קביעת כשירות הרבייה על-ידי המאשר תחילת המתבגר וביצוע וזמינותו של פוריות ב עכברים וחולדות

סיכום

טיפולים רבים, מוטציות גנטיות להשפיע על התזמון של בגרות מינית ופוריות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר ב עכברים וחולדות לפני הגדרת מחקר פוריות בחיות בגרו.

תקציר

הערכה של יכולת הרבייה היא קריטית להבנת ההשפעה של הטיפול או מניפולציה גנטית על ציר הרבייה, גם כינה את הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. הציר הרבייה היא אינטגרטור מפתח של קלט סביבתי ופנימיים בהתאמת לפוריות תנאים נוחים עבור רבייה. לפני היציאה על מחקר פוריות עכברים וחולדות, בגרות מינית מוערך לשלול את האפשרות כי הפנוטיפים הרבייה שנצפה נגרמות על ידי עיכוב או נעדר תחילת המתבגר. פרוטוקול זה מתאר בגישה פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר אצל זכרים באמצעות הקביעה של ההפרדה preputial, אצל נקבות דרך פתח הנרתיק, ייחום ראשון. לאחר האישור של סיום ההתבגרות, ההישג של בגרות מינית, יכול להיות יזם מחקר פוריות. ההליך מתאר את תנאי גידול אופטימליים עבור עכברים, חולדות, כיצד להגדיר מחקר פוריות אילו פרמטרים כדי להעריך ולקבוע אם הטיפול או מחיקה ג'ין יש השפעה על פוריות.

מבוא

המעבר לבגרות נדרש להשיג בגרות מינית וכשירותם הרבייה. המעבר המתבגר ותחזוקה של פוריות בבגרות מוסדר על ידי הציר הרבייה, גם כינה את הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים (איור 1). העיתוי של תחילת המתבגר ותחזוקה של פוריות מוסדר בחוזקה על ידי גורמים פנימיים, כמו גם הסביבה כדי להגדיל את סיכויי ההישרדות של הצאצאים וההורים^1,2. פרוטוקול זה מספקת גישה פולשנית לקבוע המתבגר התחלתה של עכברים וחולדות לאשר בגרות מינית לפני הגדרת מחקר פוריות כדי להעריך את יכולת הרבייה.

מחקר פוריות מבוצעת בבעלי חיים בגרו, ניתן לאתחל לאחר החיות עברו גיל ההתבגרות. לפני תחילת המתבגר, הציר הרבייה היא השבתה הדרגתית, הנהג מפתח של התבגרות מינית, גונדוטרופין – releasing הורמון (GnRH), הוא שוחרר לתוך בלוטת יותרת המוח בכמויות לא מספיקות כדי ליזום גיל ההתבגרות (איור 1). תחילת המתבגר היא תהליך מורכב שתוצאתו שחרור מוגבר GnRH קדושתו החציוני. GnRH מעודד הורמון מחלמן (LH) ואת זקיק מגרה הפרשת הורמון (FSH) של בלוטת יותרת המוח, שני הורמונים חיוניים עבור ההבשלה האשכים ותפקוד הרבייה (איור 1)^3,4,5 .

עלבונות לציר הרבייה לגרום הפריון, ויכול גם מראש או עיכוב התפתחות המתבגר. תנאים ידוע להשפיע על התזמון של תחילת המתבגר וכשירותם הרבייה כוללים את החשיפה משבשי כימיקלים^6,7, הגוף עלה/ירד במשקל^1,8, שינויים היום אורך^2,9 , מוטציות גנטיות^{10,11,12,13,14,15}.

תחילת הבגרות המינית היא צעד קריטי זה צריך להסתיים לפני הגדרת וזמינותו של פוריות. היתרונות של קביעת תחילת המתבגר דרך ההפרדה preputial, פתח הנרתיק, ייחום ראשון, הם המאפיינים לא פולשנית של נהלים אלה, כפי שהם אינם מצריכים איסוף דם או הקרבת בעלי חיים^{16, 17}.

לאחר תחילת המתבגר נקבע, הגדרת כראוי מחקר פוריות יספק מידע חשוב אודות השלמות של הציר הרבייה, בדרך כלל יש היתרון השני של יצירת חיות ניסוי ללימודי (עידון) ¹⁸. הגדרת המחקר פוריות שמתואר פרוטוקול זה יכול לזהות חסרונות קטנים וגם גדולים ביכולת הרבייה של זכרים ונקבות. מפתח הערכה שפרמטרים 1) זמן ההמלטה הראשונה, 2) מספר המלטות המופקים גודל מסגרת הזמן וחול 3) נתון. לבסוף, המלצות עבור הסוג של מעקב מחקרים אשר יכול להתבצע כדי לזהות את הגורם ליקוי פוריות הינם כלולים.

הפרוטוקול המתואר מתייחס עכברים ומשקפים הנתונים נציג העבודה העכברים הטרנסגניים. עם זאת, כל הפרוטוקולים כלולים תקפות באותה מידה בחולדות.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן מאושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן, שנערכו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה.

1. לקבוע את תחילת המתבגר

1. פעל לפי ההנחיות מוסדי עבור בגדים, לכל הפחות, יש צורך ללבוש חלוק מעבדה נקייה והכפפות נקיות. תמיד להתמודד עם עכברים לבש כפפות נקיות.
2. הכינו את משטח העבודה על-ידי הצבת משטח על השולחן.
   1. מניחים מלמעלה כלוב עכבר נקי עם רשת כלפי מעלה על משטח.
   2. הגדר בקנה מידה באזור העבודה. במקום גביע נקי 500-1000 מ"ל על הסולם ואת טרה.
   3. הנח גיליון ליד אזור העבודה משקל הגוף הרשומה ואת ההפרדה preputial, פתח הנרתיק או ייחום ראשון.
3. לזהות עכברים לצורך המחקר. לבצע בדיקות מדי יום עבור המתבגר התחלתה עד גיל ההתבגרות. לבצע את הבדיקה באותו זמן של יום לאורך כל תקופת המחקר. תחילת המתבגר יכול להתרחש מוקדם ככל כמחנכת יום 11-12-¹⁹, עם זאת, ב setups האקספרימנטאלי ביותר, תחילת המתבגר ניטור מתחיל ~ 22 ימים.
4. למקם את הכלוב העכבר באזור העבודה (שלב 1.2). לפתוח את הכלוב ולמקם את המכסה, בקבוק מים, מזון מחזיק על השולחן.
5. קביעת הפרדה preputial בעכברים זכרים.
   1. בעוד אתה מחזיק את העכבר בזנבו, למקם אותו על גבי כלוב עכבר נקיים מ שלב 1.2.1. כשאני בעדינות מחזיק הזנב, תן את העכבר לחקור את הרשת של הכלוב העליון ~ 5 s.
   2. משוך בעדינות את הזנב לאחור; בדרך כלל התוצאה החיה לנוע קדימה בזמן שהחזיקו. הרשת עם הרגליים הקדמיות שלה. הגישה היד השנייה על העור מקרבת הצוואר והאוזניים.
   3. לתפוס את העור רופף בין הכתפיים לצוואר עם האגודל והאצבע. חשוב להשיג אחיזה טובה של העור, כמו זה ימנע את העכבר מסתובב הראש שלו לנשוך.
   4. . תפוס את העור על הגב עם האצבעות הנותרות והחזק אותו על ידי לחיצה על היד. תחזיק ביציבות ללא הפרעה הנשימה, הדם זרימה או מזיק העצמות, השרירים או העור. הפעל את היד כדי לחשוף את הבטן של העכבר, תוך תמיכה האחורי של העכבר בתוך כף היד.
   5. עם יד חופשית, דחף בעדינות בחזרה את העור סביב הפין מבלי לכפות. -הפרדת preputial, העור preputial שקופיות אחורה לחשוף את העטרה הפין (איור 2 א, חץ מציג ההפרדה preputial). רישום נוכחות או היעדרות של הפרדה preputial.
   6. שוקל את העכבר בעדינות זה, להניח הספל 500-1000 מ ל מ שלב 1.2.2 ולהקליט את המשקל.
   7. להציג מחדש את העכבר בתוך הכלוב לדיור על-ידי החזקת את הספל 0-2 ס"מ על רצפת הכלוב, לאט להתהפך כשהספל ומאפשר את העכבר כדי לצאת בכוחות עצמו. לנקות את. הספל עם סבון עדין ומים, תייבש את זה לפני להחזירו הסולם ואת taring את קנה המידה.
6. קביעת פתח הנרתיק בעכברים הנשי.
   1. מניחים כדור צמר גפן, גביע, בקבוק מים סטרילי באזור העבודה (שלב 1.2). שופכים את המים לתוך הספל. ללחלוח על כדור צמר גפן עם מים סטריליים והצב אותה ליד הכלוב העליון מ שלב 1.2.1.
   2. למקם את הכלוב העכבר באזור העבודה (שלב 1.2), להעביר את העכבר מכלובה הביתה לפסגה הכלוב (שלב 1.2.1) על ידי החזקתה בבסיס הזנב. משוך בעדינות בחזרה את הזנב לעודד תנועה קדימה של העכבר.
   3. הרם את הזנב תוך תמיכה המותניים עם האצבעות חינם. אפשר את hindlimbs לשמור על קשר עם החלק העליון של הכלוב. אם העכבר זז יותר מדי, החזק אותה ביד כפי שמתואר שלבים 1.5.1-1.5.4.
   4. בעדינות לנקות הפות עם הכדור כותנה humidified מים מ שלב 1.6.1. השתמש כדור צמר גפן נקי humidified עבור כל עכבר. כדי לקבוע את פתח הנרתיק, לבחון את הפות, לקבוע אם הנרתיק היא פתוחה לחלוטין (איור 2 א, פתח הנרתיק הנשי).
   5. להקליט אם אירעה פתח הנרתיק. שוקל את העכבר ולהחזיר אותה לכלוב הביתה כפי שמתואר שלבים 1.5.6-1.5.7.
7. ייחום ראשון מחוון הביוץ הראשון.
   1. מניחים גביע במים סטריליים, זכוכית עם תוויות על פיפטה 200 µL עם טיפ נקי באזור העבודה (שלב 1.2).
   2. החזק את הנקבה כפי שמתואר בשלב 1.6.2-1.6.3. מניחים את קצה פיפטה המכיל ~ 50 µL של מים סטריליים על פתח הנרתיק.
   3. בעדינות לרוקן את התאים של קיר הנרתיק ע י החדרת reabsorbing ~ 50 µL של מים 2 - 4 פעמים. כתם בתוכן מהקצה פיפטה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית עם תוויות.
   4. בזהירות לצפות המורפולוגיה הסלולר על מיקרוסקופ brightfield באמצעות 10 X או 20 X המטרה או לתת את airdry השמצות על ~ 1 h, ואז counterstain עם פתרון מתילן כחול 0.1% (מומס ddH₂O) (איור 2B). כדי counterstain, לטבול את השקופית מיובשים בתוך תמיסת מתילן כחול 0.1% עבור ~ 30 s. תנו לאוויר שקופית יבש לשעה.
   5. לבחון את השקופיות מהשלב 1.7.4 על מיקרוסקופ שדה בהיר 10 X או 20 X. להקים את השלב של ייחום (איור 2B)²⁰ על ידי התבוננות המורפולוגיה תא המאפשר להבחין את ארבעת השלבים ברורים ייחום (איור 2B).
      הערה: Metestrus מאופיין על ידי תערובת של cornified לתאי האפיתל הקשקש, לויקוציטים, diestrus על ידי לויקוציטים, proestrus על ידי עירוב של לויקוציטים nucleated בתאי אפיתל, ואת ייחום על ידי תאים אפיתל cornified (איור 2B) ²⁰.
   6. להקליט את משקל הגוף ולחזור העכבר לכלוב שלו הביתה, כפי שמתואר צעדים 1.5.6-1.5.7. . מריחות הנרתיק הסתיימו ביום כאשר העכבר יש שלה ייחום ראשון (איור 2B).

2. רצוי גידול בתנאי החדר

1. להבטיח החדר הרבייה לטמפרטורה של ~ 20-24 ° C, עם 55 ± 10% לחות, ואחידה חדר האור של עוצמות של ~ 300-400 לאקס כ- 1 מ' מעל קומה²¹. עוצמת האור הזה מאפשר עוצמת האור רצוי כלוב בינוני של 25-80 lux. כדי לבדוק את עוצמת האור, השתמש מד האור.
2. השתמש במערכת אוטומטית כדי לקבוע את התאורה בחדר הרבייה כדי להבטיח העיתוי המתאים של תאורה לאורך כל הניסוי. תנאים אופטימליים אורך היום כדי להעריך את פוריות בטווח מכרסמים מיום 12 שעות (12 שעות אור וחושך 12 שעות, LD12:12), בתנאי "קיץ כמו" עם 14 h של החושך (LD14:10) של אור ו- 10 h-²¹.
3. להכין את כלובי רבייה.
   1. להכין כלוב עכבר נקי עם מכסה, מים, אוכל, מצעים וקינון לכל רבייה זוג.
   2. למלא את הקלפים כלוב עם כל המידע הנדרש, כולל מין, תאריך לידה, המתח העכבר ואת תאריך בעת הזדווגות מוגדר.

3. פוריות המחקר

1. לזהות את החיות כדי לשמש לחקר הפוריות. ודא כי כל בעלי החיים הם בגרו (שלב 1). טווח הגיל בדרך כלל משמש כדי להגדיר מחקר פוריות בעכברים הוא 10-16 שבועות של גיל, עידן שבו התבגרות מינית הושלמה בתנאים הכי ניסיוני.
2. על שולחן נקי, למקם את הכלוב הרבייה המבושלות 2.3 שלב.
3. לתפוס והחזק את העכבר.
   1. לאט לאט להציג יד בכפפה לתוך הכלוב העכבר. תשאיר את היד לכלוב לתקופה קצרה של זמן (s ~ 5-30), המאפשר העכברים להתאים ריח הכפפה והיד. הימנע תנועות קופצניות קדחתני.
   2. תוריד את היד היו כפות קרוב בתחתית הכלוב, לאט התקרבו אליו כדי העכברים. הם אני אברח הם עלו על היד, השמנה זנב עכבר אחד בין האגודל לאצבע.
   3. הרם את העכבר בזנב עבור s 2-3. אם העכבר צריך להיערך זמן רב יותר, להחזיק הזנב, הנח את העכבר ביד היו כפות שמירה על החסימה על הזנב.
4. להעביר 1 זכר, לאחר מכן 1 נקבה לתוך הכלוב רבייה על-ידי החזקת אותם בזנב (שלב 3.3). ודא כי הנקבות הן בשלב estrous אותו בעת הגדרת וזמינותו פוריות. לקבוע את שלב estrous של הנקבות על-ידי ביצוע כתם הנרתיק כפי שמתואר בשלב 1.7.
5. לסגור את הכלוב ולהבטיח כי העכברים יש חומר מזון, מים ומחסה. לצרף בעל הכרטיס כלוב עם הכרטיס כלוב לכלוב.
6. למקם את הכלוב רבייה על המדף דיור. להשאיר הכלוב רבייה גם ללא הפרעה ככל האפשר משך המחקר פוריות מלא. לנהל את המחקר פוריות למשך 30 יום. עבור כל זוג הרבייה, שומרים פרטים, הערה 1) תאריך שההזדווגות הוא להגדיר, 2) התאריך המלטות נולדים או 3) את מספר הגורים נולד, כולל הגורים מתים וחיים. לבצע בדיקות המלטה מדי יום לאורך כל תקופת המחקר.
7. להאריך את הפוריות מחקר עבור ימים 30-60 נוספים אם אין או השפעה חלשה על פוריות נוסדה ב- 3.6 צעד.

תוצאות

התוצאות שהוצגו מגיעים בשני דגמים שונים בעכבר הטרנסגניים איפה שעתוק מקדם הגחון הקדמי גנים homeobox 1 (Vax1) נמחקה הגוף כולו על אחד אלל, המכונים כאן heterozygote עכברים (HET)¹³, או Vax1 נמחקה מותנית בתוך GnRH נוירונים²², כאן כינה מותנה KO (cKO). לפני הגדרת המחקר פוריות, חשוב לאשר תחילת המתבגר כל בעכברים.

ראשית, היום, משקל פתח הנרתיק והפרדה preputial הוקמו. בעכברים ה...

דיון

רווחתם הכללית של העכברים הוא קריטי עבור assay פוריות מוצלחת²¹. בעת ביצוע וזמינותו של פוריות, חשוב לבדוק לא פיזית העכברים כל יום כמו זה יכול לגרום ללחץ. דרך נוספת להימנע שינויים תכופים בכלוב, כמו אלה גם מלחיץ. אידיאלי שינויים כלוב ייעשה יותר מ 1 - 2 פעמים בשבוע. לאור החשיפה במהלך שלב כהה משפיע באופן שלילי הרבייה בחולדות ליליים. לא להדליק אורות בחדר הרבייה במהלך השעות כהה. אם הכניסה לחדר נדרש במהלך השעות כהה, השתמש האור האדום העמום תאורה. עוד גורם הלחץ היא הנוכחות של ריחות מופרז, תנודות או רעש ביבר ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כדורי כותנה סטריליים	פישר	22456885
מגן משטח	פישר	1420637
מד אור	VWR	21800-014
מתילן כחול	Sigma-Aldrich	M9140
מיקרוסקופ שקופיות	Genesee Scientific	29-101
מתלה Optimouse עם כלובים	מערכות AnimalCare	C89100
סל בקבוק מים	מערכות AnimalCare	C61011
צמרות כלובים מסוננים	מערכות AnimalCare	C78210
אופטימיות מזין סטנדרטי	מערכות AnimalCare C40100SG
כלוב מחזיק כרטיסים	מערכות AnimalCare	C43251
כרטיסי כלוב	מערכות AnimalCare	M52010
בקבוק Assambley	מערכות	AnimalCare
C79122P Bed R'Nest Nesting	The Andersons	BRN4WSR
1/8 אינץ' מצעי קלחי תירס	הסטנדרטי של אנדרסון	8B
	Teklad	7904 (7004)
בקנה מידה	VWR	10205-004
פוליפרופילן	פישר	14-955-111F