זיהוי ובידוד של מוות לגופים טוהר גבוהה

אפופטוזיס, צורה למד היטב של מוות תאים מתוכנת, נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגית וכדי להסיר תאים מזיקים בתוך גוף האדם¹. לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס, מוות תאי (ApoCells) ניתן לעבור סדרה של שינויים מורפולוגיים, לפרק לתוך שלפוחית ממברנה מכורך קטן הנקרא ApoBDs. באופן כללי, תהליך זה מכונה פירוק התא אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות מחולק 3 שלבים נפרדים בהתבסס על מורפולוגיה^2,3. שלב 1 (קרום פלזמה blebbing) מאופיין על ידי היווצרות של מבנים דמויי בלון על פני תאים המכונה מגדלים פורחים^4,5. שלב 2 (אפופטוטיים להיפגע תיתכן היווצרות) כולל להיווצרות בליטות ממברנה ארוך כמו apoptopodia, apoptopodia עם חרוזים, microtubule קוצים^6,7,8. לבסוף, בשלב 3 (היווצרות ApoBD) כוללת את הפיצול בליטות מוות ו/או ApoCells כדי ליצור^6,ApoBDs⁹. ממצאים קודמים הציעו תפקיד של ApoBDs ב מוות תא סיווג וסיוע תיווכה תקשורת המערכת. כך למשל, מוצע כי חלוקת ApoCell לתוך ApoBDs עשוי לייצר קטן '' הסוף יכול להסירו בקלות על-ידי תחימת phagocytes^2,10,11. יתר על כן, ייתכן ApoBDs הארבור סדרה של מולקולות כמו DNA, RNA וחלבונים, אשר עשוי להיות הנסחר את התאים המקיפים אותם כדי להקל על התא-תא תקשורת^12,13,14. לחקור באופן פונקציונלי תהליכים אלה, זה חיוני כדי לאשר שלושה פרמטרים מרכזיים כולל (i) אימות של אפופטוזיס ויצירת ApoBD, (ii) בידוד של ApoBDs, וכן (iii) אישור של טוהר ApoBD.

בעבר, היו בשימוש מספר שיטות כולל cytometry זרימה ואלקטרון ללמוד ואפופטוזיס ו ApoBDs^15,16,17,18. עם זאת, ApoBD זיהוי, כימות הם לעתים קרובות קשה או תסולא בפז. למשל, ביותר-בשימוש שגרתי לזרום cytometry מבוססי אפופטוזיס assay מעסיקה annexin V (A5, חלבון זה מאגד את המוחצנים ' לאכול-לי ' האות phosphatidylserine (PtdSer)) חומצת גרעין כתם propidium יודיד (PI)¹⁹. עם זאת, באמצעות שילוב הכתם אוניברסלי, ניתוח מבוסס על ההנחה כי יש רק שלושה סוגים של תאים קבוצות משנה (התאים קיימא, ApoCells ותאי נמק) במדגם. יתר על כן, למרות נחשב "תקן הזהב" על ידי חוקרים רבים עבור אפופטוזיס, מבחני cytometry זרימה, ניתוח הנתונים הבאים לעיתים קרובות אינו כולל ApoBDs דרך צעד המגביל ראשוני בחירת אירועים^{בינוני-גבוהה} FSC/האס. לכן, פיתחנו לאחרונה וזמינותו cytometry זרימה הרומן באמצעות A5 ואל-PRO-3, עוד כתם nucleic יכול להיות סלקטיבי נלקח על ידי קספאז 3/7-הופעלו pannexin 1 (PANX1) ערוצי^7,20. כפי קספאז 3-induced PANX1 ההפעלה לפני חשיפה PtdSer בשלב מוקדם של אפופטוזיס, אל-PRO-3 כתמים באופן שונה אפופטוטיים להיפגע ותאים נמק. בנוסף, גישה זו בשילוב עם הרומן שלנו gating אסטרטגיה כוללת אירועים הכל רכשה במהלך ניתוח נתונים, כתוצאה מכך, שישה תאים/חלקיקים תת-ערכות מזוהים, לרבות: (i) התאים קיימא (FSC/האס^{בינוני/גבוה}, A5^נמוך , אל-PRO-3^נמוך), (ii) A5^– ApoCells מוקדם (FSC/האס^{בינוני/גבוה}, A5^נמוכה, אל-PRO-3^ביניים), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/האס^{בינוני/גבוה}, A5^גבוהה , אל-PRO-3^ביניים), תאים עם נמק (iv) או מאוחר ApoCells (FSC/האס^{בינוני/גבוה}, A5^גבוה, אל-PRO-3^גבוהה) (v) ApoBDs (FSC/האס^נמוך, A5^ביניים, אל-PRO-3^{נמוך / ביניים}), ו (vi) פסולת (FSC/האס^נמוך, A5^נמוכה, אל-PRO-3^נמוכה)²⁰. הגישה שלנו מדגישה את החשיבות של ניתוח כל התאים/חלקיקים קבוצות משנה ו, וחשוב, ההפרדה של ApoBDs מן התאים פסולת²⁰. לפיכך, גישה זו מדגימה טכניקה יעילה כדי לאמת את אינדוקציה של אפופטוזיס ויצירת ApoBD בו זמנית.

באופן מסורתי, ApoBDs היו מבודדים באמצעות מגוון רחב של גישות צנטריפוגה דיפרנציאלי לפיו ניתן להפריד ApoBDs תאים או אחרים שלפוחית חוץ-תאית בהתבסס על צפיפות. עם זאת, שיטות כאלה צנטריפוגה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי נמוך ApoBD טוהר, חוסר צעד כימות לאשר מדגם טוהר, ו/או חוסר היכולת להפריד בין תאים ייחודיים לסוג ApoBDs^17,21,22. לכן, לאחרונה פיתחנו שתי הגישות, מבוסס-FACS, דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גישה חדשה אשר יכול להיות בשילוב עם שיטת cytometry זרימה שנקבעו קודם שלנו כדי לאמת את אינדוקציה של טוהר אפופטוזיס ודגימת²³. ApoBD בידוד באמצעות הגישה שלנו מבוססת-FACS יכול להעשיר ApoBDs של עד 99% טוהר, יכול להיות בשילוב עם מגוון רחב של נוגדנים ייחודיים לסוג התא כדי לבודד ApoBDs אוכלוסיות מעורבות לתאים, דגימות רקמה, נוזלי גוף²³. יתר על כן, הגישה שלנו צנטריפוגה דיפרנציאלית המתוקן מדגימה שיטה יעילה כדי לבודד ApoBDs כדי > 90% טוהר²³.

בנייר זה, נתאר בפירוט שלנו הליך ניסיוני לאימות אפופטוזיס, וכדי לזהות ולכמת היווצרות ApoBD. ApoBD בידוד של זרימות העבודה בשיטות FACS ומבוססי -דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גם פירט, בהשוואה. הנתונים נציג מדגימים כי המתודולוגיה המתוארת מספק כלי יעיל חדשנית ללימודי ApoBD בעתיד.

1. אינדוקציה של אפופטוזיס

1. תגובת שיקוע כדי להסיר את כל שאריות תאים קיימים צנטריפוגה דגימות התאים ב g 300 x במשך 5 דקות וזורקים.
   הערה: בעת שימוש תאים חסיד, זרע תאים מראש ולא לשטוף עם 1 x באגירה פוספט פתרון (PBS) לפני אפופטוזיס.
2. לקבוע את מספר הטלפון הנייד ולאסוף תאים.
   הערה: בהתאם הבידוד שלאחר assay, אנו ממליצים על מספר התא ההתחלתי לפחות 1 x 10⁷ תאים.
3. Resuspend בתקשורת מלאה (בהתאמה בינוני המכיל 10% (vol/כרך) עגל עוברית סרום, פניצילין 50 IU/mL, 50 תערובת סטרפטומיצין µg/mL) עבור ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10⁶ תאים/מ ל....
4. Aliquot ~ 2 x 10⁶ תאים לכל טוב של צלחת טוב 6.
5. כדי לגרום אפופטוזיס, להסיר את המכסה צלחת, לעורר תאים-150 mJ/cm² תוך שימוש בעוצמה של UV. זה צריך לקחת כ- 30-60 s.
   הערה: לפני הקרנה, ודא כי ~0.5 x 10⁶ תאים נשמרים עבור הפקד תא 'Untreated'.
   הערה: אפופטוזיס יכולה גם להיגרם באמצעות שיטות אחרות כגון אנטי-אופנה או סרום הרעבה⁶.
6. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ 2-8 שעות, בהתאם לקו תא.
7. באמצעות מיקרוסקופ אור העליון ספסל, דמיינו תאים כדי לאשר הנוכחות של מוות מורפולוגיות, כגון blebbing, היווצרות apoptopodia ApoBD היווצרות.
   הערה: 40 X הגדלה מספיקה
8. באמצעות פיפטה P1000, פיפטה ולאסוף דגימות אפופטוטיים להיפגע.
9. לשטוף את הצלחת עם 1 x PBS ולשלב עם דגימת הנותרים כדי להבטיח מקסימום תשואה.
10. ~1/10 לאסוף^th למדגם "כל מוות" (WAS) לשלוט.
11. איסוף הדגימה 'מטופל'.
12. Centrifuge דגימות WAS והן Untreated ב 3000 g x במשך 6 דקות.
13. Resuspend ב מ 1 ל 1 x PBS, להפריש על קרח.
14. ApoBD בידוד, להמשיך גם שלב 2 או 3 עם הדגימה אפופטוטיים להיפגע הנותרים.

2. ApoBD בידוד באמצעות FACS

1. Centrifuge המדגם כולו ב 3000 g x במשך 6 דקות.
2. הסר את רוב תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר.
3. Resuspend בפתרון מכתימים המכיל 1 מ"ל מאגר איגוד x A5 1, µL 75 של A5-FITC, 2 µL של-PRO-3 לכל עונה 1 פרק 10⁷ תאים.
4. דגירה מדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
5. מוסיפים 1-2 מ ל 1 מאגר איגוד x A5, צנטריפוגה מדגם ב 3000 g x עבור 6 דקות להסיר את הכתם עודף.
   הערה: עבור אוכלוסיות מעורבות לתאים או דגימות רקמה, לבצע נוגדן מכתים שלב באמצעות שילוב של סמנים ייחודיים לסוג התא במאגר איגוד x A5 1, דגירה על קרח למשך 20 דקות (או לפי הפרוטוקול של היצרן) לפני צנטריפוגה ב 3000 g x 6 min.
6. Resuspend צנפה מדגם ב- 3 מ"ל של מאגר FACS (1 x PBS, מאגר איגוד x A5 1, 10% FSC, 2 מ מ EDTA) לכל עונה 1 פרק 10⁷ תאים.
7. לסנן דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך הסיבוב-תחתון, צינור פוליפרופילן (cytometry זרימה) ולשמור על דגימות על קרח, בחושך.
8. להפעיל את המכונה FACS, לבצע הסטנדרטי הגדר שימוש זרבובית 100 מיקרומטר, לבצע את עיכוב שחרור ולהבטיח זרם יציב.
9. לטעון את הדגימה והגדר רכישה מהירות ~ 1000 אירועים/s.
10. להתאים FSC, האס, APC (אל-PRO-3) ואת המתחים FITC (A5) ומקם את האירועים בתוך העלילות FACS כדי להבטיח אוכלוסיות ניתן להפריד בבירור.
11. שיא אירועים 20,000.
12. הגדרת אסטרטגיה חסימה כמו חלק 4.
13. בפריסה של מיון, הוסף את השער ApoBD הסופי האוכלוסייה המיון הרצויה.
14. להתחיל רכישת המדגם ולבצע מעין מבחן על ידי איסוף 5,000-10,000 ApoBDs לתוך צינור חדש המכיל ~ 250 µL FACS מאגר.
15. ביצוע מערכת סומק בחזרה וממוינות עומס ApoBDs.
16. לרכוש ולתעד בדיקה-מיון ApoBDs.
17. בדוק הטוהר ApoBD ~ 99% על-ידי השוואת FSC (ציר y) לעומת A5 (אירועי ציר x).
    הערה: A5 מכתים עשויה להפחית מעט בעת מחדש ניתוח דגימות בשל הלבנת לייזר.
18. ברגע טוהר גבוהה מושגת, לטעון את הדוגמה הראשונה ולהמשיך מיון עד התקבל המספר הרצוי של ApoBDs.
    הערה: אם יש צורך, מיון כפול יכול להתבצע לבודד בו זמנית ApoCells ו- ApoBDs.
    הערה: בעת מיון על פני תקופה ארוכה של זמן, אנו ממליצים המקננת הצינור אוסף ב 4 º C.
19. לאחר מיון תושלם, לאסוף חלק קטן של פוסט-מיון ApoBDs, פוסט-למיין ApoCells, Untreated ו WAS לאמת אפופטוזיס, לאשר פוסט-מיון טוהר.
    הערה: למרות הבדיקה-מיון וטוהר פוסט-מיון כדאי לא שונים באופן משמעותי, זה מבוסס על הגדרות זרם ועל יציבות.

3. ApoBD בידוד באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. Centrifuge המדגם אפופטוטיים להיפגע הנותרים ב g x 300 למשך 10 דקות.
2. לאסוף את תגובת שיקוע, עוזב µL ~ 500 כדי להימנע מהפרעה בגדר תא, ומוסיפים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
3. להסיר את µL 500 הנותרים, resuspend בגדר תא ב- 2 מ של PBS 1 x (זה מייצג את 'השבר מועשר ApoCell'.
4. Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו במשך 20 דקות ב 3000 g.
5. בדוק אם גלולה, הסר בזהירות את תגובת שיקוע (תגובת שיקוע עשויים להכיל שלפוחית קטנה חוץ-תאית כולל שלפוחיות זעירות, exosomes).
6. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS 1 x (זה מייצג את השבר 'מועשר ApoBD')
7. לאסוף 100 µL של כל Viable, WAS, מועשר ApoCell, ודוגמאות ApoBD מועשר ב חדש עגול-תחתון, שפופרת פוליסטירן (cytometry זרימה).
8. להוסיף 100 µL של כתם המכיל 2 x A5 מאגר מחייב בטחונות A5-FITC, 1:1,000 אל-PRO-3
9. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בחושך.
10. לנתח דגימות ידי cytometry זרימה, באמצעות אסטרטגיה המגביל כמתואר לעיל כדי לאמת את אינדוקציה מוצלחת של אפופטוזיס וטוהר של השבר מועשר ApoBD.

4. לזרום Cytometry Gating אסטרטגיה

1. מגרש אל-PRO-3 (ציר y) נגד FSC (ציר x) להפריד (אל-PRO-3^גבוהה) עם נמק תאי כל שאינו permeabilized אירועים אחרים (אל-PRO-3^{בינוני/נמוך}).
2. בחר כל האירועים שאינם permeabilized, עלילה האס נגד A5. שער שתי האוכלוסיות לרבות האוכלוסייה 1 (P1), האס^{בינוני/גבוה}, התאים^{נמוך/ביניים} A5 והאוכלוסיה 2 (P2), כל האירועים האחרים.
3. מ- P2, מגרש אל-PRO-3 נגד A5 ובחר A5 אירועים^{בינוני/גבוה} כדי לא לכלול את כל שאריות תאים.
4. בחר כל האירועים חיובי A5, מגרש FSC נגד A5. להפריד בין ApoBDs (FSC^נמוך) לבין ApoCells (FSC^{ביניים/גבוהה}).
   הערה: כאשר gating ApoBDs ApoBD בידוד באמצעות הגישה מבוססת-FACS, אנו ממליצים על צעד סופי על-ידי בחירת ApoBDs, השוואה בין אל-PRO-3 ל A5 ובחירה כל האירועים. פעולה זו מבטיחה כי השער המיון הסופי משתמש זריחה במקום פרמטרים FSC/האס.
5. לניתוח תא קיימא, בחר P1 ולבצע לאחד שתי אסטרטגיות חסימה. לניתוח כללי תא קיימא, מגרש FSC נגד A5, לבחור את כל התאים^{בינוני/גבוה} FSC, ולכן הסרת שאריות תאים הנותרים. לחלופין, עבור ניתוח מעמיק, התאים קיימא ניתן להפריד בין A5^– ApoCells מוקדם ידי אל-PRO-3 נגד FSC. בחר אל-PRO-3^נמוך,^{בינוני/גבוה} FSC התאים קיימא, אל-PRO-3^ביניים, FSC^{בינוני/גבוה} A5^– ApoCells המוקדמות.

באמצעות ההליך שתואר כאן, אפופטוזיס מונוציט THP-1 היה המושרה, ApoBDs היו זוהה, מבודדים באמצעות או מבוסס-FACS או גישה דיפרנציאלית צנטריפוגה (איור 1). ראשית, אפופטוזיס היה המושרה על ידי הקרנת UV, דגימות נאספו לאחר 2-3 h של דגירה כאשר תאים הציג אפופטוטיים להיפגע מורפולוגיות, כולל blebbing, מוות ממברנה תיתכן היווצרות הדור של ApoBDs6. שיטה cytometry זרימה אל-PRO-3, מבוסס על A5 נעשה שימוש כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס מונוציט ויצירת ApoBD על-ידי הפרדת התאים קיימא, תאים עם נמק, מוקדם ApoCells, ApoCells, ApoBDs, פסולת (איור 2). יחדיו, ניתוח cytometry זרימה ציין כי תוצאות טיפול UV ~ 20% ApoCells (איור 3).

מונוציט THP-1 ApoBDs היו אז מבודד את WAS באמצעות שתי גישות. ראשית, הדגימות היו מוכנים טוהר גבוהה גישה המבוססות על FACS, שבו רק צעד בודד צנטריפוגה מחויבת הצניפה המדגם כולו אפופטוטיים להיפגע לפני צביעת ו FACS. שיטה זו מתאימה עבור מבחני פונקציונלי כאשר באופן משמעותי טוהר גבוהה מדגם נדרש (לדוגמה, לניתוח qPCR), כאשר נדרש מספר מסוים של ApoBDs או בעת רכישת תא ApoBDs ייחודיים לסוג מתוך מדגם מורכבים. באמצעות מתודולוגיה זו, ApoBDs היו מבודדים לטוהר ~ 99% (איור 4).

בשלב הבא, מונוציט THP-1 ApoBDs היו גם מבודד דרך שני שלבים, גישה דיפרנציאלית צנטריפוגה. השלב הראשון כולל את ניתוקה של התאים קיימא, ApoCells ותאי נמק. השלב השני כולל ההפרדה של ApoBDs גדול יותר מן שלפוחית קטנה חוץ-תאית כגון שלפוחיות זעירות, exosomes, אשר אינם מסוגלים להיות מגורען, ב-3,000 x cytometry זרימה g. בוצע ואז לאשר אפופטוזיס וטוהר מדגם ApoBD, הפגינו דוגמה מועשר ApoBD המכיל ~ 97% ApoBDs (איור 4). זה מציג שיטה מהירה ויעילה כדי לבודד ApoBD לטוהר גבוה יחסית, מתאים כאשר לטיהור ApoBDs מדגימות להכיל סוג תא בודד.

איור 1 . תרשים סכמטי של בידוד ApoBD דרך גם גישה דיפרנציאלית או מבוססי FACS צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . Flow cytometry gating אסטרטגיה. שש קבוצות משנה תא/חלקיקים (לרבות התאים קיימא, A5– ApoCells מוקדם, A5+ ApoCells, תאים עם נמק, ApoBDs ופסולת) מזוהה ומשמש לבחירת ApoBD לבידוד מבוססי FACS. (א) ממברנות התאים נמק של permeabilised מופרדים מאירועים שאינם permeabilised. (ב) A5נמוך-בינוני, האסנמוך-גבוה תאים מופרדים A5נמוך-גבוה אירועים. (בי. אני צריך) בניתוח עומק, התאים קיימאנמוך אל-פור-3 ניתן להפריד בין אל-PRO-3ביניים A5– ApoCells המוקדמות. (b.ii) לחלופין, בעת חישוב פשוט ApoBD טוהר, התאים קיימא ניתן להפריד מאירועיםנמוך FSC. (ג) A5 פסולתנמוכה אינן נכללות. (ד) FSCבינוני/גבוה ApoCells מופרדים FSCנמוך ApoBDs. (ה) כל A5-ל-PRO-3בינוני/גבוה ApoBDs נבחרים למיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

איור 3 . אימות של אפופטוזיס מונוציט THP-1- ניתוח cytometry זרימה של monocytes THP-1 אינו מטופל או מוקרן UV בוצע כדי לקבוע את הרמות של התאים קיימא, A5– ApoCells מוקדם, A5+ ApoCells, תאים עם נמק.

איור 4 . טיהור של THP-1 מונוציט נגזר ApoBDs. מבודדים THP-1 נגזר מונוציט ApoBDs דרך גם בגישה צנטריפוגה דיפרנציאלית או מבוססי FACS מבוסס, מציג את העשרת של ApoBDs התאים קיימא, ApoCells, תאים עם נמק בוצעה אנליזה cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.