הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58299

⸱

8 באוקטובר 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

תקציר

שחפת mycobacterium נמצא כעת הקטלני פתוגניות גורם 1.7 מיליון מקרי מוות וזיהומים 10.4 מליון בכל שנה. חשיפה חיידק זה גורם ספקטרום רחב המחלה בבני אדם ועד זיהום סטיריליים מחלה קטלנית מתקדם באופן פעיל. הצורה השכיחה ביותר היא ראגנטים, אשר ללא תסמינים, אבל יש את היכולת להפעיל מחדש לתוך מחלה לפתח. דג זברה למבוגרים ופתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית לאחרונה הוכיחו להיות מודל החל ללמוד את קשת רחב מחלת השחפת. חשוב לציין, השהיה ספונטנית, הפעלה מחדש, כמו גם תגובות מערכת החיסון מסתגלת בהקשר של זיהום mycobacterial ניתן יהיה ללמוד במודל זה. במאמר זה, אנו מתארים שיטות זיהום ניסיוני של דג זברה למבוגרים, האוסף של איברים פנימיים להפקת חומצות גרעין לשקילת נטען mycobacterial, מארח תגובות מערכת החיסון על ידי ה-PCR כמותי. In-הבית מפותחות, ספציפית qPCR assay מ התחממות עולמית -רגיש יותר מאשר בשיטות ציפוי מסורתי בעת גם זיהוי ה-DNA של mycobacteria ללא הפרדה, רדום או מת לאחרונה. כמו גם DNA ו- RNA המחולצים באותו הפרט, זה אפשרי ללמוד את קשרי הגומלין בין המדינה חולה, את המחשב המארח ופתוגן, ביטוי הגנים. המודל דג זברה בוגרת שחפת וכך מציג את עצמו כמערכת מאוד רלוונטי, ללא מידע יונקים ויוו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי.

מבוא

דג זברה (רזבורה rerio) הוא מודל בעל חיים הנמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי וזה מודל מקובל עבור הביולוגיה חוליות נפוצות. דג זברה הותאם לשדות רבים של מחקר מידול מחלות אנושיות, הפרעות ועד סרטן1 ומחלות לב2 זיהום ולימודי אימונולוגי של מספר חיידקים 3 וזיהומים וירליים4 , 5. בנוסף, הפיתוח לשעבר עם רחם של דג זברה עוברי גרם דג זברה מודל פופולרי ב ביולוגיה התפתחותית6 וטוקסיקולוגיה7,8.

בתחומים רבים של מחקר, כולל זיהום ביולוגיה, הזחלים דג זברה שקוף אופטית משמשים. תאי מערכת החיסון הראשון להופיע בתוך 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), כאשר מקרופאגים פרימיטיביים שזוהו9. הנויטרופילים הם תאים חיסוניים הבאה תופיע hpf סביב 3310. דג זברה הזחלים הם לפיכך ריאלי עבור לימוד בשלבים המוקדמים של הזיהום ואת התפקיד של חסינות מולד בהיעדרו של תאים חיסוניים מסתגלת11. עם זאת, דג זברה למבוגרים עם המערכת החיסונית מסתגלת באופן תקין שלה מספק שכבה חדשה של מורכבות לניסויים זיהום. תאי T ניתן להבחין סביב 3 ימים לפרסם הפריה12, ואף בתאי B מסוגלים לייצר נוגדנים תפקודית 4 שבועות-פוסט-דישון-13. דג זברה למבוגרים יש את כל עמיתיהם העיקריים של המערכת החיסונית יונקים, מולדת, גמישים. ההבדלים העיקריים בין את immune systems של דגים ובני נמצאים נוגדנים isotypes באותה מידה כמו האנטומיה של רקמות הלימפה. דג זברה יש נוגדנים רק שלושה שיעורים14, ואילו לבני האדם יש חמש15. בהיעדרו של מח העצם ואת בלוטות הלימפה, איברי הלימפה העיקרי ב הדג הכליה ואת ה התימוס16 הטחול, הכליה, הבטן לשמש איברי הלימפה משני17. למרות הבדלים אלה, עם ארסנל מלא המערכת החיסונית שלה של תאים מולדת, גמישים, דג זברה למבוגרים הוא מודל מאוד רלוונטי, קל לשימוש, ללא מידע יונקים ללימודי אינטראקציה פתוגן-פונדקאי.

דג זברה הוקם לאחרונה כמודל אפשרי ללמוד שחפת18,19,20,21,22. השחפת היא מחלה מוטס הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium. על פי ארגון הבריאות העולמי, שחפת גרמה1.7 מיליון מקרי מוות של 2016, והוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם פתוגן יחיד23. עכברים24,25, ארנבים26 וקופים27 הם שהחיה הידועים מודלים במחקר שחפת אבל כל המגבלות שלהם. המודל אנושיות הפרימטים לזיהום מ. שחפת דומה המחלה האדם הקרוב ביותר, אבל באמצעות מודל זה הוא מוגבל בשל שיקולים אתיים רציני. דגמים בעלי חיים אחרים הם מוגבל בשל המארח-יחודיות של מ. שחפת המשפיעה על המחלה פתולוגיה. כנראה הבעיה הגדולה ביותר ב דוגמנות שחפת הוא המגוון הרחב של תוצאות בזיהומים ומחלות של המחלה האנושית: השחפת היא מחלה מאוד הטרוגנית החל לחיטוי חסינות נסתר, פעיל, שהופעלה מחדש זיהום28 , אשר יכול להיות קשה לשחזר את מודל השפעול.

התחממות עולמית הוא קרוב משפחה של מ. שחפת עם חלבונים orthologous ~ 3000 עם 85% חומצה אמינית זהות29. התחממות עולמית מ מדביק באופן טבעי דג זברה לייצר גרנולומות, גולת הכותרת של שחפת, ב19,האיברים הפנימיים שלה30. בניגוד דגמים בעלי חיים אחרים השתמשו במחקר שחפת, דג זברה מייצר צאצאים רבים, היא דורשת רק מקום מוגבל, חשוב, זה neurophysiologically המודל שחפת חוליות שהיזמים זמינים. בנוסף, הזיהום מ התחממות עולמית גורם חבויה, מחלה פעילה או אפילו עיקור של זיהום mycobacterial דג זברה בוגרת מקרוב מחקה את הספקטרום של המחלה תוצאות של שחפת אנוש19, 31 , 32. כאן, אנו מתארים שיטות עבור הדגם שחפת ניסיוני של דג זברה למבוגרים על ידי הזרקת התחממות עולמית מ לתוך חלל הבטן באמצעות PCR כמותי כדי למדוד המון mycobacterial של תגובות חיסוניות של דג זברה דגימות רקמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל דג זברה ניסויים אושרו על ידי מועצת המנהלים ניסוי חיה ב פינלנד (ESAVI/8245/04.10.07/2015). שיטות מבוצעות על פי החוק (497/2013) צו ממשלתי (564/2013) בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות או חינוכי בפינלנד.

1. culturing של התחממות עולמית

הערה: מאחר התחממות עולמית חיידק המסוגל לגרום זיהומים שטחיים בבני אדם, לגלות את ההנחיות המקומיות לסילוק פסולת חומרים מסוכנים, לפני שמתחילים לעבוד עם חיידק זה ובטיחות אישית.

  1. תרבות התחממות עולמית מ על ה 7 10 צלחת בתוספת 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז) העשרה ו- 0.5% v/v של גליצרול ב 29 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים לפחות. לשמור על תרבויות מ התחממות עולמית על-ידי לקיחת החיידקים טרי מהמקפיא כל שבועיים העברת לצלחת חדשה כל שבוע.
    הערה: התחממות עולמית מ . חיידק טבעי דגים מדביק מינים ימיים וזה חשוב לנקוט באמצעי זהירות כדי לא לזהם את מניות דג זברה עם החיידקים. דג זברה נגוע ופריטים מזוהם עם חיידקים יש להישמר נפרד מן המתקנים הרבייה.
  2. השתמש לולאה חיסון 1 סטרילי-µL להעביר גילוח ורחיצה כירורגית של loopful של התחממות עולמית מ המוני חיידקים לתוך בקבוקון התרבות התא המכיל 10 מ"ל של 7 שעות 9 בינוני עם 10% ADC (אלבומין, דקסטרוז, קטלאז) העשרה, 0.2% v/v polysorbate 80 ו- 0.2% v/v של גליצרול. תרבות במשך 3-4 ימים בערך יתר600 (צפיפות אופטית) של 0.7 ב 29 ° C בחושך מבלי לרעוד. להשאיר את הכובע רופף או להשתמש את כובע מסנן, כדי לאפשר חילופי גזים מספיק.
    הערה: Polysorbate 80 מתווסף המדיום כדי למנוע הצבירה של חיידקים. בנוסף, חשיפה לאור מוביל לשינויים פנוטיפי במושבות חיידקים (למשל, שינויי צבע לבן לצהוב). כדי למנוע זאת, להחזיק את התרבויות בחשכה.
  3. למדוד את הערך600OD עם ספקטרופוטומטרים. לדלל את תרבות נוזלי יתר600 של 0.07-0.09 ולהמשיך culturing במשך יומיים ב 29 ° C בחושך מבלי לרעוד. להשאיר את הכובע רופף.
    הערה: במהלך היומיים האלה, ההשעיה חיידקי תגיע עם יתר600של 0.5 המקביל יומן-בשלב מוקדם.

2. הכנה של פתרון חיידקי מדביק דג זברה למבוגרים

  1. להעביר את המתלים חיידקי cuvette עקר גדול או צינור 15 מ"ל ולמקם אותו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר כגיהנום הגדול להתיישב.
  2. להעביר mL 7-5 העליון של ההשעיה לתוך צינור נקי או cuvette ולמדוד את יתר600. השתמש השלב העליון הזה של המתלה עבור דלקות.
  3. לאסוף 1 מ"ל של התחממות עולמית מ תרבות לתוך צינור טריים צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 10,000 ג'י. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS x 1 סטרילי.
  4. לדלל להגיע ריכוז חיידקי הרצוי על-ידי שימוש סטרילי 1 x PBS 0.3 מ"ג/מ"ל פנול אדום כמו מכשיר מעקב. לחלק את המתלים מדולל שלושה aliquots.
    הערה: השתמש של יתר מראש600 לעומת CFU (המושבה יוצרי יחידות) / µL עקומה כדי להעריך הדילול הנדרש כדי לקבל את המספר המבוקש של חיידקים ב נפח הזרקה 5 µL34. המתאם בין OD600 וריכוז של ההשעיה חיידקי צריך להיות מאומתים לפני תחילת הניסויים זיהום בפועל. שמורת שבועיים לאיסוף נתונים אימות.
  5. באמצעות מזרק 1 מ"ל, לאט לאט למשוך המתלים. באמצעות 27 G מחט 3 x. עבור כל aliquot, לבצע שלב זה רק לפני השימוש.
    הערה: אין להשתמש פתרון חיידקי זהה עבור יותר מ 2 h.

3. ניסיוני התחממות עולמית מ זיהום עם הזרקת בקרום הבטן

  1. Pipette 5 µL droplet של הפתרון חיידקי מדולל על חתיכת סרט מצלמות-מיקרוסקופים ומשוך את ה-droplet לתוך מחט האינסולין 30 גרם.
  2. השתמש 5 – 8 חודש-זקן פראי-סוג דגים ודגים rag1−/−hu1999 מוטציה לניסוי. עזים ומתנגד דג זברה בוגרת במים טנק עם 0.02% 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר (pH 7.0). הצב הצד הבטני דגים למעלה לתוך חריץ על פלסטיק מוקצף לח.
    הערה: סמרטוט-/- דגים מוטנטים שלא מסוגלים לעבור רקומבינציה סומאטית ולייצר תאי T ו- B פונקציונלי.
  3. להחדיר את המחט בין הסנפירים האגן-כ 45° זווית. לשמור על הפתח המחט כלפי מעלה כדי לצפות כי הפתיחה כולו נמצא בתוך חלל הבטן. לאט לאט להחדיר את המתלים חיידקי, הסר בזהירות את המחט.
    הערה: במקרה מעקב אדום דולף החוצה הדג על הזרקת, אל תכלול את הדגים הניסוי.
  4. מיד לאחר ההזרקה, להעביר את הדג לתוך טנק התאוששות עם המים במיכל טריים.
  5. לקחת דגימות של התליה חיידקי על 7 שעות 10 צלחות בכל 15 דקות מ- בקטריאלי aliquot בשימוש דגירה החיידק ב 29 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים, לוודא את המינון זיהום על ידי ספירת המושבות על הלוחות.
  6. לבדוק לרווחתם של הדגים באופן קבוע, המתת חסד כל דג עם תסמינים של הזיהום עם מעל 0.02% ריכוז של אסתר אתיל חומצה 3-aminobenzoic (pH 7.0).
    הערה: כ, 7% דג זברה בוגרת נגוע 34 ± 15 CFU ו 30% של דג זברה נגוע 2029 ± 709 CFU היו תסמינים 8 שבועות19. הסימפטומים עשויים לכלול שחייה חריג, חוסר תגובה למגע, מתנשף, בצקת או מבזבז הנצפה.
  7. לשמור את דג זברה על פי סטנדרטים משותפים35.

4. אוסף של איברים פנימיים

  1. המתת חסד של דג זברה עם מנת יתר של 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר (מעל 0.02 נקודות ריכוז %, pH 7.0) במים טנק.
  2. להוסיף סיכה אחת אחורי קרני branchiostegal ועוד דרך הזנב צריך. להוסיף את הדג על הפלטפורמה.
  3. פתיחת חלל הבטן כל עם איזמל ולאסוף את האיברים הפנימיים באמצעות כפית קטנה עם פינצטה הסתיימה שארפ. נתחיל מן הלב ולעבוד לאורך עמוד השדרה לכיוון הזנב כדי לנתק את כל האיברים הפנימיים בבלוק אחד.
    הערה: הקפד לאסוף כל רקמת כליה על ידי גירוד לאורך עמוד השדרה עם הכפית.
  4. לבסוף, להשתמש מלקחיים לנתק את הבטן ליד קלואקה ולהעביר את האיברים לתוך צינור המגון 1.5 mL עם שישה 2.8 מ"מ חרוזים קרמיים. מיד להניח על קרח יבש להקפיא את הדגימה. ניתן לאחסן את הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס ובודקים.
  5. יש לשטוף את הכלים עם אתנול 70% בין אנשים.

5. המגון ו- RNA החילוץ בבלוק איברים.

הערה: השיטה הוא שונה את הפרוטוקולים של אוניברסיטת סטנפורד36.

  1. הוספת guanidine thiocyanate-פנול פתרון המשמש להפקת חומצות גרעין (טבלה של חומרים) בראש המדגם הנפח הכולל של 1,500 µL. להבטיח כי המדגם מכסה מקסימלית של 10% מהנפח הכולל.
    זהירות: הנפח הצפוי של הרקמה שנקטפו היא 100 µL. Guanidine thiocyanate-פנול פתרון מכיל רעילים, מעצבן תרכובות ואינה דורשת ביגוד מגן, nitrile כפפות ועבודה בשכונה fume. אל תשלבו עם מלבין כמו זה יגרום להיווצרות גזים רעילים. קרא את גליון הנתונים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש.
  2. Homogenize דוגמאות שימוש מהמגן חרוז-מכות של 3 פעמים ב-40 s ב- 3,200 סל ד. מגניב על הקרח ב-30 s בין המחזורים. Sonicate הדגימות homogenized באמבט מים במשך 9 דקות.
  3. Centrifuge את הדגימות ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר 1,000 µL של homogenate שנוקה לתוך צינור microcentrifuge טריים.
  4. להוסיף 200 µL של כלורופורם, לערבב מיד על ידי vortexing עבור 15 s דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    התראה: כלורופורם הוא רעיל, מגרה תרכובת אם נשאף, בלע או ליצור קשר עם העור או העיניים. להשתמש ציוד הבטיחות הדרושים להגנה אישית ועבודה בשכונה fume. קרא את גליון הנתונים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש.
  5. צנטריפוגה ב x 12,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להפריד בין השלבים מימית ואורגניים.
  6. . בזהירות, העברה µL 500 השלב העליון צינור טריים כדי להימנע מזיהום של RNA. להסיר, למחוק את השאר פאזה מימית (~ 100 µL) ולאחסן לאטמוספרה ושלב אורגני ב 4 ° C להפקת DNA.
    הערה: השלב העליון מכיל את ה-RNA.
  7. להוסיף 500 µL של 2-פרופנול ומערבבים מיד על-ידי vortexing עבור Incubate ס' 15 10 דקות בטמפרטורת החדר לזרז את הרנ א.
  8. צנטריפוגה ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה את הרנ א. הסר את תגובת שיקוע על ידי pipetting.
  9. להוסיף 1 מ"ל של 75% אתנול וביו -מערבולת 10 s.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן והמשיך הדגימות בן לילה ב 4 º C.
  10. צנטריפוגה ב 7,500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע על ידי pipetting.
  11. חזור על השלבים שטיפת 5.9-5.10. הסר את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting, תן בגדר מילה נהדרת בשכונה fume.
  12. להמיס בגדר RNA ב 500 µL של מים נטולי נוקלאז ולשמור את הדוגמאות על קרח. למדוד ריכוז עם ספקטרופוטומטרים microvolume או עם ציוד שווה ערך. לאחסן את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס.

6. טיהור של דג זברה משותפת שחולצו ודנ א Mycobacterial

  1. הכנת מאגר הגב-מיצוי (BEB) על ידי המסת 118.2 גר' guanidine thiocyanate (ריכוז סופי 4 מטר), 3.68 גר' נתרן ציטראט (ריכוז סופי 50 מ מ) ו- g 30.29 של בסיס חינם טריס (ריכוז סופי 1 מ') 120 מ של מים נטולי נוקלאז (מאי דורשים ערבוב בין לילה). להוסיף מים נטולי נוקלאז הנפח הכולל הסופי של 250 מ ל, מסנן כדי לעקר את הפתרון.
    הערה: מאגר זה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. אל תשלבו את BEB עם אקונומיקה, כפי שהם מגיבים מייצרים גזים רעילים כגון מימן כלורי, מימן ציאנידי.
  2. השתמש לאטמוספרה שלב אורגני של הדגימה כדי לחלץ דנ א mycobacterial. להוסיף 500 μL של BEB כל שפופרת. לערבב בהרחבה במשך 10 דקות על ידי היפוך בטמפרטורת החדר.
  3. Centrifuge הצינורות ב x 12,000 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולהעביר בזהירות 500 µL השלב העליון מימית המכילה צינור דנ א.
  4. להוסיף 400 μL של 2-פרופנול. לערבב על-ידי היפוך, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. Centrifuge את הדגימות ב x 12,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C. גלולה המכילה את הדנ א צריך להיות גלוי בשלב זה. הסר בזהירות את תגובת שיקוע על-ידי pipetting.
  6. להוסיף 800 μL של 70% אתנול. לשטוף את צניפה על-ידי היפוך. תעשה לא מערבולת הדגימות בשלב זה, דנ א גנומי נשברת בקלות.
  7. Centrifuge את הדגימות ב x 12,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. חזור על לשטוף את אתנול (שלבים 6.6 ו- 6.7).
  8. הסר האתנול על ידי בקפידה pipetting. תן שהדגימות מילה נהדרת עבור 5 – 10 דקות להמיס בגדר ב 200 μL של נוקלאז ללא מים.
  9. למדוד ריכוזים DNA עם ספקטרופוטומטרים microvolume או עם ציוד שווה ערך. ניתן לאחסן DNA ב 4 º C או ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.

7. PCR כמותי למדידת המון Mycobacterial

  1. להכין qPCR התגובה מתערבב עם לא-רוקס (carboxy-X-rhodamine) כנגד מסיה התחממות עולמית פנימי משועתקים מרווח (ITS) בין 16-23S ITS לפי הוראות היצרן עם MMITS1 תחל (טבלה 1). Pipette את המיקס התגובה ולטעום דילולים ככפילויות על צלחת 96-ובכן מתאים qPCR. לכלול סדרה דילול תקן ה-DNA כמות ידועה של חיידקים כל הפעלה.
    הערה: צפויה התחממות עולמית מ טען לכל דג שיכול לנוע בין 0 CFU 1,000,000 CFU-4 wpi. וזמינותו qPCR יכול להתבצע גם עם ערכות qPCR אחרים אך הטמפרטורה מחזק עבור תחל חייב להיות מחדש ממוטבת.
  2. לאטום את הצלחת עם סרט שקוף אופטית, centrifuge את הצלחת ב 2,000 x g למשך 2 דקות ב 4 º C.
  3. הפעל את התוכנית qPCR המוצגים בטבלה 2.
  4. באמצעות עקומת סטנדרטי, לחשב את מספר החיידקים במדגם דג שלם.

8. DNase טיפול של הדגימות RNA

  1. כדי להסיר עקבות הנותרים אפשרי של הדנ א RNA, לבצע DNase אני טיפול. להפשיר את הדגימות RNA על קרח.
    הערה: הקפד להשתמש רק RNase ללא ציוד ופתרונות ונגב את משטח העבודה ואת פיפטות עם ריאגנט טיהור חיסול RNases (טבלה של חומרים) לפני שמתחילים לעבוד. ללבוש חלוק מעבדה עם שרוולים ארוכים וכפפות כדי להגן על דגימות שלך.
  2. להכין 10 μL DNase אני מתערבב התגובה על קרח על פי הוראות היצרן. לערבב 1 μL של DNase אני, μL 1 של 10 x DNase מאגר, μL 8 של RNA לטעום כולל היותר μg 1 של RNA.
  3. בעדינות לערבב את התגובות (לא vortexing), תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. לפני החום-איון, להוסיף 1 µL של 50 מ מ EDTA כל מדגם µL 10. אם לא יתווסף EDTA, ה-RNA יעבור השפלה כימי כאשר מחומם.
  5. תקופת דגירה של 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס החום-בטל DNase אני להמשיך ישירות אל cDNA סינתזה או לאחסן את הרנ א DNase שטופלו ב- 80 ° c

9. cDNA סינתזה

  1. לשמור כל ריאגנטים ודוגמאות על קרח, להכין את תערובות התגובה בהתאם להוראות היצרן. עבור תערובת התגובה 5 μL, כוללים μL 1 של מיקס מאסטר שעתוק הפוכה, μL 3 של נוקלאז ללא מים או μL 1 של DNase מתייחסים RNA.
  2. לערבב בעדינות את התגובות שעתוק במהופך, בקצרה לסובב את הצינור, במידת הצורך.
  3. הצב דגימות במכונת ה-PCR והשתמש התוכנית המוצגת בטבלה3.
  4. לדלל את cDNA במים נטולי נוקלאז עבור qPCR כדי ריכוז מרבי של 2.5 ng/μL, במידת הצורך. ניתן לאחסן cDNA ב-20 ° C.

10. מדידת דג זברה גנים על ידי ה-PCR כמותי

  1. להכין תערובת בסיס qPCR על הקרח על פי הוראות היצרן, להגן מפני אור. השתמש את תחל הציגה בטבלה1.
    הערה: כדי לחשב כאשר הקיפול של אינדוקציה על כל הגן, למדוד את הביטוי גם מתוך מדגם בסיסית במאגר מופק 6 דג זברה בריא.
  2. להכין בית כל דגימה, pipette את תערובות התגובה לצלחת qPCR. לאטום את הצלחת עם סרט שקוף אופטית, centrifuge את הצלחת ב x 2,000 g למשך 2 דקות ב 4 ° C לפני תחילת המרוץ.
  3. תוכנית שמוצג בטבלה 4 עם הטמפרטורה מחזק בהתאם הזוג תחל להפעיל את qPCR בשימוש (טבלה 1).
  4. לנתח את היחס ביטוי גנים לעומת גן משק בית (loopern437) עם השיטה ΔCt באמצעות המשוואה:
    figure-protocol-1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המחלה טבעי דגים התחממות עולמית משפיע על האיברים הפנימיים של דג זברה ומייצרת זיהום מערכתי עם גרנולומות בהיסטולוגיה גלוי19. דג זברה בוגרת נגועים מ התחממות עולמית על ידי זריקה בקרום הבטן. ה-DNA ו RNA המחולצים ולאחר העומס mycobacterial נמדד על ידי כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) באמצעות ה-DNA כתבנית. קווי המתאר של השיטה מוצגת באיור1.

המספר הראשוני של mycob...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן נתאר יישום מבוסס-qPCR כדי למדוד המון mycobacterial מ- DNA מופק דג זברה בוגרת השפעול נגוע רקמות. יישום זה מבוסס על תחל עוצב סביב ה 16-23S rRNA פנימי מרווח משועתקים רצף40. העומס mycobacterial הכולל דוגמאות הדגים מוערכת באמצעות עיקול רגיל שהוכנו מ- DNA מופק מספר ידוע של mycobacteria בתרבית, בהנחה שהחיידק אחד יש עותק אחד של הגנום שלו בכל רגע נתון. גבול זיהוי qPCR מ' התחממות עולמית -הוא כ 100 המושבה יוצרי יחידות18. יתרון ברור של השיטה בהשוואה ציפוי מסורתי הוא גם פעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו היא נתמכה על ידי פינית תרבותית קרן (מרגשת), קרן שחפת טמפרה (ה. ל., ל'-M.V., M.M.H., ד. נ), הקרן של האגודה נגד שחפת פינית (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (מרגשת, M.M.H., ד. נ), סיגריד Jusélius קרן (ד. נ), אמיל Aaltonen קרן (M.M.H.), ג'יין, קרן Erkko Aatos (ד. נ), האקדמיה של פינלנד (ד. נ). לינה Mäkinen, חנה-לינה Piippo, ג'נה Ilomäki הם הכירו לסיוע טכני שלהם. המחברים להכיר המעבדה דג זברה טמפרה עבור השירות שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Mycobacterium marinumAmerican Type Culture CollectionATCC 927
Middlebrock 7H10 agarBD, Thermo Fisher Scientific11799042
Middlebrock OADC enrichmentBD, Thermo Fisher Scientific11718173
Middlebrock 7H9 בינוניBD, Thermo Fisher Scientific11753473
העשרת Middlebrock ADC BD, Thermo Fisher Scientific11718173
Tween 80Sigma-AldrichP1754
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516-500 מ"ל
ספקטרופוטומטר GENESYS20Thermo Fisher Scientific
Phosphate טבליות מלח חוצצות (PBS)Sigma-AldrichP4417-50TAB
פנול אדוםSigma-AldrichP3532
27 גרם מחטHenke Sass Wolf4710004020
מזרק 1 מ"ל HenkeSass Wolf4010.200V0
Omnican 100 30 G מחט אינסוליןבראון9151133
3-אמינובנזואית חומצה אתיל אסטר (pH 7.0)Sigma-AldrichA5040
1.5 מ"ל צינור הומוגניזציהQiagen13119-1000
חרוזי קרמיקה 2.8 מ"מQiagen13114-325
אתנול, ETAX AaAltia
2-פרופנולסיגמא-אולדריץ'278475
כלורופורםVWR22711.290
גואנידין תיוציאנטסיגמא-אולדריץ'G9277FW 118.2 גרם/מול
נתרן ציטראטSigma-Aldrich1613859 FW 294.1 גרם/מול
Tris (בסיס חופשי)Sigma-AldrichTRIS-ROFW 121.14 גרם/מול
TRI ריאגנטמרכז מחקר מולקולריTR118תמיסת גואנידין תיוציאנט-פנול
PowerLyzer24 הומוגניזטורQiagen
Sonicator m08Finnsonic
Nanodrop 2000Thermo פישר סיינטיפיק
SENSIFAST No-ROX SYBR, גרין מאסטר מיקסביוליין BIO-98005
qPCR 96 בארות צלחתBioRadHSP9601
סרט שקוף אופטיתBioRadMSB1001
C1000 מחזור תרמי עם מערכת CFX96 בזמן אמתBioRad
RNase AWAYThermo Fisher Scientificמגיבטיהור 10666421 מבטל RNases
DNase IThermo Fisher ScientificEN0525
תמלול הפוך מאסטר מיקסFluidigm100-6298
SsoFast אווה גרין מאסטר מיקסBioRad172-5211

מקורות

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703(2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196(2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091(2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75(2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל לשחפתהזרקה תוך-peritoneאליתPCR כמותימיצוי חומצות גרעיניותתגובת מערכת החיסון של המאכסןמדידת עומס חיידקיחסינות אדפטיביתזיהום רדום
מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.