מאמר שיטה

ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה

DOI:

10.3791/58332

⸱

12 באוקטובר 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר במהירות, reproducibly articifical בהשראה ביולוגית, מתכלה אנטיגן הצגת תאים (aAPC) עם tunable גודל, צורה של הדם המצגת ל- T cell הרחבה שמחוץ או ויוו .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הם פלטפורמה מבטיח עבור אפנון המערכת החיסונית עקב יכולתם חזק כדי לגרות את תאי T. מצעים acellular מציעים יתרונות מרכזיים על פני מבוססת-תא aAPC, כולל שליטה מדויקת של הפרמטרים מצגת אות ומאפיינים פיזיים של פני השטח aAPC כדי לווסת את האינטראקציות שלה עם תאי T. aAPC בנוי אניסוטרופי חלקיקים, במיוחד אליפסואידי חלקיקים, הוכחו להיות יעילים יותר מאשר עמיתיהם הכדורית שלהם על תאי T מגרה בשל הכריכה מוגברת שטח גדול יותר זמין עבור תא T קשר, גם כן כמו מופחתת ספיגת לא ספציפית, המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת. למרות שהאיחוד חלקיקים אנאיזוטרופי, מקובל אפילו מאוד שיטות של יצירת חלקיקים אניסוטרופי כגון סרט דק מותח עשויה להיות מאתגרת להטמיע ולהשתמש reproducibly.

למטרה זו, אנו מתארים פרוטוקול על הזיוף מהירה, מתוקננת של מתכלה אניסוטרופי מבוסס חלקיק aAPC עם tunable, גודל, צורה, אות מצגת עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו, יחד עם שיטות לאפיין שלהם גודל, מורפולוגיה, תוכן, משטח חלבון כדי להעריך את הפונקציונליות שלהם. גישה זו כדי בודה aAPC אניסוטרופי היא מדרגית, לשחזור, שהופך אותו אידיאלי עבור יצירת aAPC עבור immunotherapies "מדף".

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הראו הבטחה כסוכני immunomodulatory כי הם יכולים ליצור תגובה חזקה תא T אנטיגן ספציפי. אתרי פלטפורמות אלו הן את היכולת שלהם ביעילות להציג אותות חיוני להפעלת תא T. Acellular aAPC הם חלופה אטרקטיבית מבוססת-תא aAPC כי הם קלים יותר ויקרות פחות לפברק בפני אתגרים פחות במהלך הסולם ותרגום, להקל על סיכונים הקשורים טיפולים מבוססי תאים. Acellular aAPC מאפשרים גם רמה גבוהה של שליטה על שידור מצגת פרמטרים ומאפיינים פיזיים של השטח, מה ממשק עם T תאים1.

aAPC חייב מסכם את הדברים מינימום של שני אותות חיוניים עבור הפעלת תא T. אות 1 מספק זיהוי אנטיגן, מתרחשת כאשר הקולטן תא T (TCR) מזהה ועוסק עם מחלקה MHC I או II הנושאת אנטיגן cognate שלה, שהגיעה לשיאה ב איתות באמצעות TCR מורכבות. כדי לעקוף את הדרישה ירידה לפרטים אנטיגן, מערכות aAPC לעיתים קרובות נושאים נוגדנים חד-שבטיים היתה ללא-חת כנגד הקולטן CD3, אשר nonspecifically מעוררת את המתחם TCR. צורות רקומביננטי של MHC, במיוחד MHC multimers, גם שימשו על פני השטח של aAPC כדי לספק אנטיגן ירידה לפרטים2,3. אות 2 הוא סימן costimulatory מנחה את תא T פעילות. כדי לספק את costimulation הדרוש להפעלת תא T, הקולטן CD28 מגורה באופן כללי עם נוגדן היתה ללא-חת הציגו על פני השטח aAPC, למרות קולטנים costimulatory אחרים כגון 4-1BB היה יישוב בהצלחה4. אות 1 ו-2 חלבונים ללא יכולת תנועה הם בדרך כלל על פני השטח של חלקיקים נוקשה לסנתז aAPC. מבחינה היסטורית, aAPC היה מפוברק ממגוון רחב של חומרים, כולל פוליסטירן4,5 ו ברזל לתוספי6. מערכות חדשות לנצל פולימרים מתכלים כמו פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) כדי ליצור aAPC זה יכול להיות משולב בקלות כדי לאותת חלבונים מתאימים עבור ניהול ישיר ויוו, יכול להקל על שחרורו מתמשכת של אנקפסולציה ציטוקינים או גורמים מסיסים להעצמת תא T-הפעלה-7,-8.

בנוסף נוכחותם של חלבונים הדרושים אות, אירוסין קולטן על פני שטח גדול מספיק במהלך האינטראקציה תא aAPC/T חיוני להפעלת תא T. לפיכך, פרמטרים פיזיים של aAPC כגון גודל וצורה באופן דרסטי לשנות תחום הקשר הזמינים, להשפיע על יכולתם לעורר תאי T. AAPC בגודל מיקרון הוכחו להיות יעילים יותר על תאי T מגרה מאשר שלהם הננומטרי עמיתיהם9,10. עם זאת, ננו-aAPC יכול להיות מעולה biodistribution ניקוז טוב יותר אל בלוטות הלימפה עשוי המשפרים את ביצועי ויוו מיקרו-aAPC11. צורה זו היא משתנה אחר עניין במערכות aAPC מבוסס חלקיק. AAPC אניסוטרופי לאחרונה הוכחו להיות יעיל יותר מאשר חלקיקים איזוטרופיות על תאי T מגרה, בעיקר עקב אינטראקציה משופרת עם תאי המטרה בשילוב עם תאים שאינם ספציפיים מופחתת ספיגת. תאים מעדיפים לאגד לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי, ולאפשר רדיוס גדול יותר של עקמומיות, משטח שטוח יותר קשר בין aAPC לבין תא T12. לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי מרתיעה גם phagocytosis, וכתוצאה מכך זמן מחזור הדם מוגברת בהשוואה חלקיקי כדורית בעקבות ויוו המינהל12,13. בגלל יתרונות אלה, חלקיקים אליפסואידי לתווך הרחבה יותר של אנטיגן ספציפי T תאים במבחנה וב ויוו בהשוואה חלקיקי כדורית, אפקט נצפו על מיקרו והן nanoscales12, 13. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לבדות חלקיקים אנאיזוטרופי, אבל סרט דק מתיחה היא שיטה פשוטה, נפוצה ומקובלת המשמש ליצירת מגוון צורות מגוונות של חלקיקים14. בעקבות סינתזה, חלקיקים הם הטלת לסרטים, נמתח בממדים אחד או שניים בטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר זכוכית של החומר חלקיקים. הסרט ואז התפרקה כדי לאחזר את החלקיקים. למרות גוברת ההתעניינות חלקיקים אנאיזוטרופי, לגישות עבור aAPC מבוסס חלקיק שמפברק מוגבלים בעיקר למערכות איזוטרופיות, שיטות של שינוי צורה חלקיק יכול להיות קשה ליישום, תואם מסוימים סינתזה aAPC אסטרטגיות, חוסר דיוק, הפארמצבטית15. הטכניקה מתיחה שלנו סרט דק ניתן לבצע באופן ידני או באופן אוטומטי ליצירת חלקיקים אניסוטרופי מסונתז ממגוון רחב של פולימרים מתכלים במהירות, נמתח יחס רוחב-גובה הרצויה ממדים של אחד או שניים-15.

בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, פיתחנו בגישה מבוסס חלקיק חומר מתכלה בשילוב עם טכנולוגיה מדרגיים של מתיחה סרט דק כדי ליצור במהירות aAPC עם tunable גודל וצורה בצורה סטנדרטית עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו. האסטרטגיה שלנו ההטיה חלבון יכול לשמש זוג protein(s) בכל עניין לקבוצות carboxyl על פני השטח של חלקיקים-צפיפות הרצוי, נותן את המערכת aAPC רמה גבוהה של גמישות. אנו מתארים גם שיטות כדי לאפיין את גודל, מורפולוגיה, ואת התוכן של aAPC הדם, וכן להעריך את הפונקציונליות במבחנה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להרחיב תאים חיסוניים שמחוץ או ויוו למגוון רחב של יישומים immunotherapeutic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. ייצור של כדוריות PLGA חלקיקים בגודל Tunable

  1. הכנה של חומרים עבור חלקיקים סינתזה
    1. להכין תמיסת כוהל פוליוויניל w/w (PVA) 5%.
      1. להוסיף 500 מ"ל מים (DI) יונים הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים ומניחים על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.
      2. כאשר טמפרטורת המים מגיע כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 25 גרם סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.
      3. ברגע PVA כל התפרקה (בדרך כלל 30-60 דקות), לתת פתרון סינון מגניב וסטרילי. לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
    2. להכין סרט פתרון הליהוק של 10% w/w PVA גליצרול w/w 2%.
      1. להוסיף 500 מ"ל מים DI הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים. הוסף 8 מ של גליצרול בטמפרטורת החדר, מיקס על ידי trituration.
      2. מניחים את הבקבוק על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.
      3. פתרון הטמפרטורה מגיעה כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 גר' סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.
      4. לאחר כל PVA התפרקה (בדרך כלל 60 דקות), לתת פתרון סטרילי וקריר מסנן באמצעות מערכת מסנן ואקום בקבוק-העליון עם גודל הנקבוביות של 0.22 μm. לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.
    3. להכין פתרון PVA 50 מ ל w/w 1%. להוסיף 40 מ"ל של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון (בוצעו ב 1.1.1) גביע 100-150 מ.
    4. להכין פתרון PVA w/w 0.5% 100 מ. להוסיף 90 מ של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון גביע 150-250 מ.
    5. להוסיף פס מגנטי מערבבים הפתרון PVA 0.5% והמקום בשכונה כימי על צלחת מערבבים בטמפרטורת החדר 500 סל ד.
  2. סינתזה Microparticle
    1. שוקלים לצאת 100 מ ג של פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) לתוך המבחנה נצנוץ התמוססות ב 5 מ של דיכלורומתאן (DCM). מערבולת כדי להמיס את PLGA.
    2. המקום מהמגן בפתרון PVA 1% 50 מ ל, כך מהמגן הוא קרוב לתחתית כשהספל ככל האפשר מבלי לגעת בו. הפעל מהמגן ולהתאים את המהירות הרצויה — 3,200 סל ד עבור 5 μm קוטר חלקיקים, 5,000 סל ד עבור μm 3, במהירות של 15,000 סל ד עבור μm 1 (הגדלת גודל החלקיקים של ירידות מהירות המגון). פעם אחת על המהירות הרצויה, להוסיף את הפתרון PLGA הספל, homogenize במשך דקה אחת.
    3. לאחר המגון, יוצקים 1% PVA, PLGA microparticle פתרון בתוך 0.5% 100 מ ל תמיסת PVA על צלחת מערבבים ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.
    4. לשטוף את החלקיקים 3 פעמים במים DI.
      1. שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות. שופכים תגובת שיקוע והוסף כ 20 מ ל מים DI.
      2. Resuspend חלקיקים על-ידי vortexing. ברגע resuspended, למלא צינורות חרוט 50 מ ל מים DI.
      3. לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.
  3. ננו-חלקיק סינתזה
    1. שוקלים לצאת 200 מ ג של PLGA לתוך בקבוקון נצנוץ, להמיס 5 מיליליטר DCM. מערבולת כדי להמיס את PLGA.
    2. המקום גביע עם 50 מ ל 1% פתרון PVA לתוך מיכל מלא קרח. מניחים את המכשיר sonicator במיכל קרוב לתחתית ככל האפשר מבלי לגעת. להתחיל sonication ולהוסיף מיד PLGA פתרון לתוך הספל. Sonicate עם כוח של 12 W 2 דקות ליצור חלקיקים עם הקוטר המשוער של 200 ננומטר.
    3. לאחר sonication, יוצקים 1% PVA, PLGA פתרון nanoparticle לתוך פתרון PVA 0.5% 100 מ ב מערבבים בצלחת ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.
    4. שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 g x 5 דקות להסיר את microparticles. להסיר את תגובת שיקוע ויוצקים לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
    5. לשטוף את החלקיקים 3 פעמים עם מים DI. צנטריפוגה ב 40,000 x g במשך 15 דקות. שופכים תגובת שיקוע, resuspend במים DI על-ידי vortexing. לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.

2. ייצור של חלקיקים פולימרים של צורה Tunable

  1. לאחר נטילת PLGA חלקיקים שלוש פעמים, resuspend החלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להוסיף את הפתרון ליהוק הסרט חלקיקים לריכוז החלקיקים הסופי של חלקיקים 2.5 מ"ג/מ"ל.
  2. Pipette התליה של חלקיקים ב 10 מ"ל aliquots 75 x 50 מ מ מלבני פטרי למתיחת חד-ממדי או aliquots 15 mL 100 100x מ מ מרובע פטרי למתיחת דו-ממדית. להסיר בועות על ידי או פיפטה, או בועות לדחוף הצידה ולתת סרטים לילה יבש בשכונה כימי.
  3. פעם סרטים התייבשו, להוריד סרטים ממנות פלסטיק עם פינצטה, לחתוך את הקצוות של סרטים עם מספריים. שמור קצוות צינור חרוטי 50 מ ל כדי לשמש חלקיקי כדורית.
    1. לטעון סרט על גבי הסרט דק אוטומטיות מתיחה התקן על-ידי טעינת סרט על גבי אלומיניום. עבור 1 י מתיחה, הר הסרט על גבי אלומיניום בלוקים של ציר אחד של האלונקה (איור 2) על ידי הצבת שני הקצוות קצר של הסרט בין שני חלקי גומי נאופרן. באמצעות ברגים, בורג אוחז מתכת על גבי גומי כדי להחזיק את הסרט במקום. עבור מתיחה 2D, הר לכל ארבעה קצוות על גבי ארבעה רחובות אלומיניום למתוח על שני הצירים (איור 2).
    2. למדוד ולהקליט את אורך הסרט בין אלומיניום בלוקים על ציר אחד למתיחת 1 D או שני הצירים למתיחת 2D. לחשב את המרחק נדרש למתוח את הסרט באחד או בשני כיוונים בהתבסס על הרצוי קיפול-מתיחה.
    3. למקם את המכשיר מתיחה הסרט נטען בתנור ב 90 מעלות צלזיוס ולהביא את הסרט טמפרטורה מעל 10 דקות. מניחים גביע גדול בתנור עם כמות קטנה של מים.
    4. הסרט למתוח.
    5. כאשר מתיחה הושלם, להסיר את ההתקן מתיחה מהתנור ומצננים את הסרט לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    6. עבור 1 י מתיחה, חותכים את הסרט שליפת מתיחה בקצוות. עבור מתיחה 2D, חתך למרכז ריבוע של הסרט בצורה אחידה נמתחת ושמור על שני הצירים. במקום סרטים צינורות חרוט עם סרטים 2 למחזור ולהשליך את השאר של הסרט.
    7. להוסיף כ- 25 מ ל מים DI כל צינור חרוטי ו מערבולת עד הסרטים הם התפרקה.
    8. ברגע הסרטים הם חלקיקי המומס, תשטוף 3 פעמים עם מים DI.
      1. עבור microparticles, למלא את צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות, שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.
      2. עבור חלקיקים, העברת חלקיקים מהירות גבוהה צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה ב g 40,000 x ל-15 דקות שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.
    9. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend חלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להקליט את המשקל של הצינורית microcentrifuge ולהוסיף חלקיקים ברכבת התחתית. להקפיא חלקיקים במקפיא-80 מעלות צלזיוס במשך שעה או להקפיא פלאש בחנקן נוזלי. ברגע קפוא, lyophilize חלקיקים בן לילה.
    10. לאחר lyophilized, שוקל חלקיקים בצינור microcentrifuge ואת הפחת משקל מוקלטות של הצינור ריק כדי לקבוע את המשקל של חלקיקים lyophilized.

3. הדם ההטיה כדי ליצור מלאכותי אנטיגן הצגת תאים

  1. להכין 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר. להפוך את פתרון 0.1 M של MES במים ולהתאים את ה-pH עד 6.0 באמצעות טיטור עם 1 מ' הידרוקסיד הנתרן (NaOH).
  2. Resuspend lyophilized PLGA/PBAE מיקרו/חלקיקים ב 20 μg/mL במאגר MES על-ידי vortexing. למלא את צינור פוליפרופילן microcentrifuge μL 900 MES המאגר ולהוסיף μL 100 של הפתרון של חלקיקים ברכבת התחתית.
  3. להכין פתרון EDC/NHS. להמיס carbodiimide 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 40 מ"ג (EDC) ו- 48 מ"ג N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) במאגר MES 1 מ"ל.
  4. להוסיף 100 μL EDC/NHS פתרון החלקיקים ואת מערבולת לערבב.
  5. דגירה הצינור על מהפך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  6. ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל PBS על-ידי vortexing (microparticles) או sonicating ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים).
  7. עבור microparticles, להוסיף 8 μg של החלבון הרצויה אות 1, ועכבר 10 μg אנטי-CD28 (שיבוט 37.51) החלקיקים. חלקיקים, להוסיף 16 μg אות 1 ו- 20 μg אנטי עכבר CD28. הוסף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 1.1 מ.
  8. דגירה הצינור על מהפך ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. למחרת, לשטוף את החלקיקים. ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend חלקיקים ב 1 מ"ל של PBS סטרילי על-ידי vortexing (microparticles) או sonication ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים). חזור על פעמיים.
  10. Resuspend החלקיקים על הריכוז הרצויה ביותר במדיום תרבות לשימוש מיידי. לאחסון לטווח ארוך, resuspend חלקיקים-10 מ"ג/מ"ל תמיסת סוכרוז 100 מ מ. להקפיא, lyophilize ואחסן את החלקיקים ב-80 מעלות צלזיוס.

4. אפיון והערכת aAPC

  1. אפיון aAPC גודל וצורה (איור 3)
    1. לאפיין בצורה ובגודל microparticle על ידי חלקיקים הדמיה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). עבור SEM הדמיה, התפשטות חלקיקים lyophilized על גבי קלטת פחמן דבקה אלומיניום להוסיף, להתיז בחוטי זהב-פלדיום.
    2. לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
    3. כדי לקבוע את גודל החלקיקים, להגדיר באמצעות סרגל קנה מידה ומדידת קוטר של חלקיקים. חזור על-100 חלקיקי לקבוע את הקוטר החלקיקים הממוצע ולהפיק היסטוגרמה של גודל החלקיקים.
    4. כדי לקבוע יחס גובה-רוחב, למדוד את המרחק על פני ציר זמן, הציר הקצר של חלקיקים ולחלק ציר זמן קצר הציר. חזור על-50 חלקיקים של כל צורה כדי לקבוע יחס הגובה-רוחב החלקיקים הממוצע עבור כל צורה ולהפיק היסטוגרמות.
    5. לאפיין בצורה ובגודל ננו-חלקיק על ידי הדמיה חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM). לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כפי שמתואר 5.1.2. לחלופין, למדוד גודל כדורית nanoparticle באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) או nanoparticle מעקב ניתוח (נ).
  2. יעילות ההטיה חלבון
    1. להכין aAPC על פי שיטות 1-3, אבל ב- 3.7 צעד להשתמש fluorescently שכותרתו אות 1 חלבון ו- CD28 אנטי עכבר. לאחר ההטיה, כביסה, resuspend את aAPC ב 1 מ"ל PBS עבור ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל aAPC.
    2. הכנת סטנדרטים חלבון microplate 96-ובכן פוליסטירן שחור. להוסיף 5 μg של האות fluorescently שכותרתו 1 חלבון PBS בהבאר הראשונה של הצלחת ולעשות 10 דילולים 1:2 ב- PBS לרוחב השורה של הצלחת. להשאיר ריק טוב אתמול. חזור על שלב זה כדי ליצור קבוצה נוספת של סטנדרטים עם אנטי fluorescently שכותרתו-CD28.
    3. פיפטה μL 100 של הפתרון aAPC לתוך בארות שכפל microplate פוליסטירן שחור דולר.
    4. קרא את זריחה על קורא צלחת פלורסצנטיות באורכי המתאים. להשתמש את קריאות קרינה פלואורסצנטית מכל הסטנדרטים חלבון כדי ליצור עקומות סטנדרטי עבור כל נוגדן פלורסנט. באמצעות עקומת סטנדרטי, לחשב את ריכוזי אות 1 אנטי-CD28 היטב כל דגימה, ואז לחשב את כמות הדם ויעילות ההטיה (איור 4A, 5A איור).
  3. הערכה של aAPC לגירוי במבחנה של CD8 + T תאים
    1. להכין המדיה ב' (בינוני RPMI בתוספת L גלוטמין, 10% FBS, פתרון חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% נתרן פירובט, 1% פתרון MEM ויטמין, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ננוגרם למ"ל ציפרופלוקסאצין ו 30 U/mL il-2.
    2. אקריב עכבר שחור 6 בעזרת חשיפה פחמן דו-חמצני.
    3. הקציר הטחול מהעכבר לפי פרוטוקול שנקבעו קודם16. לאסוף את הטחול צינור חרוטי 50 מ עם 10 - 15 מ"ל PBS. באמצעות כבעלי, מועכים הטחול דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. במהלך רסוק, לשטוף את מסננת עם 40 מ"ל PBS.
    4. לסובב את splenocytes ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend את splenocytes ב 4 מיליליטר Ack Lysing מאגר כדי lyse כדוריות דם אדומות. לאפשר את הצינור לשבת ללא הפרעה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להוסיף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 20 מ.
    5. לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    6. לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות, resuspend באמצעי האחסון הרצוי תא ההפרדה המאגר. בידוד תאי CD8 + T מן התליה תא בודד באמצעות CD8 + שלילי מבחר תא T בידוד ערכת, ע פ הפרוטוקול של היצרן.
    7. בעקבות הפרדה מגנטית, ספין תאי CD8 + T-g 300 x במשך חמש דקות ולהסיר את המאגר ההפרדה תא. Resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ולספור את התאים. תווית תאים עם אסתר succinyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי הפרוטוקול של היצרן.
    8. דגירה 8,333 CD8 + T תאים, 0.0833 mg (או במינון הרצוי) של aAPC בתקשורת ב' μL 150 היטב כל של 96 ובכן U-תרביות רקמה שטופלו הצלחת התחתונה.
    9. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר 3-4 ימים, רענן המדיום תרבות על-ידי הוספת 75 μL בינוני טריים מכל קידוח.
    10. לאחר 3 ימי דגירה, לנתח CFSE מתויג לתאים cytometer זרימה כדי להעריך את התפשטות. כל שיא על ההיסטוגרמה CFSE cytometry זרימה מייצג דור של תאים עקב דילול CFSE עם כל חלוקת התא רצופים.
    11. לאחר 7 ימים, להשתמש hemocytometer כדי לספור את מספר התאים היטב בכל. לפני ספירה, כתם תאים מתים עם פתרון Trypan Blue. אל תכלול תאים מתים ספירת הסופי. לנרמל את הריכוז הסופי תא לריכוז הראשונית כדי לחשב את הקיפול-הרחבת (איור 4 , איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מפרטים טכניים עבור הסרט דק אוטומטית 2D מתיחה התקן ניתנת באיור1. מפרטים טכניים ותיאור עבור סרט דק 1 י מתיחות התקן ניתנת et al. הו17 האלונקה נבנית חלקי אלומיניום באמצעות טכניקות לכרסום וחריטה סטנדרטי. בדומה האלונקה 1 י, האלונקה 2D מורכב אוחז מתכת ומעקות מדריך. ברגים עופרת דו-כיווני משמשים כדי לתרגם ליניארי לתנועה סיבובית. הברגים עופרת הם המצורפת באמצעות הברזים מכני זהים stepper מוטורס עם מומנט מספיק. יהיה מולחם החוטים השליטה המוטורית ste...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטה רב-תכליתי לדור מדויק של חלקיקים פולימרים אנאיזוטרופי. הסרט דק מותח בטכניקה המתוארת כאן היא מדרגית, לשחזור וזולה מאוד. טכניקות חלופיות ליצירת חלקיקים אניסוטרופי סובלים מגבלות רבות, כולל עלות גבוהה, תפוקה נמוכה, גודל החלקיקים מוגבלת. הסרט דק מותח הגישה גם יתרון כי החלקיקים משתנים כדי להתאים אניסוטרופי לאחר הסינתזה, כתוצאה מכך, הוא תואם עם מגוון רחב של גודל החלקיקים וטכניקות סינתזה. איור 1 מפרט את ההתקנה של המכשיר מתיחה אוטומטית דו מימדי. מכשיר זה יכול לשמש גם ללא הרכיבים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EBA (DGE-1746891), KRR (DGE-1232825) תודה התוכנית NSF מלגת מחקר לתארים מתקדמים לקבלת תמיכה. רם תודה את נבחרת מחקר שירות פרס NIH NCI F31 (F31CA214147), הגמול הישג עבור מכללת אחווה מדענים לקבלת תמיכה. המחברים תודה NIH (R01EB016721 ו- R01CA195503), מחקר כדי למנוע עיוורון ג'יימס ופרס קרול חינם זרז, ו מכון בלומברג-קימל JHU על חיסוני סרטן לקבלת תמיכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פולי (אלכוהול ויניל), MW 25000, 88% הידרוליזהPolysciences, Inc.02975-500
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G9012
מדחום דיגיטליFlukeN / Aשם דגם: Fluke 52 II
בדיקת טמפרטורת טבילהFluke N/ Aשם דגם: Fluke 80PK 22
פלטה דיגיטלית & StirrerBenchmark ScientificH3760-HS
בוחש רב-נקודתיThermo Fisher Scientific50093538
רסומר RG 504 H, פולי(D,L-לקטיד-קו-גליקוליד)סיגמא-אולדריץ'719900
דיכלורומתאןסיגמא-אולדריץ'D65100
הומוגנייזרIKA 
סוניקטורסוניקס & חומרים, בע"ממספרדגם: VC 505
Sonicator מארז הפחתת רעשSonics & חומרים, בע"מלא ישיםמספר חלק: 630-0427
בדיקת סוניקטורסוניקס & חומרים, בע"ממספרחלק: 630-0220
Sonicator microtipSonics & חומרים, בע"ממספרחלק: 630-0423
צנטריפוגה במהירות גבוההבקמן קולטרN/Aמספר דגם: J-20XP (הופסק), דגם חלופי: J-26XP
רוטור צנטריפוגה במהירות גבוההבקמן קולטר369691מספר דגם: JA-17
צינורות צנטריפוגה פוליקרבונט במהירות גבוההThermo Fisher Scientific3118-005050 מ"ל, מכסה בורג
פטרי חד פעמי מלבני צלחתVWR International25384-32275 x 50 x 10 מ"מ
צלחת פטרי חד פעמית מרובעתVWR International10799-140100 מ"מ x 100 מ"מ
LEAF  מטוהר נגד עכבר CD3ε נוגדןBiolegend100314
InVivoMab נגד עכבר CD28, שיבוט 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE6383
N-Hydroxysulfosuccinimide מלח נתרןSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 נגד עכבר CD3 נוגדןBiolegend100212
APC נגד עכבר CD28 נוגדן Biolegend102109
קורנינג  96 באר פוליסטירן מוצקMicroplate Sigma-AldrichCLS3915 תחתית שטוחה, חלבון פוליסטירן שחור
LoBind Tubes, 1.5 מ"לEppendorf22431081
RPMI 1640 בינוני (+ L-גלוטמין)ThermoFisher Scientific
סרום בקר עובריSigma-AldrichF4135מומת בחום, מסונן סטרילי
Sigma-Aldrich17850
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M6250
רקומביננטי אנושי IL-2 (ללא נשא)Biolegend589102
נתרן פירובט (100 מ"מ)ThermoFisher Scientific11360070
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM ויטמין פתרון (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  ערכת בידוד תאי T, עכברMiltenyi Biotech130-104-075
ערכת התפשטות תאים CellTrace CFSEThermoFisher ScientificC34554
עמודותLS Miltenyi Biotech130-042-401
מפריד MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
זרימה ציטומטרAccuri C6
סינרגיה 2 קורא מיקרופלייט רב זיהויBioTek
autoMACS מאגר ריצהMiltenyi BIotech130-091-221
מסננת תאיםThermoFisher Scientific22363548סטרילי, 70 ומיקרו; מ רשת ניילון
ACK מאגר ליסינגThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (שחור 6) עכברמעבדת ג'קסון000664זכר, לפחות 7 שבועות
צלחות תרבית רקמות U-BottomVWR353227צלחות פוליסטירן סטריליות, 96 בארות שטופלו בתרבית רקמות
40 V ספק כוחProbotixLPSK-4010
PTFE עכבר תיל מצופה602-5858-100-01זה מיועד לסליל של 100 רגל אבל חוט שווה ערך יעבוד
דרייבר מנוע צעדProbotixMondoStep5.6
ערכת מחבר IDCProbotixIDCM-10-12
מיקרו-בקרProbotixPBX-RF
4A נתיכיםרדיו Shack2701026נתיכים שווי ערך יעבדו גם
כבל DB25 זכר לזכרProbotixDB25-6 USB-A
ל-USB-Bסיכות2094915שווה ערך יעבוד גם
מחברי Amphenol 8 פינים עכבר זכר ונקבה654-97-3100A-20-7P ו-654-97-3106A20-7S
מנוע צעדProbotixHT23-420-8
בורג עופרת ימנירוטון60722
בורג עופרת יד שמאלרוטון60723
ברגיםמקמאסטר קאר92196A151
גומי ניאופרןמקמאסטר קאר8698K51
אגוז עופרת אוגן ימנירוטון91962
אגוז עופרת אוגן שמאלירוטון91963
מחשב בקרת לינוקספרובטיקסLCNC-PCכל מחשב עם מפרט תואם ומערכת הפעלה לינוקס יעבוד
מערכת מסנן ואקום בקבוק CorningSigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
0003725001 11875093 ציפרופלוקסצין כן כבל כן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PLGATTEMSEM

מאמרים קשורים