הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58359

⸱

25 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Bar-Ilan University

במאמר זה

סיכום

צלחת הדמיה המבוססת על HMCA מוצג לביצועים assay הפלישה. הצלחת הזו מקלה על היווצרות הגידול תלת מימדי (3D) spheroids והמידה של סרטן תאים פלישת מטריצות (ECM). כימות assay הפלישה מושגת על ידי ניתוח חצי-אוטומטי.

תקציר

גרורות סרטן ידוע כגורם 90% של סרטן קטלני. גרורות הוא תהליך רב מדרגתיות אשר יוזם עם הפלישה/החדירה של תאים סרטניים לתוך רקמות שכנות. לפיכך, הפלישה היא שלב קריטי גרורות, שהופך את הפלישה תהליך מחקר ופיתוח של תרופות אנטי גרורתי, משמעותית ביותר. כדי לטפל דרישה זו, יש צורך לפתח מודלים 3D במבחנה אשר לחקות את הארכיטקטורה של גידולים מוצקים, microenvironment שלהם בצורה הקרובה ביותר למצב ויוו מצד אחד, אך בו זמנית להיות מתאים, חזקים הדירים תשואה גבוהה ומדידות תוכן גבוהה. כיום, רוב מבחני הפלישה להישען על טכנולוגיות מתוחכמות microfluidic אשר מתאימות למחקר, אבל לא בשביל נפח גבוה והתרופות הקרנה. מבחני אחרים באמצעות מכשירים מבוססי צלחת עם spheroids בודדים מבודדת היטב כל חומר רב, יש גודל המדגם נמוך לכל תנאי. המטרה של הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק מבוססת תא 3D ביונים פשוט וניתן לשחזור מערכת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. פיתחנו דגם תלת-ממד עבור assay הפלישה בהתבסס על צלחת הדמיה HMCA למחקר של הגידול הפלישה, גילוי תרופות אנטי גרורתי. התקן זה מאפשר הייצור של רבים spheroids אחיד לכל טוב (גודל המדגם גבוהה לכל תנאי) מוקף רכיבים ECM, תוך התבוננות ללא הרף, בו זמנית מדידה של spheroids ברזולוציה רכיב בודד בינוני הקרנת תפוקה של תרופות אנטי גרורתי. פלטפורמה זו מוצגת כאן על-ידי הייצור של הלה, MCF7 spheroids עבור המשמשים תא בודד ופלישה קולקטיבית. אנו משווים את השפעת חומצה היאלורונית רכיב ה-ECM (HA) על היכולת פולשנית של קולגן סביב הלה spheroids. בסופו של דבר, אנחנו מציגים Fisetin (מעכב הפלישה) הלה spheroids, תחמוצת החנקן (אין) (activator הפלישה) כדי MCF7 spheroids. התוצאות מנותחות על-ידי תוכנה פנימית המאפשרת ניתוח חצי אוטומטי, פשוטה ומהירה המאפשרת בדיקה multi-parameter.

מבוא

מקרי המוות מסרטן מיוחס בעיקר להפצת גרורתי לתאים מקומות מרוחקים. מאמצים רבים בטיפול בסרטן להתמקד מיקוד או מניעת היווצרות של מושבות גרורתי והתקדמות של מחלה גרורתית מערכתית1. נדידת תאים סרטן היא שלב חיוני בתהליך גרורות הגידול, לפיכך, המחקר של המפל הפלישה סרטן הוא מאוד חשוב ומפשעה תנאי הכרחי למציאת הרפוי אנטי גרורתי.

השימוש במודלים כלי לימוד במחלה גרורתית נמצאה להיות מאוד יקר, לא תמיד נציג של הגידול ב בני אדם. יתר על כן, הטופולוגיה microenvironment חוץ-תאית, מכניקה והרכב להשפיע על סרטן התא התנהגות2. מאז ויוו מודלים מטבעו חוסר היכולת להפריד בין ולשלוט פרמטרים ספציפיים כגון, אשר תורמים הפלישה סרטן, גרורות, יש צורך ביונים לשליטה במבחנה מודלים.

על מנת גרורות לאיברים מרוחקים, תאים סרטניים חייב להפגין תכונות פנוטיפי נודדות ופולשני אשר ניתן לפלח לטיפול. עם זאת, מאז רוב במבחנה הדגמים סרטן מחקה את התכונות בפועל של גידולים מוצקים3, זה מאתגר מאוד לזהות פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, הטרוגניות פנוטיפי שקיים בתוך הגידול, מכתיב את הצורך בניתוח הגידול ההעברה ברזולוציה רכיב אחד כדי לגלות מכוון פנוטיפ טיפולים, למשל, על ידי מיקוד התא. מתחילה גרורות אוכלוסייה בתוך גידולים הטרוגנית4.

המחקר של תנועתיות תאי והעברה קולקטיבית מתנהל בעיקר בתרבויות טפט של תאים אפיתל על משטחים מישוריים הומוגנית. אלה דגמי הסלולר המקובלת על נדידת תאים סרטן מבוססים על ניתוח האוכלוסייה של תאים בודדים פולשים דרך ממברנות ECM רכיבים5, אבל במערכות כאלה, לא יכול להיות הבדלים מהותיים בין תאים בודדים למד. ביצירת spheroids תלת-ממד באמצעות פיגומים או מיקרו-מבנים לגרדום ללא נחשב ממונה פירושו ללמוד את הגידול התא סרטן וצמיחה של הפלישה6,7,8. עם זאת, ביותר תלת-ממד מערכות אינם מתאימים לתבניות תפוקה גבוהה, בדרך כלל אינה יכולה להיות מושגת האינטראקציה הבין-ספרואיד מאז spheroids בודדים מבודדת נוצרים כל מיקרו-ובכן9. מחקרים שנעשו לאחרונה המערבים את ההעברה סרטן מבוססים על microfluidic התקנים3,10,11,12, אולם, אלה מתוחכמים microfluidic כלים קשה לייצר, לא ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) של תרופות אנטי-פולשנית.

שני ראשי פנוטיפים, נדידת תאים קיבוציים ואישיים, אשר ממלאים תפקיד תאים סרטניים להתגבר על המכשול ECM פולשים רקמות שכנות, כבר הפגינו13,14, כל הצגת ברורים מורפולוגי המאפיינים, מנגנונים ביוכימיים, המולקולריים והגנטיים. בנוסף, שתי צורות של העברת תאים סרטניים, כמו פיברובלסט ו- amoeboid, הם נצפו כל פנוטיפ. מאז, הפלישה פנוטיפים and מצבי העברה, בעיקר המוגדרים על-ידי מאפיינים מורפולוגיים, יש צורך הסלולר מודלים זיהוי מבוסס-הדמיה זה לזמין, בחינת כל צורות גידול הפלישה ושל העברת תאים.

המטרה הכוללת של השיטה הנוכחית היא לספק ביונים לשחזור ופשוט 3D במבחנה תא מערכת מבוססת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. כאן, אנחנו מציגים מבוסס-HMCA 6-ובכן הדמיה הצלחת עבור המחקר של הפלישה גידול וטיפול אנטי גרורתי. הטכנולוגיה מאפשרת היווצרות של מספרים גדולים של הגידול תלת-ממד אחיד spheroids (450 לכל טוב) בתוך מבנה תאי-מיקרו (MC) הידרוג. רכיבי ה-ECM שונים נוספים למערך ספרואיד כדי לאפשר את הפלישה של התאים לתוך הסביבה. הפלישה תהליך ללא הרף מנוטרת על ידי קצר - ארוכת התבוננות לאותם תאים בודדים spheroids/פולש ואסטמה ומקילה על אפיון מורפולוגי, צביעת פלורסנט ולאחזור של spheroids ספציפי בשלב כלשהו. מאז spheroids רבים חולקים חלל בינוני, אינטראקציה באמצעות מולקולות מסיסים בין הבודדים spheroids והשפעתם על אחד לשני אפשרי. ניתוח תמונות חצי אוטומטי מתבצע על ידי שימוש בקוד MATLAB שבאתר המאפשרת אוסף יעילה ומהירה של כמות גדולה של נתונים. פלטפורמת מקל מדידה מדויקים, בו זמנית של תאים spheroids/פולש רבים בצורה היעילה, המאפשר הקרנה תפוקה בינונית של תרופות נגד הפלישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. HMCA לוחית הבלטה

הערה: התהליך המלא על העיצוב ועל פבריקציה נוספת של polydimethylsiloxane (PDMS) חותמת וצלחת הדמיה HMCA בשימוש פרוטוקול זה מתואר בפירוט שלנו15,הקודם מאמרים16. חותמת PDMS (הצורה השלילית) משמש הבלטה של HMCA (צורה חיובית) אשר מורכב של MCs בערך 450 לכל טוב (איור 1 א'). כפי שמתואר ב איור 1B, כל אחד MCs יש צורה של פירמידה קטומה בצורת ריבוע הפוך (גובה: 190 מיקרומטר, באזור בסיס קטן: 90 מיקרומטר x 90 מיקרומטר, שטח הבסיס גדול: 370 מיקרומטר x 370 מיקרומטר). הצלחת HMCA משמשת עבור הכנת ו culturing של הגידול 3D spheroids לאחר מכן, הפלישה וזמינותו. לחלופין, חותמת מסחרי יכול לשמש לייצור HMCA.

  1. להכין פתרון של 6% agarose ההיתוך נמוכה (LMA). להוסיף את אבקת LMA, תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS) (0.6 גרם של LMA לכל 10 מ"ל של PBS) לתוך בקבוק זכוכית עם פגים. הניחו את הבקבוק על צלחת חימום ומערבבים את הפתרון תוך כדי חימום עד 80 ° C לכמה שעות עד פתרון אחיד מושגת. לשמור את הפתרון ב 70 ° C עד השימוש.
  2. מחממים מראש את חותמת PDMS עד 70 ° צלזיוס בתנור. לחמם אותו עד השימוש. לחלופין, השתמש חותמת מסחרי ופעל לפי ההוראה.
  3. במקום את צלחות זכוכית 6-ובכן מסחרי-התחתון על אמבט יבש מחומם מראש ל 75 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד הצלחת חם לגמרי.
  4. יוצקים טיפה (400 µL) של LMA מחומם מראש על גבי רצפת הזכוכית של כל אחד מן הבארות בצלחת. הנח בעדינות את חותמת PDMS מחומם מראש על הירידה agarose. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 – 10 דקות וקירור מראש ג'לי מראש. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להשיג agarose מלא gelation. ואז, בעדינות לקלף את PDMS, עוזב את הג'ל agarose האיאט MCs.
    הערה: שלב זה מתבצע בו זמנית ב כל הבארות.
  5. מקם את הצלחת מובלטת באור לריפוי למערך עם מנורת אולטרה סגול (UV), ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות.
    הערה: עכשיו הצלחת HMCA הוא עיקור UV.
  6. למלא את המאקרו-הבארות PBS סטרילי כדי להבטיח כי הם נשמרים לחים, ואז לכסות את הצלחת, לעטוף את זה עם מצלמות-מיקרוסקופים ואחסן אותו ב 4 ° C עד השימוש.
  7. לפני השימוש, רוקן PBS תמלוגים מהצלחת HMCA. למקם אותו בשכונה ביולוגי.

2. טעינת תאים ויצירת ספרואיד

  1. לאסוף את התאים כדלקמן: הסר בינוני כל טפט תא צלחת 10 ס מ תרבות, לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS להיפטר סרום תמלוגים, הוסף 5 מ של טריפסין (טרום התחמם עד 37 ° C), תקופת דגירה של 3 דקות בחממה ב 37 º C. לאחר מכן, לנער את הצלחת בעדינות כדי להבטיח ניתוק חד שכבתי, להוסיף 10 מ של שלם בינוני (טרום התחמם עד 37 ° C), פיפטה למעלה ולמטה עד תא הומוגנית ההשעיה מושגת. צנטריפוגה לשטוף התליה תא עם 15 מ"ל בינוני טריים ואז, להשעות בריכוזים המתאימים בינוני מלא טריים.
  2. בעדינות לטעון התליה תא (µL 50, 150 – 360 x 103 תאים למ"ל בינוני, ~ 16-40 תאים לכל MC) על גבי HMCA ולאפשר את התאים להתיישב על ידי הכבידה למשך 15 דקות.
  3. בעדינות להוסיף 6-8 aliquots µL 500 טרי בינוני (סה כ 3-4 מ"ל) בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק בחוץ הטבעת של הידרוג המערך.
  4. דגירה הלה תאים עבור 72 h ותאים MCF7 עבור h 48-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, באווירה humidified של הקמת spheroids.

3. הכדאיות זיהוי על-ידי Propidium יודיד (PI) מכתים

  1. להכין פתרון מניות של PI (500 µg של פאי לכל 1 מ"ל של PBS). לשמור את זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ- 6 חודשים. טרי להכין לדילול 1:2,000 (0.25 µg/mL), על ידי התוספת של 6 µL של מניות 12 מ של מדיום מלאה ללא פנול אדום, הצלחת HMCA 6-טוב (2 מ"ל לכל טוב).
  2. להעביר לצלחת HMCA עם 48-72 h spheroids, החממה מכסה המנוע ביולוגי. להסיר כל בינוני HMCA על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק לצד המערך הידרוג, עוזב את הטנק מערך מלא בינוני.
  3. בעדינות להוסיף מ 2 ל- PI דילול מ 3.1 שלב בכל טוב, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון פלסטיק מאקרו-. טוב. דגירה את הצלחת HMCA עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, באווירה humidified. המשך לשלב 7.
    הערה: צבעים אחרים יכול לשמש כאן גם, לדוגמה, Hoechst עבור גרעין מכתים, tetramethylrhodamine מתיל אסטר (TMRM) עבור פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מכתים, fluorescein diacetate (FDA) לגילוי תאים חיים, Annexin V עבור אפופטוזיס זיהוי ואחרים.

4. הכנת התערובת קולגן

  1. הכן סטרילי כפול מים מזוקקים (DDW) על ידי החיטוי, מלאי של 100 מ של 1 מ' NaOH מחוטא-מסנן פתרון. לשמור על החומרים RT, ועל העצות המשמש עבור הכנת התערובת קולגן קפוא ב-20 ° C, עד לשימוש.
  2. 10 – 20 דקות לפני השימוש, במקום כל intergrades כולל: DDW סטרילי, M NaOH 1 פתרון סטרילי, סטרילי 10 x PBS, מסוג קולגן זנב החולדה (מאוחסן ב 4 ° C 3-חודשים), צינור סטרילי לתוך הדלי קרח עד לגמרי מקורר. המקום דלי קרח בתוך המנוע ביולוגי.
  3. להכין µL 1,800 תערובת קולגן-ריכוז הסופי של 3 מ"ג/מ"ל, 6-ובכן HMCA הפלישה assay צלחת (300 µL לכל טוב) כפי שמוצג להלן. הוסף את intergrades לתוך הצינור מקורר לפי הסדר הבא: 515 µL של DDW, µL 24.8 של 1 M NaOH ו- 180 µL של 10 x PBS. לערבב היטב על ידי מערבולת ומקום חזרה לתוך הקרח. לבסוף להוסיף התערובת, מערבולת שוב 1080 µL של קולגן, להחזיר לתוך הקרח.

5. הא, הכנת התערובת קולגן

  1. להמיס 10 מ ג של HA ב 2 מיליליטר DDW סטרילי. דגירה התערובת ב RT במשך כמה דקות, מערבולת בעדינות עד התפרקה לחלוטין האבקה. אחסן את הפתרון מניות ב 4 ° C עד שנתיים.
  2. ממש לפני השימוש, מקום הפתרון מניות HA בדלי הקרח בתוך המנוע ביולוגי.
  3. להכין 3 מ"ג למ"ל תערובת קולגן כפי שמתואר בשלב 4. להוסיף 36 µg (7.2 µL) של HA לתוך μL 1,800 של תערובת מוכנה לשימוש קולגן, עבור ריכוז סופי של 20 µg/mL. ואז, מערבולת שוב בקצרה ולשים בחזרה לתוך הקרח.

6. תוספת ECM תערובת

  1. להעביר את הצלחת HMCA, עם 48-72 h spheroids, החממה וחטף ביולוגי ומניחים אותו על הקרח. תקופת דגירה של 10 דקות עד הצלחת הוא מקורר. מראש בחום פתרון של 1% LMA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
  2. הסר בינוני כל מ מסביב HMCA, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק לצד המערך הידרוג. . אז, בזהירות רבה, הסר בינוני כל למיכל מערך עם בסדר עצה/ג'ל טעינת עצה, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה המערך, ובאיטיות יניקה בינוני כל החוצה.
    הערה: לאחר הסרת כל האמצעי סביב המערך הידרוג, הטנק מערך עדיין מלא בינוני. בינוני יש להסיר בעדינות על מנת למנוע הרס הידרוג MC, שיבוש spheroids.
  3. לקחת 150 µL של קולגן התערובת או תערובת HA קולגן (תערובת ECM) עם קצה בסדר מראש קפואים ולהוסיף לתוך הטנק המערך על-ידי הצמדת הקצה לקצה המערך. שחרר את התערובת לאט כדי להימנע ספרואיד פריקה. חזור על צעד זה עם aliquot אחרת של 150 µL, µL 300 סה כ כל טוב. בצע את ההליך עבור כל טוב עד כל בארות מלאים. ואז למקם את הצלחת לתוך החממה עבור 1h לציון gelation המלא של ה-ECM.
  4. פיפטה לאחר gelation המלא של ה-ECM השיגה, µL 400% 1 מראש ומחוממת LMA על גבי הג'ל ECM. כיסוי לצלחת עם המכסה, דגירה לצלחת-RT למשך 5-7 דקות ולאחר מכן למשך 2 דקות ב 4 ° C, עבור agarose gelation. לבסוף, בעדינות להוסיף 2 מיליליטר בינוני מלא על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון פלסטיק מאקרו-. טוב.
    הערה: השכבה agarose מונע בניתוק של המטריקס קולגן-ג'ל מ HMCA.

7. הפלישה Assay רכישה וניתוח

  1. טען הצלחת HMCA אל ממונע הפוך הבמה מיקרוסקופ מצויד אינקובטור, להתאים מראש ל- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 והאווירה humidified.
  2. לקבוע מראש העמדות עבור רכישת התמונה בכל טוב כדי לכסות את האזור מערך שלם, ולהשתמש 10 X או מטרות X 4 (השלב זה נדרש עבור התוכנה רכישת התמונה המשמש כאן, חומרים בטבלה להלן לקבלת פרטים). לחלופין, להשתמש בכל תוכנה רכישת התמונה כדי להקל על סריקה אוטומטית של כל האזור הנדרש, על-ידי בחירה "Stich" אפשרות.
  3. לרכוש תמונות שדה בהיר (BF) כל h 2 – 4 לתקופה כוללת של 24-72 h לעקוב הפלישה של תאים מהגוף ספרואיד לתוך ה-ECM שמסביב.
  4. לרכוש תמונות פלורסנט לגילוי PI באמצעות קוביה פלורסנט ייעודי (עירור מסנן 530 – 550 ננומטר, מראה ודיקרואיק זוהר 565 nm ארוך פליטה ותעודת מסנן 600 – 660 ננומטר).
  5. ייצוא תמונות בצילום מואץ BF/פלורסנט מתוך התוכנה רכישת התמונה ולשמור אותם בתבנית קובץ (TIFF) של תמונות מתויגות לתיקיה ייעודית באמצעות הכרטיסייה "מסד נתונים" הכלים, ולאחר מכן על הלחצן "ייצוא רשום קבצים" .
    הערה: פיתחנו קוד מיוחד ניתוח ללא צורך במיקור חוץ בתוכנת MATLAB הכוללת ממשק משתמש גרפי מעוצב (GUI) באילו הפלישה ניתוח יכול להתבצע ביתר מהירות וקלות. קוד זה ניתוח, פילוח של spheroids, באזור הפלישה נעשית באופן אוטומטי למחצה באמצעות מסנן סובול ואחריו באופרטורים מורפולוגיים שחיקה, התארכות. לאחר פילוח אוטומטי של האזורים, נעשו תיקונים ידניים במידת הצורך על דיוק טוב יותר. לאחר השלמת פילוח, סט של פרמטרים היו באופן אוטומטי המחושב על-ידי התוכנה, מיוצאים לקובץ excel עבור מניפולציה נוספת. רשימת הפרמטרים הם: אזור סקציות ספרואיד בסיסיים בזמן = 0, הפלישה אזור של תאים מחוברת לגוף ספרואיד = הפלישה הראשי לאזור, אזור של תאים מופרדים מאזור הפלישה הראשי, מספר התאים מופרדים מאזור הפלישה הראשי, המרחק הממוצע של הפלישה מן ספרואיד בסיסי אל מרכז המסה על ההיקף של הפלישה הראשי באזור, תאים מופרדים הפלישה קולקטיבית מרחק פרמטר = d (d = כהן ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) מתוך קואורדינטות X ו- Y ספרואיד מרכז מסה, לפני (X1, Y1) ואחרי (X2, Y2) תהליך הפלישה קולקטיבית). לחלופין, ניתוח תמונות יכולה להתבצע עם תוכנות מיוחדות אחרות.
  6. פתח GUI, לחצו על הכפתור "טען BF" . לאחר שהתמונה פתוח, להתאים את הפרמטרים פילוח (גודל מינימלי: > 1 וסגור רדיוס: > 1) כדי להשיג של פילוח מדויק של ספרואיד ואזור הפלישה שלה, ולאחר מכן, לחץ לחצן "אזור של הריבית (ROI) פילוח" לביצוע, גבול יופיעו סביב כל ספרואיד. אם פילוח אוטומטית שגוי, לחצו על כפתור "מחק" או "להוסיף" ולעשות את התיקונים המבוקשים באופן ידני. חזור על הפעולות עבור תמונות עוקבות.
  7. לחץ על לחצן "מעקב" כדי למספר את spheroids ותקצה התוכנה מספר זהה עבור כל ספרואיד בכל אחת מהתמונות זמן לשגות. לאחר מכן, לחץ על לחצן "מדידה" , אשר תיצור גיליון אלקטרוני עם כל הפרמטרים. שמור גיליון אלקטרוני זה כקובץ excel עבור שימוש נוסף עיבוד תוצאות וסטטיסטיקות בתוכנת excel.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

HMCA ייחודי הדמיה לצלחת משמש וזמינותו הפלישה של הגידול 3D spheroids. וזמינותו כולו, החל עם הקמתה ספרואיד וכלה עם הפלישה תהליך, מניפולציות נוספות, מבוצע בתוך באותה הצלחת. על היווצרות ספרואיד, הלה תאים מוטענים לתוך האגן מערך ולהתיישב בארץ את הידרוג MCs על ידי הכבידה. הידרוג MCs, אשר יש מאפייני קובץ מצורף ללא-חסיד/נמוך, להקל על האינטראקציה תא התא ואת היווצרות הגידול 3D spheroids. איור 2A ממחיש את התאים התיישבו MCs, בעקבות השימוש 150 x 103 תאים למ"ל טע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זה מתועד היטב כי היצורים החיים, מאופיין על ידי הארגון multicellular תלת-ממדיים מורכבים שלהם הם ברורים למדי את התאים נפוץ טפט 2D תרבותי, תוך הדגשת הצורך קריטי להשתמש דגמי הסלולר אשר כדאי לחקות את הפונקציות . וסינון תהליכים של האורגניזם החי על סמים. לאחרונה, multicellular spheroids, תרבויות organotypic, organoids, איברים-על-שבב כבר הציג8 עבור השימוש בגילוי תרופות סטנדרטית. עם זאת, מהמורכבות הרבה של הדגם multicellular 3D מסכנת באופן משמעותי, parallelization בחוסנו ניתוח נתונים אשר הם קריטיים ליעילות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי עזבון משה שמעון, ג'ודית Weisbrodt.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6 צלחות תחתונות זכוכית מיקרו-באר עם מיקרו-באר 14 מ"מ #1.5 כיסוי זכוכיתCellvisP06-14-1.5-Nצלחות תחתונות זכוכית מסחריות המשמשות להבלטת HMCA
נקודת התכה נמוכה UltraPureAgarose Invitrogen16520100 תמיסה של 6% אגרוז מחוממת עד 80 מעלות; C לפני השימוש, תמיסה של 1% אגרוז מחוממת ל -37 מעלות; C
טריפסין EDTA פתרון Bתעשיות ביולוגיות03-052-1Aהתחמם ל-37 מעלות; C לפני השימוש
DMEM בינוני, גלוקוז גבוהתעשיות ביולוגיות01-055-1Aמחומם ל-37 מעלות; C לפני השימוש
סרום מיוחד לעגלים ליילוד (NBCS)תעשיות ביולוגיות04-122-1Aמומת בחום
(10x), ללא סידן, ללא מגנזיוםתעשיות ביולוגיות02-023-5Aנשמר על קרח לפני השימוש
NaOH,סיגמא-אולדריץ'S5881-500Gמשמש להכנת תמיסת NaOH 1 M
קולגן קולטרקס סוג I מזנב חולדה, 5 מ"ג/מ"לטרוויגן3440-100-01נשמר על קרח לפני השימוש
חומצה היאלורונית מלח נתרןסיגמא-אולדריץH5542-10MGנשמר על קרח לפני השימוש
פיסטיןסיגמא-אולדריץ'F505-100MGנוסף למדיום התרבית, מעכב פלישה
DETA/NOEnzo Life Sciencesalx-430-014-m005נוסף למדיום התרבית, תורם תחמוצת החנקן
PISigma-AldrichP4170משמש בריכוז נמוך מאוד ללא צורך בשטיפת
Dymax 5000-EC UV מנורת הצפה מערכת שלמה עם מגן אור & ספק כוח Dymax 400 וואט ECDymax CorporationPN 39823משמש לעיקור צלחות HMCA על ידי
מיקרוסקופ IX81 הפוךUV אולימפוסמשמש לרכישת תמונות אוטומטית
חממה למיקרוסקופשירותיחיוניים לניסויי זמן-lapse עם רכישת תמונה, מותאמים מראש ל-37 מעלות; C, 5% CO2 ושמירה על אווירה לחה
תת מיקרון ממונע שלב מסוג SCAN-IMMarzhauser Wetzlar GmbHמשמש לקביעה מראש של אזורי רכישת תמונה, לרכישת תמונה אוטומטית
14 סיביות, ORCA II C4742-98 מצלמה מקוררתHamamatsu Photonicsרגיש מאוד, משמש להדמיה
קוביית מסנן פלורסנט לזיהוי PIChroma Technology Corporationמפרט קוביות מסנן: מסנן עירור 530-550 ננומטר, מראה דיכרואית 565 ננומטר מעבר ארוך ומסנן פליטה 600-660 ננומטר
תוכנת ההפעלה Olympus Cell^Pאולימפוסהמשמשת לשליטה במיקרוסקופ, במה ממונעת, רכישת מצלמה ותמונה
תוכנת ניתוח Matlab R2014BMathworksמשמשת לפיתוח ממשק משתמש גרפי בבית לניתוח
תמונות תוכנת Excelמיקרוסופטמשמש לניהול נתונים, חישוב, יצירת מגרשים וסטטיסטיקה
DPBS נטול מים ' הדמיית חיים תוכנת

מקורות

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33(2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29(2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

יצירת ספרואידים של גידולניתוח המטריצה החוץ-תאיתהשפעת חומצה היאלורוניתטיפול בפיזטיןהפעלת חנקה חמצניתדימות במעקב זמני (Time-lapse)רזולוציית רכיב בודד
ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.