התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן שלפוחית השתן היא בעיה בריאותית משמעותית. ההערכה היא כי יותר מ 16,000 אנשים ימותו השנה בארצות הברית מסרטן שלפוחית השתן. בעוד 75% ממקרי סרטן שלפוחית השתן הם לא פולשנית, לא סביר גרורות, כ-25% ההתקדמות דוגמת גידול פולשני. עד חצי של החולים עם סרטן פולשני יפתחו relapse גרורתי קטלני. לפיכך, הבנת המנגנון של התקדמות פולשני בסרטן שלפוחית השתן היא קריטית לחזות תוצאות המטופל וכדי למנוע גרורות קטלניות. במאמר זה, נציג מודל הפלישה סרטן תלת מימדי המאפשר שילוב של תאים סרטניים ורכיבים סטרומה לחקות ויוו מצבים המתרחשים microenvironment הגידול שלפוחית השתן. מודל זה מספק הזדמנות לבחון את תהליך פולשני בזמן אמת באמצעות הדמיה בצילום מואץ, תחקור מסלולים מולקולריים המעורבים באמצעות קונאפוקלית immunofluorescent תרכובות הדמיה ומסך עם פוטנציאל הפלישה בלוק. בעוד פרוטוקול זה מתמקד סרטן שלפוחית השתן, סביר להניח כי ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לבחון את הפלישה, תנועתיות בסוגי סרטן אחרים גם.
מבוא
הפלישה הוא שלב קריטי בהתקדמות סרטן, אשר נדרש עבור גרורות, והיא קשורה עם הישרדות נמוכה יותר, פרוגנוזה גרועה אצל חולים. ב סרטן שלפוחית השתן אנושי, הגידול הנפוץ ביותר בדרכי השתן הגורמת כ 165,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם, שלב סרטן, הטיפול והפרוגנוזה אינם קשורים ישירות נוכחות או היעדרות של הפלישה1. כ- 75% מהמקרים של סרטן שלפוחית השתן מנוהלים שאינם שרירים פולשנית ואינם עם כריתה מקומית. לעומת זאת, סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן (כ-25% מכלל המקרים) הם גידולים אגרסיביים עם שיעור גרורתי גבוה ומטופלים עם2,טיפול אגרסיבי multimodality3. לכן, הבנה מסלולים מולקולריים המפעילות הפלישה הוא חיוני כדי לאפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גידול סרטן Spheroids
-
גידול מ שורות תאים
- התרבות האנושית שלפוחית השתן התאים הסרטניים תחת מחסידי קונבנציונאלי תא תרבות תנאים ולתחזק ב חממה 37 ° C שסופק עם 5% CO2. לשמור על תאים ב- < 90% confluency.
הערה: תרבות מדיה המשמשת היא של Dulbecco ששינה המדיה מינימלי הכרחי (DMEM) המכילה 4.5 g/L D-גלוקוז-גלוטמין, 110 מ ג/ליטר נתרן פירובט, ויסופק עם 10% עוברית שור סרום (FBS) לאורך כל פרוטוקול זה. - יום אחד לפני תחילת הניסוי, trypsinize (על-ידי שימוש 0.25% טריפסין-EDTA) תאים, לכמת תא ריכוז והפצה של תאים6 עונה 1 פרק 10 מ"ל 3 תרבות המדיה כל טוב של צלחת מצורף 6-ובכן נמוך במיוחד.
- דגירה בתאים תנאי ההחזקה....
- התרבות האנושית שלפוחית השתן התאים הסרטניים תחת מחסידי קונבנציונאלי תא תרבות תנאים ולתחזק ב חממה 37 ° C שסופק עם 5% CO2. לשמור על תאים ב- < 90% confluency.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יצירה מוצלחת של ספרואיד גידול סרטן שלפוחית השתן פולשנית דורש את היווצרות גידול בגודל מתאים spheroids של שורות תאים או גידולים העיקרי. איור 2 א מראה בגודל מתאים spheroids התפתח ארבע האנושי שלפוחית השתן סרטן שורות תאים (אום-UC9, אום-UC13, אום-UC14, 253J ו- UM-UC18). איור 2 B מראה על גידול ספרואיד בגלל גידול שלפוחית השתן שנוצר על-ידי BBN העכבר בתוך מטריצת קולגן. Spheroids אלו הוטבעו כמתואר לעיל, להח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן נתאר מודל תלת-ממדי הגידול ספרואיד המאפשר תצפית בזמן אמת של פלישה של סרטן שלפוחית השתן אשר הוא קריטי עבור התקדמות סרטן, גרורות. מערכת זו היא נוטה שילוב של רכיבים סטרומה וסלולריות שונים כדי לאפשר חוקרים כדי לסכם טוב יותר microenvironment את רקמת שם מתקיים הפלישה סרטן שלפוחית השתן. Spheroids סרטן שלפוחית השתן ניתן להפיק ממקורות שונים כגון שורות תאים (כולל שורות תאים מהונדסים שימושי עבור הבחינה של מסלולי להשפיע על תהליכים הפלישה איתות), ועכבר העיקרי גידולים (המתוארים כאן). זה יכול להיות גם להיות מותאם לניתוח הגידול העיקר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים רוצה להודות המעבדה של ד ר הווארד קרופורד (אוניברסיטת מישיגן) עבור תמיכה טכנית מתן וחומרים במחקר זה ציוד אלן קילר לקבלת תמיכה טכנית.
עבודה זו מומן על ידי מענקים מן האוניברסיטה של מישיגן רוגל סרטן מרכז הליבה גרנט CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (פיפ), ניתן YIA (פיפ), CA17483601A1 R01 NIH (DMS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קווי תאים של סרטן שלפוחית השתן האנושית UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| מדיום תרבית תאי DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| סרום בקר עוברי | תרמו פישר סיינטיפיק | 26140079 | |
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייקטית (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | תרמו פישר סיינטיפיק | 25200056 | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | קורנינג | 3471 | |
| מיקרוסקופ הפוך קונבנציונלי | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | שימוש כללי לתרבית תאים ובדיקת ספרואידים |
| קולגן מסוג 1 מזנב חולדה, ריכוז גבוה | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Carl Zeiss | LSM800 | מיסקוסקופ קונפוקלי עם תא אקלים, הדמיה מרובת מיקומים ופונקציית סריקה Z-stack |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 תוכנה לעיבוד תמונה | תמיסת קרל זייס | ||
| פרפורמלדהיד | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | |
| ImmEdge מחסום הידרופובי PAP | מעבדות וקטור עט | תרכובת H4000 | |
| O.C.T | תרמו פישר סיינטיפיק | 23730571 | |
| פתרון Hoechst 33342 | תרמו פישר סיינטיפיק | 62249 | |
| נוגדן נגד ATDC (Trim29) | סיגמא-אולדריץ' | HPA020053 | |
| אנטי ציטוקרטין 14 נוגדן | Abcam | ab7800 | |
| נוגדן נגד וימנטין | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | מדיום הרכבה |
מקורות
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
