Method Article

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מולקולות ביולוגיות בחיי עיר ולנטר את הדינמיקה ואת אינטראקציות בזמן אמת. בנוסף מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-זריחה, פותחו טכניקות הדמיה שונות כדי להשיג את מטרותיה ניסיוני. כמה הטכניקות בשימוש נרחב כוללים קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת תהודה העברת אנרגיה (smFRET), אשר יכול לדווח על שינויים הסתגלותי ואינטראקציות מולקולרית עם רזולוציה אנגסטרום, המבוססת על זיהוי מולקולה בודדת סופר רזולוציה (SR) הדמיה, אשר יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית כ עשר כדי twentyfold בהשוואה מיקרוסקופ עקיפה-מוגבלת. כאן אנו מציגים מעוצבת ללקוח משולב מערכת, אשר ממזג שיטות הדמיה מרובות במיקרוסקופ אחד, כולל הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה של צבע רב גילוי מולקולה בודדת, כולל הדמיה smFRET. שיטות הדמיה שונות ניתן להשיג בקלות, reproducibly על ידי החלפת רכיבים אופטיים. זה קל לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות עלות מופחתת וחלל ביחס בניין נפרד מיקרוסקופים לצורכי הפרט.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים כלים חשובים למחקר במדעי הביולוגיה המודרנית, הדמיה פלורסנט מתבצע באופן שגרתי על מעבדות ביולוגיה רבות. על-ידי תיוג מולקולות של עניין עם fluorophores, אנו יכולים ישירות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ, לתעד את השינויים תלויי-זמן לוקליזציה, קונפורמציה, אינטראקציה, ואת מכלול המדינה vivo בתוך או במבחנה. קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופים יש רזולוציה מרחבית עקיפה-מוגבלת, אשר ~ 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב ו ~ 500-700 nm, הכיוון צירית1,2, והם, לכן, מוגבל לדימות-שים את הכסף בתיק של סולם ננומטר-כדי-מיקרו. על מנת לחשוף פרטים עדינה הרכבה מולקולרי או הארגון, פותחו microsc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיקרוסקופ ועיצוב ההרכבה

  1. עירור נתיב
    הערה: הנתיב עירור כולל לייזרים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), הגוף מיקרוסקופ, ורכיבים זרוע תאורה שלה.
    1. הכן טבלה בודדים רטט אופטי. לדוגמה, טבלה השיכוך מבנית של 48 x 96 x 12'' נותן די שטח פנוי עבור כל הרכיבים.
      הערה: לבנות את הסידור בחדר עם בקרת טמפרטורה (למשל, נמצא 21.4 ± 0.55 ° C). יציבות טמפרטורה חיוני לשמירה על היישור אופטי.
    2. התקן גוף מיקרוסקופ הינו מצויד עם זרוע תאורה עבור חיבור סיב אופטי, של 100 X שמן-טבילה TIRF המטרה עדשות ורכיבים DIC.
    3. מקום 4 ראשים לייזר (647 nm, 561 nm, 488 ננומטר, 405 ננומטר, כיתרו ב איור 1B) שלהם חום כי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ זה מאפשר גמישות לשחזור מעבר בין שיטות הדמיה שונות. הנה אנחנו מראים תמונות לדוגמה הנאספים יחד עם כל מודול ההדמיה.

איור 5D מדגים את PSF של המולקולה מהבהב על במהלך רכישת SR. אלפי תמונות כאלה משוחזרים כדי ליצור את התמונה הסופית SR (איור 5E). איור 5E מראה את אותו RNAs רגולטוריות חיידקי כפי שמוצג בתמונה epi-זריחה אי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת מיקרוסקופ היברידית זו מבטלת את הצורך לרכוש מיקרוסקופים מרובים. הסכום הכולל עבור כל החלקים, כולל שולחן אופטי, שולחן העבודה ההתקנה, התוכנה, תחנת עבודה, הוא בערך דולר ועל 230,000 שמו. חלקים במכונה מותאם אישית, כולל עדשה mag, עדשת תלת-ממדי, עולה בסביבות 700 דולר (המחיר תלוי האישום בפועל במוסדות שונים). טיפוסי זמין מסחרית מערכות משולבות עבור יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ עולה למעלה מ 300,000 דולר ~ 400,000 והם לא בקלות ניתן למדידה smFRET או אפינפרין-הדמיה עבור שדה מבט סבירה, ללא אור לבן מקור. לפיכך, הגישה ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'יי מאשר תמיכה של התוכנית מלומדים סרל ופרס הבמאי NIH חדש חדשן. המחברים לאשר הצעות שימושיות מהמעבדה של פול Selvin (באוניברסיטה של אילינוי באורבנה-שמפיין) לצורך מיקום העדשה תלת-ממדי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מעמד מיקרוסקופ Nikon Ti-ENikonTi-E
Objective עדשתNikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
תוכנת הדמיה מיקרוסקופיתNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC כוללת מודול "JOBS", מודול הרכישה המתוכנת המשמש להדמיית SR.
זרוע התאורהNikonTi-TIRF-EM יחידת תאורה ממונעת Mלזרוע זו יש חריץ לעדשת הגדלה
ניתוח בלוקNikonTi-Aזה מותקן בצריח המסנן.
מערכת תיקון סחיפהZ NikonPFSמערכת זו מורכבת על ידי מנוע הצעד על האף האובייקטיבי, נורית IR וגלאי.
שולחן אופטיTMC783-655-02R
בסיסי שולחן אופטיTMC14-426-35
647 ננומטר לייזרCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)דיודת לייזר מאופנת 647nm 120mW כולל ראש לייזר, תיבת בקרת CDRH, כבל USB ו-PSU (יחידת אספקת חשמל)
לייזר 561 ננומטרקוהרנטי1280721OBIS 561nm LS 150mW מערכת לייזר
488 ננומטר לייזרCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)דיודת לייזר מאופנת 488nm 60mW כולל ראש לייזר, תיבת בקרת CDRH, כבל USB ו-PSU (יחידת אספקת חשמל)
405 ננומטר לייזרCrystalaserDL405-025-O405 (+/-5)nm, 25mW, מעגלי, M2 < 1.3, רעש נמוך, CW, TTL עד 20 מגה-הרץ. 2 מחברי BNC עבור TTL & כוונון אנלוגי
גוף קירורCobolt11658 (HS-03)שתי יחידות, גוף קירור ללא מאוורר HS-03, גוף קירור ללייזרים 647 ננומטר ו-488 ננומטר
גוף קירורקוהרנטי1193289Obis עם מאוורר, 165 x 50 x 50 מ"מ עבור לייזר 561 ננומטר
CAB-USB-miniUSBCobolt10908שתי יחידות, כבל תקשורת ללייזרים 647 ננומטר ו-488 ננומטר
אלומיניום לכוונון גובהמקמאסטר-קאר9146T35רב תכליתי 6061 אלומיניום, בר מלבני, 4 מ"מ X 40 מ"מ, 1 'ארוך להעלאת אלומיניום לייזר 561 ננומטר
לכוונון גובהMcMaster-Carr8975K248רב תכליתי 6061 אלומיניום, 1-1/4 אינץ' עובי X 3 אינץ' רוחב X 1 אינץ' אורך להעלאת כבל BNC לייזר 405 ננומטר
L-comCC58C-6RG58C כבל קואקסיאלי, BNC זכר / זכר, מתאם BNC 6.0 רגל
L-comBA1087מתאם קואקסיאלי, מחיצת BNC,
מתאם SMA ל-BNCHODSMA-870ללייזרים של Cobolt MLD יש ממשק SMA, כך שמתאם זה משמש לחיבור BNC.
SMB ל BNC מתאםFairview מיקרוגלFMC1638316-12SMB תקע ל BNC נקבה Bulkhead כבל RG316 קואקס ב 12 אינץ 'עבור קוהרנטי לייזרים אוביס
כרטיס רכישת נתוניםNational InstrumentsPCI-672313 סיביות, 32 ערוצים, 800 kS/s מכשיר פלט אנלוגי לשליטה בלייזרים, DIC LED וכו '
מחסום מסנן גלגל בקר SutterInstrumentLambda 10-Bמחליף
מסנן אופטימפצל פליטהCairnOptoSplit III
מפצל אלומה דיכרואיChromaT640LPXR-UF2מפצל אלומה דיכרואי המפריד בין פליטה אדומה לפליטה ירוקה ב-OptoSplit III
מפצל אלומה דיכרואיChromaT565LPXR-UF2מפצל אלומה דיכרואי המפריד בין פליטה ירוקה ואדומה לפליטה כחולה במסנן פליטה OptoSplit III
ChromaET700/75Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה אדומה (כמו Alexa Fluor 647) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מחסום
מסנן פליטהChromaET595/50Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה צהובה/ירוקה (כמו Cy3B) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מסנן מחסום
ChromaET525/50Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה כחולה (כמו Alexa Fluor 488/GFP) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מסנן
הפליטהSemrockFF02-447/60-25מסנן פליטה לפליטה סגולה (כמו DAPI/Alexa Fluor 405), המותקן בגלגל מסנן המחסום
מפצל אלומה דיכרואיChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3מפצל קרן דיכרואי רב-פס לעירורי לייזר 647, 561, 488 ו-405 ננומטר בתוך גוף המיקרוסקופ
סט מסנני DAPIChroma49000מותקן בגוף המיקרוסקופ
לייזר ניקון/מסנן TIRFChroma91032
590 מסנן מעבר ארוךChromaT590LPXR-UF1לשילוב לייזר 647 ננומטר ולייזר 561 ננומטר
525 מסנן מעבר ארוךChromaT525LPXR-UF1לשילוב לייזרים משולבים של 647 ננומטר ו-561 ננומטר עם לייזר 488 ננומטר
מסנן מעביר ארוך 470ChromaT470LPXR-UF1לשילוב לייזרים משולבים כבר של 647 ננומטר, 561 ננומטר ו-488 ננומטר עם לייזר 405 ננומטר
מסנן ניקוי לייזר (647)Chromazet640/20xלניקוי אורכי גל אחרים ממסנן ניקוי לייזר 647 ננומטר
(488)SemrockLL01-488-25לניקוי אורכי גל אחרים ממקור אור LED לייזר 488 ננומטר
ExcelitasX-Cite120LEDהמשמש רק להדמיית DAPI
תושבת מראהניופורטSU100-F3K
עמודים אופטייםניופורטPS-2
מד כוחניופורטPMKITלמדידת עוצמת לייזר
תושבת קומבינר קרן דיכרואיתEdmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount, להחזקת קומבינרים דיכרואיים במכלול עירור הלייזר
טבעת שמירהThorlabsCMRRהמשמשת לתושבות beamcombiner דיכרואיות לוחית
מתאם סיביםThorlabsSM1FCFC/PC לוחית מתאם סיבים עם SM1 חיצוני (1.035 אינץ'-40)
חוט ציר Z תושבת תרגוםThorlabsSM1Zאכרומטית תואמת כלוב 30 מ"מ
ThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 מ"מ, כפולים אכרומטיים רכובים, מצופה AR: 400 - 700 ננומטר
צלחת כלובThorlabsCP1TM0930 מ"מ צלחת כלוב עם חוטים פנימיים M9 x 0.5, מוט הרכבה של כלוב ברז 8-32 מוט
הרכבה כלובThorlabsER4, אורך 4 אינץ', Ø
תושבת הרכבה לכלובThorlabsCP02B30 מ"מ תושבת הרכבה לכלוב
סיבים אופטיים במצב יחידThorlabsP5-405BPM-FC-2כבל תיקון, PM, FC/PC ל-FC/APC, 405 ננומטר, פנדה, 2 מ'
סיבים אופטיים רב-מצבייםThorlabsM42L01Ø 50 ומיקרו; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC כבל תיקון סיבים, 1 מ'
עדשת כפולה אכרומטית (עדשת מג)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 מ"מ, Ø 1/2 אינץ' Achromatic Doublet, ARC: 400-700 ננומטר, עדשה קעורה ב"עדשת מאג"
עדשת Achromatic Doublet (עדשת מג)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 מ"מ, Ø כפול אכרומטי 1/2 אינץ', ARC: 400-700 ננומטר, עדשה קמורה ב"עדשת מג
טבעת שמירהThorlabsSM05PRRSM05 טבעת שמירה מפלסטיק עבור Ø צינורות ותושבות עדשה 1/2 אינץ', עבור "עדשת מג
בורג עם קצה ניילוןThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 בורג עם קצה ניילון, אורך 6 מ"מ, להחזקת "עדשת תלת מימד"
עדשת תלת מימדCVI אופטיקה לייזרRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 מ', עדשה גלילית מלבנית
מצלמת EMCCD AndoriXon Ultra 888
100 ננומטר חרוזים רב ערוצייםתרמוT7279, TetraSpeck microspheres
צבע אדוםThermoAlexa Fluor 647
צבע צהוב-ירוקGE HealthcareCy3
צבע ירוקGE HealthcareCy3B
צבע כחולThermoAlexa Fluor 488
עדשת מוארק מזלג הידוק ניופורט PS-F תושבת תרגום ציר Z של , עדשת כפולה 6 מ"מ ""

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles