זרימת עבודה באמצעות צנטריפוגה לזרום cytometry או דיפרנציאלית מפותחת לזהות, לבודד את הגופות אפופטוטיים להיפגע מן דוגמה אפופטוטיים להיפגע טוהר גבוהה לכמת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מוות גופים (ApoBDs), שלפוחיות זעירות exosomes הם אנשי מפתח של משפחת שלפוחית חוץ-תאית, עם ApoBDs של הסוג הגדול. זה הוצע כי ApoBDs יכול לסייע תא סיווג, כמו גם המערכת בתקשורת דרך מולקולות לסחר בבני אדם. גישות קונבנציונליות, המשמש את זיהוי ובידוד של ApoBDs מוגבלים לעיתים קרובות על ידי העדר כימות מדויק וטוהר מדגם נמוך. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס, לאמת ApoBD היווצרות לבודד ApoBDs על טוהר גבוהה. אנו גם חלוקה לרמות, להשוות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) וגישות צנטריפוגה דיפרנציאלי המבוסס על מנת לבודד ApoBDs. יתר על כן, טוהר ApoBDs מבודדים תאושר באמצעות בעבר להקים לזרום cytometry מבוססי מכתים ושיטת אנליטית. יחדיו, באמצעות הגישה המתוארת, THP-1 מונוציט אפופטוזיס ועל מוות תא פירוק היה המושרה ואומתו, והיו ApoBD המופקים THP-1 ומונוציטים מבודד טוהר של 97-99%.
מבוא
אפופטוזיס, צורה למד היטב של מוות תאים מתוכנת, נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגית וכדי להסיר תאים מזיקים בתוך גוף האדם1. לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס, מוות תאי (ApoCells) ניתן לעבור סדרה של שינויים מורפולוגיים, לפרק לתוך שלפוחית ממברנה מכורך קטן הנקרא ApoBDs. באופן כללי, תהליך זה מכונה פירוק התא אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות מחולק 3 שלבים נפרדים בהתבסס על מורפולוגיה2,3. שלב 1 (קרום פלזמה blebbing) מאופיין על ידי היווצרות של מבנים דמויי בלון על פני תאים המכונה מגדלים פורחים4,5. שלב 2 (אפופטוטיים להיפגע תיתכן היווצרות) כולל להי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אינדוקציה של אפופטוזיס
- תגובת שיקוע כדי להסיר את כל שאריות תאים קיימים צנטריפוגה דגימות התאים ב g 300 x במשך 5 דקות וזורקים.
הערה: בעת שימוש תאים חסיד, זרע תאים מראש ולא לשטוף עם 1 x באגירה פוספט פתרון (PBS) לפני אפופטוזיס. - לקבוע את מספר הטלפון הנייד ולאסוף תאים.
הערה: בהתאם הבידוד שלאחר assay, אנו ממליצים על מספר התא ההתחלתי לפחות 1 x 107 תאים. - Resuspend בתקשורת מלאה (בהתאמה בינוני המכיל 10% (vol/כרך) עגל עוברית סרום, פניצילין 50 IU/mL, 50 תערובת סטרפטומיצין µg/mL) עבור ריכוז סופי של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
- Aliquot ~ 2 x 106 תאים לכל טוב של צלחת טוב 6.
- כדי לגרום אפופטוזיס, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות ההליך שתואר כאן, אפופטוזיס מונוציט THP-1 היה המושרה, ApoBDs היו זוהה, מבודדים באמצעות או מבוסס-FACS או גישה דיפרנציאלית צנטריפוגה (איור 1). ראשית, אפופטוזיס היה המושרה על ידי הקרנת UV, דגימות נאספו לאחר 2-3 h של דגירה כאשר תאים הציג אפופטוטיים להיפגע מורפולוגיות, כולל blebbing, מוות ממברנה תיתכן היווצרות הדור של ApoBDs6. שיטה cytometry זרימה אל-PRO-3, מבוסס על A5 נעשה שימוש כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס מונוציט ויצירת Apo.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאז התיאור שלו בתחילת שנות החמישים, השדה של אפופטוזיס התקדם במידה ניכרת, להפוך אזור מחקרים בולטים. למרות האינטרס הרחב המאמצים, היבטים מסוימים של אפופטוזיס, בפרט היווצרות של ApoBDs, לא טוב נחקרו בשל היעדר מתודולוגיות המתאים. אלה כוללים בעיקר המגבלה תוך מעקב אחר התקדמות אפופטוזיס, היווצרות ApoBD בו זמנית באמצעות cytometry זרימה המסורתי של ניתוח A5/PI הזיהומים ApoBD בידוד. לאחרונה פותחו גישות כדי לטפל אלה חסרונות מתודולוגיים.
הגישה החדשה שלנו זרימה מבוססי cytometry האנליטית מאפשר ApoBDs, אשר לעית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
נארגן את זה נתמך על ידי מענקים הלאומי לבריאות ואת המועצה למחקר רפואי (GNT1125033 ו- GNT1140187) מועצת המחקר האוסטרלי (DP170103790) I.K.H.P.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאים כגון מונוציטים אנושיים מתורבתים THP-1 (מספר שיבוט: TIB-202) | ATCC-RPMI | ||
| 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| תערובת פניצילין-סטרפטומיצין | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | ||
| Annexin V FITC | BD יודיד | ||
| Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 עלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה. הימנע ממגע ישיר. | |
| 10x מאגר מחייב Annexin V | Bioscience | 556454 | |
| 1001710526 | EDTA | Sigma-Aldrich | |
| (15 מ"ל) | Cellstar | ||
| (1.5 מ"ל) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| חממת תרביות רקמות (37 & deg; C, 5% CO2)- | - | ||
| בקמן קולטר | 392932-FACS | ||
| ARIA III ציטומטר זרימה, מוגדר עם שני לייזרים לזיהוי FITC ו-APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Canto II Flow cytometer, מוגדר עם שני לייזרים לזיהוי FITC ו-APC | BD Bioscience-FACS | ||
| Diva 6.1.1 תוכנה | BD Bioscience | - | |
| תוכנת FlowJo 8.8.6 | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
מקורות
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
