שניתן לאחסן ב- 80 ° c
  8. בצע את שלב 4 עבור decrosslinking של ה-DNA. Resuspend ה-DNA מטוהרים ב 20 µL טה המאגר.
  9. בדוק את איכות ה-dna כפי שמתואר בשלב 4.11 (ראה נציג נתונים המוצגים באיור 2D). (אופציונלי) ביצוע ניתוח העשרה על ידי ה-PCR כמותי כמתואר קודם לכן2. Ten-fold או העשרה יותר להתייחס.

7. ספריית בנייה

  1. לכל קלט או שבב דנ א, לחשב את שיעור ה-DNA באזור 100-500-bp באמצעות הפונקציה ניתוח השמצות של התוכנה עבור המכונה אלקטרופורזה microfluidic. מעריכים את אמצעי האחסון מדגם הנדרשים על מנת לקבל 2 ng של 100-500 bp הדנ א. להשתמש 20 ng DNA בטווח של 100-500-bp המדגם "קלט".
  2. פיפטה דגימות די אן איי לתוך חשפנות-8 המבחנות ולהוסיף H2O כדי להביא את הנפח הכולל 10 µL. (אופציונלי) אם אמצעי האחסון של ה-DNA חורג µL 10, באופן פרופורציונלי הסולם התגובה הבאה סוף-תיקון בחירת גודל.
  3. להכין מיקס מאסטר סוף-תיקון (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 4 µL של מיקס מאסטר סוף-תיקון ה-DNA, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 20 ° C.
  4. להוסיף µL 36 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.5 ו- 0.6 x נפח (30 µL) של מוצק שלב beads מגנטי הפיך הנייח (אלוהים אדירים) תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי והמתן עד תגובת שיקוע נעשה ברור.
  6. להעביר את תגובת שיקוע צינור, להוסיף כרכים x 1.2 (60 µL) של אלוהים אדירים beads מגנטי, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי והמתן עד תגובת שיקוע נעשה ברור.
  8. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 200 µL של 80% EtOH, מחזיק את הצינור עדיין על המגנט.
  9. בקצרה centrifuge צינור כדי לאסוף את EtOH שיורית בתחתית ולמקם אותו בחזרה על המגנט. הסר את EtOH שיורית ביסודיות.
  10. השאר את המכסה צינור פתוח למשך 1-2 דקות לאפשר את EtOH מתמוססות.
  11. סגור את המכסה ולשמור את הצינורית על קרח.
    הערה: עכשיו אתה השגת DNA נבחר גודל של 100-500 bp על החרוזים. פרטים נוספים אודות בחירת גודל כפול ניתן למצוא באתר האינטרנט של היצרן (www.beckman.com).
  12. הכנת אב א-עוקב לערבב (ראה טבלה של חומרים).
  13. Resuspend את החרוזים (מתוך שלב 7.10) עם µL 10 של מיקס מאסטר א-עוקב, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 30 ° C.
  14. להוסיף x 1.8 נפח (18 µL) של פוליאתילן גליקול (PEG) / פתרון NaCl דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. בצע שלבים 7.7-7.11 כדי לטהר את ה-DNA.
  16. להכין תערובת מאגר מצדו (ראה טבלה של חומרים).
  17. פיפטה 8 µL של שילוב מאגר מצדו על גבי החרוזים (מתוך שלב 7.14), להוסיף 1 µL 1 מיקרומטר מתאם, resuspend את החרוזים. השתמש µL 1 של 5 מיקרומטר מתאם עבור המדגם קלט. שקול שימוש במתאמים שונים עבור כל דגימה עבור ריבוב.
  18. להוסיף 1 µL של ה-DNA ליגאז ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב 20 º C.
  19. להוסיף נפח x 1.0 (10 µL) של פג/NaCl פתרון, resuspend את החרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  20. בצע שלבים 7.7-7.10 כדי לטהר את ה-DNA.
  21. פיפטה 25 µL 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.5 לתוך הצינור, resuspend את החרוזים.
  22. להוסיף נפח x 1.0 (25 µL) של פג/NaCl פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  23. בצע שלבים 7.7-7.10 כדי לטהר את ה-DNA.
  24. פיפטה µL 11 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.5 לתוך הצינור, resuspend את החרוזים.
  25. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי והמתן עד תגובת שיקוע נעשה ברור.
  26. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינור 8-רצועת ה-PCR.
  27. להכין בזמן אמת PCR מיקס מאסטר (ראה חומרים לפרטים).
  28. פיפטה 8.5 µL של בזמן אמת PCR מיקס מאסטר בצלחת (qPCR) PCR כמותי 384-ובכן, להוסיף 1.5 µL של המתאם מאתרים דנ א (מתוך שלב 7.26).
  29. פיפטה 10 µL של כל תקן פלורסנט בבארות ריק.
  30. לבצע PCR בזמן אמת עם programm הבאים: (98 ° C עבור 45 s) x מחזור 1, (98 ° C 15 s, 60 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s) x 20 מחזורים, ו (72 ° C 60 s) x מחזור 1.
  31. לקבוע את מספר מחזורי PCR צריכה להגיע עוצמת קרינה פלואורסצנטית של 2 רגיל פלורסנט.
  32. הכנת הבסיס PCR לערבב (ראה טבלה של חומרים).
  33. פיפטה 11.5 µL של המיקס מאסטר PCR לתוך הדי ובין אם-לא מתאם הנותרים (מתוך שלב 7.26) ולבצע PCR כמצוין ב 7.30 צעד עם המחזורים PCR נקבע שלב 7.31.
  34. להוסיף נפח x 1.0 (20 µL) של פג/NaCl פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  35. בצע שלבים 7.7-7.10 כדי לטהר את ה-DNA.
  36. פיפטה 20 µL 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.5 לתוך הצינור, resuspend את החרוזים.
  37. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי והמתן עד תגובת שיקוע נעשה ברור.
  38. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 מ ל- DNA קשירה נמוכה.
  39. בדוק את האיכות של הספרייה כפי שמתואר בשלב 4.11 (ראה נציג נתונים המוצגים איור 2E ו- F). השתמש µL 1 של דגימת DNA הספרייה. (אופציונלי) לבצע ניתוח העשרה על ידי qPCR כפי שתואר לעיל 2. Ten-fold או העשרה יותר להתייחס.

8. רצף

  1. רצף של הספריות ב ברצף הדור הבא (ראה נציג נתונים בתרשים 3).
    הערה: העומק רצף מספיק עבור ניתוח הנתונים משתנה בהתאם לגודל הגנום של האורגניזם3. עבור האדם העכבר, ואנו ממליצים קבלת קריאות יחיד-end לפחות 20-40 מיליון. על פי התשואה הקריאות, ריבוב עשוי להיות חסכוני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את רקמת לנתיחה, קיבוע, פירוק התא, טנדם טיהור של כרומטין, ספריית DNA הכנה סקוונסרים הדור הבא. במהלך ההליכים, אחד יכול לבדוק את האיכות של ה-DNA, אשר היא המפתח רצף מוצלח, על מספר השלבים (איור 2). מאז נוקלאוזום בודד מוקף בדרך כלל bp 147 דנ א 4, הוטו DNA לא צריך להיות קצר יותר בגודל הזה. מיד לאחר ultrasonication, ה-DNA היה מבודד, לפעול על מחשב אלקטרופורזה microfluidic (איור 2 א). למרות מאמצינו כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול שלנו היה ממוטב הנוירונים במוח העכבר, שבו הביטוי של ויזת עבודה H2B מתויג דגל הנגרמת על ידי הזרקת טמוקסיפן. היזמים להשתמש בביטוי ויזת עבודה H2B, חומרים רקמת המוצא של הסכום של הרקמות הם פרמטרים מרכזי עבור מוצלחת tChIP-תת סעיף. לפיכך, אופטימיזציה של גורמים אלה להתייחס לכל סוג התא של ריבית.

שלב קריטי בין ההליכים בשימוש פרוטוקול זה הוא ה-DNA הטיה כדי להשיג באורך כרומטין של bp 100-5005. באופן כללי, סטנדרטיזציה של השלב ultrasonication הוא מאתגר מאז זה מאוד תלוי במגוון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי המעבדה איוואסאקי לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (#26113005 כיהן ו JP17H05679 ל ס. י); מענק הסיוע מדענים ומפתחים צעירים (א) (JP17H04998 ל ס. י) מ משרד החינוך, המדע, הספורט והתרבות של יפן (MEXT); והחלוץ פרויקטים "אבולוציה סלולרית" ו RIKEN כל פרוייקט "המחלה, Epigenome" מ RIKEN (כדי כיהן, ס. י).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שפופרת חלבון LoBind, 2 מ"לEppendorfNo.  0030108132חלבון ליזה תאים
, 1.5 מ"לEppendorfNo.  0030108116להכנת ChIP והכנת ספרייה
צינור DNA LoBind, 1.5 מ"לEppendorfNo.  0030108051להכנת ChIP וספרייה
צינור PCR 8 רצועותBIO-BIK3247-00להכנת ChIP וספרייה
SK MillTOKKENSK-200מטחנה קריוגנית שימושית להכנת אבקת תאים לקיבוע
כדור מתכתTOKKENSK-100-DLC10אביזר של SK Mill
2 מ"ל צינור נירוסטהTOKKENTK-AM5-SUSאפשרות לתא ליזה
2 מ"ל מחזיק צינור נירוסטהTOKKENSK-100-TLאפשרות לליזה תאית
16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנולפירס28906לתיקון תאים. הכן תמיסה של 1% לפני השימוש.
GlycineNacalai Tesque17109-35הכן 2.5 M מלאי
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24לשטיפת ליזאט ו-DNA מטוהר
HEPESNacalai Tesque02443-05עבור מאגר ליזה 1. הכן 1 מ ', מלאי pH 7.5.
5 M NaCl, כיתה ביולוגיה מולקולריתNacalai Tesque06900-14עבור מאגר ליזה 1, מאגר ליזה 2, מאגר ChIP, ומאגר Tris-EDTA-NaCl
0.5 M EDTA, כיתה ביולוגיה מולקולריתWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075עבור מאגר ליזה 1, מאגר ליזה 2, מאגר פליטת ChIP, ומאגר Tris-EDTA-NaCl
גליצרולWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945עבור מאגר ליזה 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75עבור מאגר ליזה 1
Triton X-100, כיתה ביולוגיה מולקולריתNacalai Tesque12967-32עבור מאגר ליזה 1
TrisNacalai Tesque35406-91עבור מאגר ליזה 2, מאגר פליטת ChIP ומאגר Tris-EDTA-NaCl. הכן מלאי 1 מ ', pH 8.0.
0.1 M EGTA pH ניטרליNacalai Tesque08947-35עבור מאגר ליזה 2
קוקטייל מעכב פרוטאז (100x)Nacalai Tesque25955-24כדי לחסום פירוק של חלבון
RIPA bufferThermo Fisher Scientific89900עבור ליזה תאים וכביסה
milliTUBE 1 מ"ל AFA סיביםCovaris520130צינור סוניקטור. אביזר של Focused-ultrasonicator
ממוקד-אולטרה-סוניקטורCovarisS220 או E220לעיכול DNA לגודל הולם עבור ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027עבור ChIP Elution Buffer
RNase ANacalai Tesque30141-14לטיהור DNA מליזאט
Proteinase K, רקומביננטי,סיגמא-אולדריץ'3115887001לטיהור DNA מליזאט
אתנולWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225הכינו תמיסה של 70%
נוגדן חד-שבטי נגד FLAG M2 המיוצר בעכברSigma-AldrichF1804לטיהור כרומטין המתבטא בתאי עניין
Dynabead M-280 כבשים נגד עכבר IgGThermo Fisher Scientific11201Dזה יכול לשמש עבור אנטי-FLAG IP ואנטי-H3K4me3 IP
אנטי-טרי-מתיל היסטון H3 (K4), נוגדן חד שבטי לעכברWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811כל נוגדן אחר שעובד לניתוח ChIP יעבוד
פי 10 מגיב חוסםסיגמא-אולדריץ'11096176001 לחסימה במהלך טיהור זיקה
דנהרדט' s פתרוןNacalai Tesque10727-74לחסימה במהלך טיהור זיקה
גליקוגן (5 מ"ג/מ"ל)Thermo Fisher ScientificAM9510לטיהור DNA מליזאט
קיוביט 2.0 פלואורומטרThermo Fisher ScientificQ32866לכימות DNA
מבודד קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקהThermo Fisher ScientificQ32851לכימות DNA מבודד
צינור 0.5 מ"לAxygen10011-830לכימות על ידי Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56לטיהור DNA מליזאט
חרוזי AMPure XPבקמן קולטרA63881SPRI חרוזים מגנטיים להכנת ספרייה
מתלה קרח מתכתFunakoshiIR-1כדי לשמור על התא קפוא
מצנן דגימהניו אינגלנד BiolabsT7771Sמסייע בתיקון תאים עם נזק מינימלי
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAלבדוק את איכות שברי ה-DNA המבודדים. ניתן להשתמש במנתח שברים אחר.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent Technologies G2946CAמסופקת עם
ערכת ה-DNA ברגישות גבוההAgilent Technologies5067-4626כדי לבדוק את איכות שברי ה-DNA המבודדים
ערכת הכנת ספריית KAPA LTP Roche07961898001מסופק עם 10x מאגר תיקון קצה KAPA, תערובת אנזימים לתיקון קצה KAPA, מאגר זנב KAPA A, אנזים זנב KAPA A, מאגר קשירה KAPA, KAPA DNA Ligase ותמיסת PEG/NaCl
ברקודי DNA BIOOScientificNOVA-514101להכנת ספרייה. מסופק עם מתאמי ברקוד DNA ותערובת פריימר.
ערכת הגברת ספרייה בזמן אמת KAPARoche07959028001מסופקת עם 2x KAPA HiFi HS בזמן אמת PCR Master Mix, PCR Primer Mix ותקני פלורסנט
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602להכנת ספרייה. בנוסף, אנזים זה עשוי להידרש עבור ערכת ההגברה של ספריית KAPA בזמן אמת
מאגר EBQiagen1908610 מ"מ Tris-Cl, pH 8.5 לפליטת צלחת qPCR של DNA
386 בארותThermo Fisher Scientific4309849עבור PCR בזמן אמת
QuantStudio 7 Flex מערכת PCR בזמן אמתThermo Fisher Scientific4485701לכימות
סרט דבק אופטי DNA MicroAmpתרמו פישר מדעי4311971לסרט דבק PCR מיקרו
אמפר שקוףתרמו פישר מדעי4306311לאיטום צלחת
תערובתלשלב 1.4 ומיקרו; L של 10x מאגר תיקון קצה KAPA, 1 ומיקרו; L של תערובת אנזימים לתיקון קצה KAPA, ו-1.6 ומיקרו; L של H2O
מאסטר A-talingקומביין 1 ומיקרו; L של KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 ומיקרו; L של אנזים זנב KAPA A, ו-8.4 ומיקרו; L של H2O
חיץ קשירהשילוב 2 ומיקרו; L של מאגר קשירת KAPA ו-6 ומיקרו; L של H2O
מאסטר PCR בזמן אמתשילוב 5 ומיקרו; L של 2x KAPA HiFi HS בזמן אמת PCR Master Mix, 0.35 ומיקרו; L של תערובת פריימר PCR (10 ומיקרו; M כל אחד של פריימר קדימה AATGATACGGCGACCACCGAG ופריימר הפוך CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), ו-3.15 ומיקרו; L של H2O
תערובת מאסטרשילוב 10 ומיקרו; L של 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 ומיקרו; L של תערובת פריימר PCR, ו-0.6 ומיקרו; L of H2O
מציג גנומיקה אינטגרטיביתמכון ברודIGV_2.3.88דפדפן גנום להמחשת נתוני ריצוף
DNA אולגיונוקלאוטיד: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins Genomicsפריימר להגברת אזור המקדם של GAPDH
DNA אולגיונוקלאוטיד: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins Genomicsפריימר להגברת אזור המקדם של GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420Lכדי לכמת את ה-DNA המתאים לאזור המקדם GADPH
קוביות Thermal Cycler TakaraTP870כדי לכמת את ה-DNA המתאים לאזור המקדם GADPH
עבור צינור LoBind בדרגת PCR של Bioanalyzer מתאם בזמן אמת מאסטר לתיקון קצה תערובת תערובת מיקס PCR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TChIP SeqChromatin ImmunoprecipitationHistone ModificationCell Type SpecificEpigenome ProfilingTissue DissectionCryogenic GrindingFormaldehyde FixationSonication ChromatinAffinity Purification

Related Articles