Method Article

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מולקולות ביולוגיות בחיי עיר ולנטר את הדינמיקה ואת אינטראקציות בזמן אמת. בנוסף מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-זריחה, פותחו טכניקות הדמיה שונות כדי להשיג את מטרותיה ניסיוני. כמה הטכניקות בשימוש נרחב כוללים קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת תהודה העברת אנרגיה (smFRET), אשר יכול לדווח על שינויים הסתגלותי ואינטראקציות מולקולרית עם רזולוציה אנגסטרום, המבוססת על זיהוי מולקולה בודדת סופר רזולוציה (SR) הדמיה, אשר יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית כ עשר כדי twentyfold בהשוואה מיקרוסקופ עקיפה-מוגבלת. כאן אנו מציגים מעוצבת ללקוח משולב מערכת, אשר ממזג שיטות הדמיה מרובות במיקרוסקופ אחד, כולל הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה של צבע רב גילוי מולקולה בודדת, כולל הדמיה smFRET. שיטות הדמיה שונות ניתן להשיג בקלות, reproducibly על ידי החלפת רכיבים אופטיים. זה קל לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות עלות מופחתת וחלל ביחס בניין נפרד מיקרוסקופים לצורכי הפרט.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים כלים חשובים למחקר במדעי הביולוגיה המודרנית, הדמיה פלורסנט מתבצע באופן שגרתי על מעבדות ביולוגיה רבות. על-ידי תיוג מולקולות של עניין עם fluorophores, אנו יכולים ישירות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ, לתעד את השינויים תלויי-זמן לוקליזציה, קונפורמציה, אינטראקציה, ואת מכלול המדינה vivo בתוך או במבחנה. קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופים יש רזולוציה מרחבית עקיפה-מוגבלת, אשר ~ 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב ו ~ 500-700 nm, הכיוון צירית1,2, והם, לכן, מוגבל לדימות-שים את הכסף בתיק של סולם ננומטר-כדי-מיקרו. על מנת לחשוף פרטים עדינה הרכבה מולקולרי או הארגון, פותחו microscopies SR שונים שיכולים לשבור את מגבלת עקיפה. אסטרטגיות כדי להשיג SR כוללים אפקטים אופטיים ליניארי, כגון פליטה מאולצת דלדול (STED) מיקרוסקופיה3,4 , תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM)5,6, 7, זיהוי סטוכסטי של מולקולות יחיד, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)8 ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל)9, שילוב של שניהם, כגון MINFLUX10. בין אלה microscopies SR, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופים ניתן לשנות בקלות יחסית של מלכודת מיקרוסקופ מולקולה בודדת. עם הפעלת החוזרות על עצמן, הדמיה של חלבונים פלורסנט photoactivatable (FPs) או צבעי תמונה-להחלפה מתויגים על מולקולות של עניין, רזולוציה מרחבית יכולים להגיע nm 10-2011. כדי לקבל מידע על אינטראקציות מולקולרית הסתגלותי נדרש דינאמיקה של רזולוציה בזמן אמת, אנגסטרום-כדי-ננומטר. 12,smFRET13 היא גישה אחת כדי להשיג החלטה זו. באופן כללי, בהתאם השאלות הביולוגי של עניין, נדרשים בשיטות הדמיה עם רזולוציות שונות מרחבית.

בדרך כלל, עבור כל סוג של הדמיה, נדרשת תצורה אופטי מסוים עירור ו/או פליטה. למשל, באחת השיטות הנפוצות ביותר תאורה לגילוי מולקולה בודדת היא באמצעות החזרה גמורה (טיר), שבו זווית עירור ספציפי צריך להיות מושגת דרך פריזמה או דרך העדשה אובייקטיבי. עבור זיהוי smFRET, פליטת התורם והן מקבל צבע צריך להיות מופרדים במרחב ו בוים על חלקים שונים האלקטרון-הכפלת, תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD), אשר יכולה להיות מושגת עם סדרה של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ממוקם בנתיב פליטה. עבור תלת-ממדיים (3-D) SR הדמיה, רכיב אופטי, כגון עדשה גלילית14, יש צורך לגרום אפקט אסטיגמציה בנתיב פליטה. לכן, homebuilt או זמינים מסחרית מיקרוסקופים משולב, בדרך כלל, באופן פונקציונלי התמחה עבור כל סוג של הדמיה שיטה, אינם גמישים כדי לעבור בין שיטות הדמיה שונות על הסידור זהה. כאן אנו מציגים מערכת היברידית חסכונית, המספקת מתגים מתכווננת, לשחזור בין שלוש שיטות הדמיה שונות: הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי עם רזולוציה מוגבלת עקיפה, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה, זיהוי חד-מולקולה צבע רב, כולל smFRET הדמיה (איור 1 א'). באופן ספציפי, הסידור המובאת כאן מכיל סיבים מצמידים לייזרים קלט של צבע רב עירור, זרוע תאורה מסחרי בנתיב עירור, אשר מאפשר מתוכנת השליטה הזווית עירור, כדי לעבור בין epi-מצב ומצב טיר. בנתיב פליטה, קלטת עדשה גלילית homebuilt נשלף ממוקם בתוך הגוף מיקרוסקופ לדימות SR תלת-ממדי ולאחר במפצל קרן מסחרי ממוקמת לפני מצלמה EMCCD שיכול להפוך לזמין באופן סלקטיבי כדי לזהות ערוצים מרובים פליטה בעת ובעונה אחת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיקרוסקופ ועיצוב ההרכבה

  1. עירור נתיב
    הערה: הנתיב עירור כולל לייזרים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), הגוף מיקרוסקופ, ורכיבים זרוע תאורה שלה.
    1. הכן טבלה בודדים רטט אופטי. לדוגמה, טבלה השיכוך מבנית של 48 x 96 x 12'' נותן די שטח פנוי עבור כל הרכיבים.
      הערה: לבנות את הסידור בחדר עם בקרת טמפרטורה (למשל, נמצא 21.4 ± 0.55 ° C). יציבות טמפרטורה חיוני לשמירה על היישור אופטי.
    2. התקן גוף מיקרוסקופ הינו מצויד עם זרוע תאורה עבור חיבור סיב אופטי, של 100 X שמן-טבילה TIRF המטרה עדשות ורכיבים DIC.
    3. מקום 4 ראשים לייזר (647 nm, 561 nm, 488 ננומטר, 405 ננומטר, כיתרו ב איור 1B) שלהם חום כיורים על השולחן האופטי, ודא קרני לייזר הנפלט שיש באותו גובה ובאותו הם קצר ככל האפשר להבטיח יציבות טובה (למשל 3'').
      הערה: אם ראש לייזר יושב בגובה קצר יותר מאשר אחרים לייזרים, לשים צלחת אלומיניום בעובי נאותה מתחתיו. תמיד להבטיח מקסימום קשר בין מפזרי חום את טבלת אופטי עבור פליטת חום הטוב ביותר (איור 1B). הלייזרים צריך להיות חזק מספיק עבור SR הדמיה. עיין בטבלה של חומרים. מומלץ לעשות לייזר מסננים לנקות לפני דיודות לייזר.
    4. להתקין כרטיס רכישה נתונים דרך ממשק רכיבים היקפיים (PCI) interconnect תחנת עבודה וחבר לייזרים עם הכרטיס הזה. שליטה ON/OFF התנהגויות של הלייזרים לפי ההיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) פלט, והתאמה שלהם כוח, פלט אנלוגי של הקלף (איור 1C). התקן של מיקרוסקופיית נאות imaging התוכנה (מסחרי או homebuilt) כדי לשלוט כרטיס רכישה הנתונים, כמו גם הגוף מיקרוסקופ.
    5. לטעון את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (590, 525 ו- 470 זמן לעבור מסננים) על סוסיהם בהתאמה. השתמש בטעינות יציב מאוד מראה על המראות. השתמש מפצלי מעגלית עם שמירה על טבעות כדי להימנע כל כיפוף מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D).
    6. מקם את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר על השולחן האופטי כדי לשלב את קרני לייזר (איור 1B). כדי להשיג את היישור היציב ביותר, להפוך את כל הסידור כמה קומפקטי ככל האפשר, השתמש בעמודי אופטי 1''-עובי. לסדר את הלייזרים כך לייזרים אורך גל קצר יותר קרובים יותר צימוד סיבים אופטיים (איור 1B) מאז קצר באורך הגל אורות להתפזר יותר באוויר.
    7. לשלב קרני לייזר סיב אופטי במצב יחיד. לשם כך, לבנות מצמד סיבים בתוך מערכת כלוב באמצעות השלבים הבאים:
      1. הר צלחת מתאם סיבים ב הר תרגום ציר z (איור 1E, החלונית הימנית).
      2. הר של עדשה כפיל אכרומטי (אורך מוקד = 7.5 מ מ) לתוך צלחת הכלוב (איור 1E, הפאנל השני מצד השמאל).
      3. לחבר את שני החלקים מעל באמצעות מוטות הארכה כדי ליצור כלוב. לטעון את הכלוב על השולחן אופטי עם הרכבה מרובעים על 1''-עבה ההצבות אופטי (איור 1E, בחלונית האמצעית).
      4. יישר את הלייזר 647-nm קודם עם סיב אופטי במצב יחיד (FC/APC סוף מחבר).
        הערה: יישור קשה באמצעות סיבים אופטיים רב במצב לפני באמצעות סיבים אופטיים במצב יחיד עשוי לסייע בתהליך יישור. להתאים את הזוויות של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D, על ידי התאמת ידיות), כמו גם המרחק בין העדשה כפיל אכרומטי לצלחת מתאם סיבים (איור 1E, על-ידי התאמת הר תרגום ציר z) כדי לזכות לייזר המרבי פלט חשמל באמצעות הסיבים.
      5. ברגע היישור של הלייזר הראשון נעשה, באופן זמני להתקין זוג קשתיות העין, ליישר את שאר לייזרים אחד (איור 1F). בדקו את יעילות יישור עם מד הכוח.
      6. השאר איריס אחד בחזית הלוח מתאם לצמצם ההשתקפויות של הלייזרים.
        הערה: חזק בחזרה השתקפויות. המצמצמים את אורך החיים של מקורות לייזר. לחלופין, ניתן להתקין isolator אופטי לפני כל ראש לייזר כדי להסיר לחלוטין את ההשתקפויות.
    8. חבר את הקצה השני של סיבים אופטיים הזרוע תאורה של המיקרוסקופ (איור 1 H).
    9. עיצוב ולהתקין "הגדלה העדשה (mag עדשה)" את השלבים הבאים:
      הערה: הלייזרים ניתן להשתמש עבור הדמיה epi-זריחה של המדגם, אך הגודל קרן צרה של כל לייזר מגביל את השטח של המדגם לאזור מספר פעמים קטן יותר מאשר הגודל הממשי של חיישן המצלמה המתאימה, במיוחד עבור החדשים מצלמות (עם 18.8 מ מ אורך אלכסון לעומת אורך 11.6 מ מ המקובלת). לפיכך, רצוי להרחיב את הקרן להשיג תאורה גדול ושטוח של המדגם.
      1. עיצוב העדשה mag, אשר יכול להתאים לתוך הזרוע תאורה (איור 1 H).
        הערה: העיצוב של העדשה mag תלוי איפה זה יותקן. איור 1 H מראה דוגמה של ההתקנה בזרוע תאורה, אבל זה יכול להיות מותקן בכל מקום. אחרי הקורות לייזר הן מקבילות (ראה דיון). עיצוב זה עם תכנון בעזרת מחשב, תוכנות שרטוט.
      2. במקום שתי עדשות אכרומטית, אחת קעורה (אורך מוקד = f1), ואחת קמורה (אורך מוקד = f2) ב- mag תוצרת בית עדשה המחזיק (איור 2 א ו- 2 C), עם מרחק שווה לסכום של אורכי מוקד שלהם, f1 + f2 = (--25) + 50 = 25 מ מ (איור 2B).
        הערה: כאשר בחירה זו של אורכי מוקד העדשה מאג מתרחבת הקרן ב- f2/ | f1| = קפלי 2. העדשה mag מספק רב-תכליתיות. שניתן יהיה להסיר כדי לחדש את תאורה רגיל מבלי להרחיב את הקורות (איור דו-ממדי) או הוספת בכיוון ההפוך למקד את קרן הלייזר כדי להשיג של העוצמה עירור חזק יותר.

2. פליטת נתיב

הערה: הנתיב פליטה מורכב של עדשה גלילית נשלף, גלגל מסנן מכשול, ספליטר פליטה של מצלמה EMCCD (איור 1 ג'י). כדי להשיג את הנקודה הטובה ביותר להפיץ את הפונקציה (PSF) של מולקולות יחיד, המנסרה DIC שם מן העדשה אובייקטיבי.

  1. מותאמת אישית-עיצוב בקלטת עדשה גלילית (עדשה תלת-ממדי), אשר יכול להשתלב במנתח DIC ידנית להוסיף חריץ בגוף מיקרוסקופ (איור 3C).
    הערה: עיצוב זה לא מתפשרים במנתח DIC מאז בלוק מנתח יכול להיות מוכנס על הצריח מסנן.
  2. הכנס את עדשת תלת-ממדי של 10 מ' אורך מוקד בקלטת והוספתו לתוך הנתיב קרן פליטה כדי ליצור את אפקט אסטיגמציה הדרושה עבור חילוץ הקואורדינטה z של כל מולקולה בודדת14.
    הערה: לחלופין, בקלטת עדשת תלת-ממדי ניתן להניח בתוך או מחוץ הנתיב פליטה (איור 3C).
  3. להתקין מפצל קרן ודיקרואיק זוהר הלהקה רב על הצריח מסנן שבתוך הגוף מיקרוסקופ.
  4. להתקין מסננים פליטה.
    הערה: המסננים פליטה נבחרים בהתאם fluorophores מועדף. בהתאם מודול ההדמיה, מסנני פליטה ממוקמים במקומות שונים משמשים כמפורט להלן:
    1. צבע רב רציפים epi-קרינה פלואורסצנטית לדימות או SR הדמיה, להשתמש במסנני פליטה להציב בגלגל מסנן מכשול מחובר ליד הגופה מיקרוסקופ כדי למזער את הרטט בגוף מיקרוסקופ במהלך ערוץ הבורר (איור 1 ג'י).
    2. לצורך זיהוי צבע רב בו זמנית (למשל, smFRET ניסויים), במקום אחר מסנן הממוקם על הפיצול פליטה (הסימון שלב 4 לפרטים).
      הערה: בדרך כלל, למפצל פליטה מסחרי יש שני מצבי להחלפה (קרי, "מאורסים" או "לעקוף" מצבי). כדי להפריד פליטת האור chromatically עבור צבע רב סימולטני הדמיה (מצב "מאורסים"), משמש קוביה מסנן מחזיק שני מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ומסננים פליטה שלוש ("טריפל קוביה," דמות 4C ו- 4 D). חריץ ריק בגלגל מסנן מכשול משמש בשילוב עם הקוביה משולשת. מצד שני, להדמיית צבע רב רציפים, הקוביה טריפל מוחלף על ידי קוביה לו מראה בתוך ("עוקף קוביה," דמות 4A ו- 4 D).
  5. להתקין את המצלמה EMCCD כמו החלק האחרון של השביל פליטה. לנצל את החיבור USB-PCI להשגת קצב מהיר.
    הערה: מצלמה EMCCD מומלצת גילוי מולקולה בודדת הרגישים ביותר, אך מצלמת sCMOS מתקדם יכול להיות חלופה.

3. עקיפה מוגבל הדמיה עם אפי-עירור

  1. להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור למצב epi-בזרוע תאורה.
  2. נתק את העדשה תלת-ממדי אם מאורסת (איור 3C, לוח נכון).
  3. להוסיף לקוביה מעקף המפצל פליטה (איור 4A ו- 4E, החלונית התחתונה).
  4. (אופציונלי) הכנס את העדשה mag לאזור והורחבו תאורה (איור דו-ממדי, פאנל שמאלי).
    הערה: עם השימוש עדשה מג 100 X עדשה המטרה שמן-טבילה, בערך 91 x 91 מיקרומטר2 יכול להיות מואר בצורה שווה, ומבטל את הצורך להשתמש מקור אור לבן והקוביות סינון מרובים.
  5. השתמש של מיקרוסקופיית imaging התוכנה לקחת רב ערוצית, ו/או Z-מחסנית, ו/או תמונות בצילום מואץ.
    הערה: יש תוכניות מרובות זמינים עבור הדמיה במיקרוסקופ, לא רק מיצרנים מיקרוסקופ, אלא גם מחברות צד שלישי או מפתחי קוד פתוח.

4. רב ערוצית מולקולה בודדת הדמיה כולל smFRET

הערה: להזיז למשרת "ריק" במערכת סינון מחסום, כך כל הפליטה לכל אורך הגל יכול להגיע עד הסט השני של ודיקרואיק זוהר/מסננים מפצלי הקרן ב המפצל פליטה.

  1. כדי להגדיר את צבע רב גילוי מולקולה בודדת של מולקולות השטח. מרותק למיטה15 באמצעות עירור TIRF, כולל מדידה smFRET, להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור לזווית TIRF. נתק את העדשה mag, עדשת תלת-ממדי.
  2. לעסוק את מצב שלושה ערוצים המפצל פליטה (איור 1 ג'י) את השלבים הבאים:
    1. להחליף לקוביה מעקף עם קוביה"כיול" זה מאפשר לאור לעבור דרך כל הערוצים (איור 4B ו- 4E).
    2. תדליק את המצלמה תחת DIC (כלומר, לא מסנן פליטה בגלגל מסנן מכשול) ולהתאים את הצמצם של המפצל פליטה עד שלושה ערוצים נפרדים לחלוטין יופיעו על המסך.
      הערה: לבצע שלב זה עם האור בחדר מואר, שתדמיין לעצמך את כל הערוצים.
    3. הפעל את ידיות שליטה אנכיים/אופקיים התאמת המפצל פליטה ויישר בערך שלושת הערוצים (איור 4E ו- 4F).
    4. כבה את המצלמה והחלף את הקוביה כיול קוביה טריפל (איור 4C ו- 4E).
    5. במקום מדגם עם חרוזים רב-ערוצי 100 ננומטר על גבי ה-100 X עדשה המטרה ונוחות על המדגם.
    6. הפעל את המצלמה ואת הלייזר 488 ננומטר, תקריב על אחד של חרוזים בהיר, דק ליישר את שלושת הערוצים על-ידי הפעלת את התאמת ידיות שליטה שוב (איור 4E ו- 4g).
      הערה: 100-nm חרוזים רב-ערוצי פולטים אורכי גל שונים של אור על עירור 488 ננומטר, המאפשר את היישור שלושה ערוצים.
  3. להפעיל את המצלמה, לייזרים, מיקוד, למצוא משרה טובה עם צפיפות מקום סביר. להתאים את כוח לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג רמות מקובל אות לרעש ו- photobleaching. השתמש מיקרוסקופיה של תוכנות ליצירת תמונות תמונות בצילום מואץ.

5. SR הדמיה

הערה: זהו יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ.

  1. כדי להגדיר את SR הדמיה, עדשת תלת-ממדי האצוהו הסנכה העדשה מג. להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה הערוצים לייזר מתאים (למשל, ms 5-60). לקבוע ולהגדיר באופן ידני את זווית מקריים של לייזרים עירור אופטימלית להיות הזווית TIRF.
  2. מקם את הדגימה SR הדמיה מאגר16. לאפשר מאגר המשמש equilibrate לפחות 10 דקות לפני הדמיה.
    הערה: מאגר הדמיה SR יפוג לאחר בערך 1 h, כך שעליך SR חדש הדמיה מאגר בהתאם.
  3. קח תמונה של DIC לפני SR הדמיה. כדי למצוא את הגובה אובייקטיבית המתאים עבור SR, אשר מייעל את האפקט אסטיגמציה, להשתמש DIC הדמיה כדי למצוא את המטוס האמצעי של התאים. לזהות את המטוס על-ידי הגובה שבו תאי המעבר מ- "אור" תמונות "כהה" ומופיעים להפוך שקוף (איור 5A, 5B, ו- 5 C). ברגע שהמטוס מוקד הרצוי נקבע, לעסוק z-להיסחף תיקון המערכת (איור 1 א').
  4. התנהגות SR הדמיה. לשנות את הכוח 405 ננומטר לייזר כדי לשמור על צפיפות סבירה של כתמים 'מהבהב-על'.
    הערה: אמנם זה ניתן לשנות באופן ידני את הלייזר 405 ננומטר, זה יותר נוח להפעיל קוד רכישת נתונים מתוכנת כדי לשמור על הצפיפות של כתמים "מהבהב-על". הנה דוגמה של איך זה מתבצע באופן אוטומטי. קוד המקור זמין על פי בקשה (איור 6).
    1. להתחיל הרכישה הדמיה עם עוצמת הלייזר סגול2 W/ס מ 0.
    2. לספור את מספר המקומות מהבהב על תוך תקופה מסוימת.
    3. לווסת את עוצמת הלייזר סגול כך מספר מהבהב על כתמים נשמרת לעיל על-ידי המשתמש "הספירה סף" בתוך שדה הראייה. להגדיל את עוצמת הלייזר סגול כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה.
    4. לסיים את הרכישה כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה באמצעות כוח מרבי לייזר סגול.
      הערה: המקסימום ניתן להגדיר באופן שונה בהתאם הבהירות דגימה, אך גבוה מ- W/cm 1302. בהתאם המטרה בפועל של ההדמיה SR, קוד זה רכישה אוטומטית יופרו באופן ידני בכל עת הרצוי.
  5. בדוק את התנהגות מהבהב ואת PSFs נקודות זמן קצר לאחר תחילת הרכישה.
    הערה: אם ההתנהגות מהבהב אינה אידיאלית, לשנות את זווית מקריים של לייזרים עירור או להחליף את המאגר הדמיה. מצפה דגימה של "אנכי", "אופקי" ו "diamond" צורות של PSF, המייצג fluorophores מלמטה, מעל, ובתוך המטוס מוקד, בהתאמה (איור 5D). אם כתמים מרבית מציגות PSFs לאנכי או אופקי, ואז המטוס מוקד מבוטל מהמרכז של התאים, לסיים את הניסוי, להתאים את המישור מוקד שוב. נוכחות של בועת האוויר מהשמן טבילה או גורמים מקומיים אחרים יכולים להשפיע על האיכות של PSFs, ולכן יהיה צורך להחליף את השמן או שינוי אזור הדמיה שונות המדגם.
  6. לניתוח נתונים, להשתמש בקוד פתוח (ב NIH ImageJ תוספים) או קודים זמינים מסחרית לשם זיהוי centroids של כל מקום בכל מסגרת הדמיה לחלץ ערכים-z של כל נקודה מ- x ו- y-ברוחב14.
    הערה: בדו ח זה, קוד מקור שפותחה במקור באחת המוקדם יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR8 שונה עבור זיהוי תלת-ממדי16 , היה בשימוש.
  7. במקרה של שני צבעים הדמיה, תמונה של fluorophore עם הגל ארוך יותר עירור, ואחריו עם אורך גל קצר יותר עירור. להפעיל את הקוד רכישה אוטומטית באופן דומה לזו המתוארת בשלב 5.4, אבל עם לייזר הדמיה שונות.
    הערה: אברציה כרומטית אמור להיפתר בין תמונות שונות fluorophores (למשל, צבע אדום, צבע צהוב, ירוק). להלן השלבים.
    1. לשתק מספר החרוזים רב-ערוצי 100-nm coverslip זכוכית, הימנעות להרכיב אשכולות.
    2. קח תמונות של אותם בערוצים עירור שונות.
    3. תמצית שלהם (X, Y, Z) נקודות ציון על ידי תוכנה (שלב 5.6).
    4. מגרש ΔXאני = X1i - X2i וΔYi = Y1i - Y2i (על כך חרוזים שונים, ו 1 ו-2 הם ערוצי צבע שונה) בנפרד ולהתאים אותם עם פונקציות נאותה. שמור את הפונקציות.
      הערה: פונקציה קווית מספיקים ברוב המקרים. ברגע פונקציות אלה נקבעים, מדידה זו אין צורך לחזור בכל פעם הדמיה.
    5. בבפועל שני צבעים SR ההדמיה של מדגם של עניין, להחיל בפונקציות על הנכון (X, Y) אברציה כרומטית. עבור z-directional אברציה כרומטית, לנהל אותה על ידי קבלת ΔZ = Z1 - Z2 חרוזים רב-ערוצי או דגימות רב-ערוצי הייחוס המוכרת נזרע יחד עם הדוגמה של עניין.
      הערה: בניגוד (X, Y) אברציה כרומטית, אברציה כרומטית z-directional אינו טוב-לשחזור ניסוי, בעיקר בשל תחזוקה המוקד z-directional לא שלם על ערוץ מיתוג. לכן, מומלץ לבצע את התיקון בכל פעם. ΔZ = Z1 - Z2 הוא בעיקר תלוי (X, Y), אז רק כמה חרוזים או דוגמיות יהיה מספיק לכל כל אזור הדגימה של עניין. מגרש בנוי הסופי שני צבעים SR תמונות תוכנה להדמיה תלת-ממדי וסמנו ΔZ באופן ידני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ זה מאפשר גמישות לשחזור מעבר בין שיטות הדמיה שונות. הנה אנחנו מראים תמונות לדוגמה הנאספים יחד עם כל מודול ההדמיה.

איור 5D מדגים את PSF של המולקולה מהבהב על במהלך רכישת SR. אלפי תמונות כאלה משוחזרים כדי ליצור את התמונה הסופית SR (איור 5E). איור 5E מראה את אותו RNAs רגולטוריות חיידקי כפי שמוצג בתמונה epi-זריחה אי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת מיקרוסקופ היברידית זו מבטלת את הצורך לרכוש מיקרוסקופים מרובים. הסכום הכולל עבור כל החלקים, כולל שולחן אופטי, שולחן העבודה ההתקנה, התוכנה, תחנת עבודה, הוא בערך דולר ועל 230,000 שמו. חלקים במכונה מותאם אישית, כולל עדשה mag, עדשת תלת-ממדי, עולה בסביבות 700 דולר (המחיר תלוי האישום בפועל במוסדות שונים). טיפוסי זמין מסחרית מערכות משולבות עבור יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ עולה למעלה מ 300,000 דולר ~ 400,000 והם לא בקלות ניתן למדידה smFRET או אפינפרין-הדמיה עבור שדה מבט סבירה, ללא אור לבן מקור. לפיכך, הגישה ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'יי מאשר תמיכה של התוכנית מלומדים סרל ופרס הבמאי NIH חדש חדשן. המחברים לאשר הצעות שימושיות מהמעבדה של פול Selvin (באוניברסיטה של אילינוי באורבנה-שמפיין) לצורך מיקום העדשה תלת-ממדי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מעמד מיקרוסקופ Nikon Ti-ENikonTi-E
Objective עדשתNikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
תוכנת הדמיה מיקרוסקופיתNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC כוללת מודול "JOBS", מודול הרכישה המתוכנת המשמש להדמיית SR.
זרוע התאורהNikonTi-TIRF-EM יחידת תאורה ממונעת Mלזרוע זו יש חריץ לעדשת הגדלה
ניתוח בלוקNikonTi-Aזה מותקן בצריח המסנן.
מערכת תיקון סחיפהZ NikonPFSמערכת זו מורכבת על ידי מנוע הצעד על האף האובייקטיבי, נורית IR וגלאי.
שולחן אופטיTMC783-655-02R
בסיסי שולחן אופטיTMC14-426-35
647 ננומטר לייזרCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)דיודת לייזר מאופנת 647nm 120mW כולל ראש לייזר, תיבת בקרת CDRH, כבל USB ו-PSU (יחידת אספקת חשמל)
לייזר 561 ננומטרקוהרנטי1280721OBIS 561nm LS 150mW מערכת לייזר
488 ננומטר לייזרCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)דיודת לייזר מאופנת 488nm 60mW כולל ראש לייזר, תיבת בקרת CDRH, כבל USB ו-PSU (יחידת אספקת חשמל)
405 ננומטר לייזרCrystalaserDL405-025-O405 (+/-5)nm, 25mW, מעגלי, M2 < 1.3, רעש נמוך, CW, TTL עד 20 מגה-הרץ. 2 מחברי BNC עבור TTL & כוונון אנלוגי
גוף קירורCobolt11658 (HS-03)שתי יחידות, גוף קירור ללא מאוורר HS-03, גוף קירור ללייזרים 647 ננומטר ו-488 ננומטר
גוף קירורקוהרנטי1193289Obis עם מאוורר, 165 x 50 x 50 מ"מ עבור לייזר 561 ננומטר
CAB-USB-miniUSBCobolt10908שתי יחידות, כבל תקשורת ללייזרים 647 ננומטר ו-488 ננומטר
אלומיניום לכוונון גובהמקמאסטר-קאר9146T35רב תכליתי 6061 אלומיניום, בר מלבני, 4 מ"מ X 40 מ"מ, 1 'ארוך להעלאת אלומיניום לייזר 561 ננומטר
לכוונון גובהMcMaster-Carr8975K248רב תכליתי 6061 אלומיניום, 1-1/4 אינץ' עובי X 3 אינץ' רוחב X 1 אינץ' אורך להעלאת כבל BNC לייזר 405 ננומטר
L-comCC58C-6RG58C כבל קואקסיאלי, BNC זכר / זכר, מתאם BNC 6.0 רגל
L-comBA1087מתאם קואקסיאלי, מחיצת BNC,
מתאם SMA ל-BNCHODSMA-870ללייזרים של Cobolt MLD יש ממשק SMA, כך שמתאם זה משמש לחיבור BNC.
SMB ל BNC מתאםFairview מיקרוגלFMC1638316-12SMB תקע ל BNC נקבה Bulkhead כבל RG316 קואקס ב 12 אינץ 'עבור קוהרנטי לייזרים אוביס
כרטיס רכישת נתוניםNational InstrumentsPCI-672313 סיביות, 32 ערוצים, 800 kS/s מכשיר פלט אנלוגי לשליטה בלייזרים, DIC LED וכו '
מחסום מסנן גלגל בקר SutterInstrumentLambda 10-Bמחליף
מסנן אופטימפצל פליטהCairnOptoSplit III
מפצל אלומה דיכרואיChromaT640LPXR-UF2מפצל אלומה דיכרואי המפריד בין פליטה אדומה לפליטה ירוקה ב-OptoSplit III
מפצל אלומה דיכרואיChromaT565LPXR-UF2מפצל אלומה דיכרואי המפריד בין פליטה ירוקה ואדומה לפליטה כחולה במסנן פליטה OptoSplit III
ChromaET700/75Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה אדומה (כמו Alexa Fluor 647) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מחסום
מסנן פליטהChromaET595/50Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה צהובה/ירוקה (כמו Cy3B) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מסנן מחסום
ChromaET525/50Mשתי יחידות, מסנן פליטה לפליטה כחולה (כמו Alexa Fluor 488/GFP) ב-OptoSplit III וכן בגלגל מסנן מסנן
הפליטהSemrockFF02-447/60-25מסנן פליטה לפליטה סגולה (כמו DAPI/Alexa Fluor 405), המותקן בגלגל מסנן המחסום
מפצל אלומה דיכרואיChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3מפצל קרן דיכרואי רב-פס לעירורי לייזר 647, 561, 488 ו-405 ננומטר בתוך גוף המיקרוסקופ
סט מסנני DAPIChroma49000מותקן בגוף המיקרוסקופ
לייזר ניקון/מסנן TIRFChroma91032
590 מסנן מעבר ארוךChromaT590LPXR-UF1לשילוב לייזר 647 ננומטר ולייזר 561 ננומטר
525 מסנן מעבר ארוךChromaT525LPXR-UF1לשילוב לייזרים משולבים של 647 ננומטר ו-561 ננומטר עם לייזר 488 ננומטר
מסנן מעביר ארוך 470ChromaT470LPXR-UF1לשילוב לייזרים משולבים כבר של 647 ננומטר, 561 ננומטר ו-488 ננומטר עם לייזר 405 ננומטר
מסנן ניקוי לייזר (647)Chromazet640/20xלניקוי אורכי גל אחרים ממסנן ניקוי לייזר 647 ננומטר
(488)SemrockLL01-488-25לניקוי אורכי גל אחרים ממקור אור LED לייזר 488 ננומטר
ExcelitasX-Cite120LEDהמשמש רק להדמיית DAPI
תושבת מראהניופורטSU100-F3K
עמודים אופטייםניופורטPS-2
מד כוחניופורטPMKITלמדידת עוצמת לייזר
תושבת קומבינר קרן דיכרואיתEdmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount, להחזקת קומבינרים דיכרואיים במכלול עירור הלייזר
טבעת שמירהThorlabsCMRRהמשמשת לתושבות beamcombiner דיכרואיות לוחית
מתאם סיביםThorlabsSM1FCFC/PC לוחית מתאם סיבים עם SM1 חיצוני (1.035 אינץ'-40)
חוט ציר Z תושבת תרגוםThorlabsSM1Zאכרומטית תואמת כלוב 30 מ"מ
ThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 מ"מ, כפולים אכרומטיים רכובים, מצופה AR: 400 - 700 ננומטר
צלחת כלובThorlabsCP1TM0930 מ"מ צלחת כלוב עם חוטים פנימיים M9 x 0.5, מוט הרכבה של כלוב ברז 8-32 מוט
הרכבה כלובThorlabsER4, אורך 4 אינץ', Ø
תושבת הרכבה לכלובThorlabsCP02B30 מ"מ תושבת הרכבה לכלוב
סיבים אופטיים במצב יחידThorlabsP5-405BPM-FC-2כבל תיקון, PM, FC/PC ל-FC/APC, 405 ננומטר, פנדה, 2 מ'
סיבים אופטיים רב-מצבייםThorlabsM42L01Ø 50 ומיקרו; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC כבל תיקון סיבים, 1 מ'
עדשת כפולה אכרומטית (עדשת מג)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 מ"מ, Ø 1/2 אינץ' Achromatic Doublet, ARC: 400-700 ננומטר, עדשה קעורה ב"עדשת מאג"
עדשת Achromatic Doublet (עדשת מג)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 מ"מ, Ø כפול אכרומטי 1/2 אינץ', ARC: 400-700 ננומטר, עדשה קמורה ב"עדשת מג
טבעת שמירהThorlabsSM05PRRSM05 טבעת שמירה מפלסטיק עבור Ø צינורות ותושבות עדשה 1/2 אינץ', עבור "עדשת מג
בורג עם קצה ניילוןThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 בורג עם קצה ניילון, אורך 6 מ"מ, להחזקת "עדשת תלת מימד"
עדשת תלת מימדCVI אופטיקה לייזרRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 מ', עדשה גלילית מלבנית
מצלמת EMCCD AndoriXon Ultra 888
100 ננומטר חרוזים רב ערוצייםתרמוT7279, TetraSpeck microspheres
צבע אדוםThermoAlexa Fluor 647
צבע צהוב-ירוקGE HealthcareCy3
צבע ירוקGE HealthcareCy3B
צבע כחולThermoAlexa Fluor 488
עדשת מוארק מזלג הידוק ניופורט PS-F תושבת תרגום ציר Z של , עדשת כפולה 6 מ"מ ""

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles