מאמר שיטה

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

DOI:

10.3791/58386

⸱

4 באוקטובר 2018

1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתות התא סוטה משחקת תפקיד מרכזי סרטן התפתחות והתקדמות. טיפולים ממוקדים ביותר הרומן מכוונים אכן חלבונים ופונקציות חלבון, שיבושים איתות התא עשוי לשמש לכן סמנים כדי לציין אפשרויות טיפול אישי. לעומת ניתוח DNA ו- RNA, שינויים בפעילות חלבון יכול להעריך בצורה יעילה יותר את המנגנונים שבבסיס תרופות רגישות והתנגדות. Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה המודד אירועים זירחון חלבונים ברמה התאית, תכונה חשובה שמבדיל שיטה זו לבין גישות אחרות נוגדן מבוסס. השיטה מאפשרת ניתוח בו זמנית של מספר חלבונים איתות. בשילוב עם פלורסנט תא barcoding, ניתן לרכוש גדול בינוני - כדי בתפוקה גבוהה-ערכות נתונים על-ידי cytometer סטנדרטי חומרה תוך זמן קצר. Cytometry זרימה פוספו יש יישומים בלימודי ביולוגיה בסיסית והן במחקר קליני, כולל מערכת אזעקה ניתוח, סמן גילוי והערכה של pharmacodynamics. כאן, פרוטוקול נסיוני מפורט מסופק עבור ניתוח תזרים פוספו תאי תאי דם היקפיים מטוהרים, תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית כדוגמא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometry זרימה פוספו משמש כדי לנתח את רמות זרחון החלבון ברזולוציה תא בודד. המטרה הכוללת של השיטה הוא למפות את דפוסי איתות סלולרי בתנאים שצוינו. על ידי ניצול הקיבולת multiparameter של cytometry זרימה, מספר איתות המסלולים ניתן לנתח בו-זמנית בקבוצות משנה שונות של אוכלוסיה הטרוגנית התא כגון דם היקפיים. תכונות אלה מציעות יתרונות אחרים נוגדן מבוססי טכנולוגיות כגון אימונוהיסטוכימיה, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), מערך חלבון שלב הפוכה חלבון מערך (RPPA)1. ניתן לשלב cytometry זרימה פוספו barcoding תא פלורסנט (FCB), מה שאומר כי דגימות תאים בודדים מסומנות עם חתימות ייחודיות של צבעי פלורסנט כך שהם יכולים להיות מעורבבים יחד, צבעונית נותחו מדגם יחיד2. זה מפחית את צריכת נוגדן, מגביר את החוסן נתונים באמצעות השילוב של שליטה ושל דגימות שטופלו ומגביר את המהירות של רכישה. האוכלוסיה FCB יכול להיות לאחר מכן לחלק דוגמיות קטנות יותר, צבעונית עם נוגדנים ספציפיים פוספו ברורים עד 35, בהתאם לכמות החומר מתחיל. ניסויים פרופיל גדולה, ובכך, ניתן להפעיל עם חומרה cytometer רגיל. Cytometry זרימה פוספו הוחלה על פרופיל איתות המסלולים בדגימות החולה של מספר סוגי סרטן hematological, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL)3,4,5, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) 6 ו שאינה הודג'קין לימפומה7. Cytometry זרימה פוספו היא לפיכך בגישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

. הנה, פרוטוקול ממוטב עבור ניתוח של CLL דגימות מטופלים על ידי פוספו cytometry זרימה מסופק (איור 1 א'). דוגמאות של אפיון איתות הבזליים, אנטי-IgM/B תא קולטן לגירוי סמים ההפרעות מוצגים. תיאור מפורט של מטריקס FCB מסופק. הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים ההשעיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות דם התקבלו בעקבות בכתב הסכמה מדעת מתורמים כל. המחקר היה מאושר על ידי הועדה המחוזית הרפואי, בריאות מחקר אתיקה של דרום-מזרח נורבגיה, המחקר דם אדם היתה מתבצעת על פי הצהרת הלסינקי8.

הערה: שלבים 1-3 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.

1. בידוד של תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) של דגימות דם החולה CLL

התראה: דם אנושי צריך להיות מטופל על פי תקנות אבטחה ברמה 2.

  1. לדלל את הדם 1:1 עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS: 136.9 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10.1 מ מ נה2HPO4 x 2 H2O, מ מ 1.8 ח'2PO4, pH 7.4), העברת צינורות 50 מ ל (30 מ ל/צינור).
  2. בזהירות שכבה 10 מ"ל של דחיסות צבע בינוני (למשל, Lymphoprep) לתחתית הצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 º C. PBMCs גלויים כעת על גבי השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית.
  4. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את התאים לתוך שני צינורות 50 מ ל חדש. לשטוף פעמיים עם PBS (מילוי את הצינורות).
  5. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend ב 3 מ"ל של PBS.
  6. לספור את התאים בשיטה המועדפת.
  7. Centrifuge התאים ב 350 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע. הערה: צעדים 1.8 ל 3.2 הן אופציונליות. זה אפשרי להמשיך ישירות אל שלב 3.3.
  8. Resuspend את התאים העובריים בסרום שור (FBS) בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ומקפיאים למטה ב- aliquots מתאים באמצעות צינורות הקפאה.
    הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר. ברגע התאים מעורבבים עם FBS/דימתיל סולפוקסיד. התאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך חנקן נוזלי.

2. הפשרתו של תאים

  1. במהירות להפשיר את התאים בתוך אמבט מים 37 º C.
    הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר כדי להגביל את החשיפה דימתיל סולפוקסיד.
  2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של מדיום רוזוול פארק אנדרטת מכון קר (1640 RPMI עם GlutaMAX משלימה, ראה טבלה של חומרים).
  3. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend התאים RPMI 1640 בינוני עם נתרן פירובט, חומצות אמינו MEM שאינם חיוניים, פניצילין/סטרפטומיצין (נוסף ב- 1 x דילול בהתאם להוראות), 10% FBS. העבר את התאים בקבוקון התרבות תאים קטנים ולהשאיר באינקובטור ב- 5% CO2, 37 º C למשך שעה לאפשר את התאים לכיול.

3. הכנה של תאים

  1. לספור את התאים קיימא באמצעות שיטה מועדפת.
  2. להעביר את התאים שפופרת 50 מ ל וזורקים צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  3. Resuspend תאי RPMI 1640 בינוני (שלב 2.2) בתוספת 1% FBS לא יותר מ 50 x 106 תאים/מ ל....
  4. להעביר את הסכום הנדרש של השעיה תא בארות בצלחת V-התחתון טוב 96.
    הערה: מספר בארות מקביל מספר תנאים כדי להיבדק. דוגמאות עבור זמן-קורס גירוי נמשכים מבאר יחיד. חישוב מדגם µL 50 לכל נקודת זמן + 50 µL נפח מת. לשמור את דוגמאות לפקדים פיצוי (דוגמא אחת וללא רבב + דוגמא אחת לכל barcoding צבע).
  5. להעביר את הצלחת היטב 96 באמבט מים מחומם מראש-37 מעלות צלזיוס. שאר התאים למשך 10 דקות.

4. גירוי, קיבוע תאים

הערה: בצע שלבים 4-8 על הספסל מעבדה (קרי, לא סטרילי).

התראה: המרכיב העיקרי של מאגר לתקן אני הוא paraformaldehyde, אשר הוא רעיל (שאיפת והעור קשר). . לטפל.

  1. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם 60 µL לתקן את המאגר אני לכל טוב עבור דגימה. יוצאים באמבט מים 37 º C.
    הערה: תאים: מאגר תיקון צריך להיות 1:1. על מנת לאפשר אידוי ב 37 מעלות צלזיוס, המאגר תיקון יש בתחילה בשפע.
  2. באופן אופציונלי, פנקו את התאים עם סמים לפני גירוי.
  3. דגימת הבקרה 50 µL להעביר הצלחת לתקן. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. באופן אופציונלי, להתחיל המסלול-הזמן גירוי על-ידי הוספת 10 µg/mL אנטי-IgM לתאים. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  5. העברה מדגם µL 50 הצלחת לתקן בכל זמן-נקודה. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    הערה: אנטי-IgM המושרה איתות בדרך כלל מתחילה מוקדם (דקות).
  6. להשאיר את הצלחת תיקון 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר הדגימה האחרונה נוספה.

5. פלורסנט תא Barcoding (FCB)

הערה: לקבלת רשימה של barcoding ריאגנטים, ראה טבלה 1 .

  1. לשטוף את התאים קבוע 3 x עם PBS (למלא בהם הבארות).
  2. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  3. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם ריאגנטים barcoding. Pipet 5 µL של כל ריאגנט barcoding לכל טוב במספר שילובים הנדרש כדי להכתים את כל הדגימות בעקבות המטריצה מוכתמים, למשל, באיור 1B. כל מדגם יהיה שילוב ייחודי של ריכוזים barcoding שונים.
  4. Resuspend תאי µL 190 של PBS ולהעביר לצלחת barcoding. מערבבים ביסודיות.
    הערה: כתם אחד פיצויים לדוגמה עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר המשמש עבור כל ריאגנט barcoding ולשמור על דוגמא אחת וללא רבב.
  5. להשאיר את התאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
  6. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם שטיפת זרימה (PBS, 1% FBS, אזיד הנתרן 0.09%) (למלא את הבארות).
  7. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  8. להוסיף µL 190 של זרימה שטיפת התאים ולשלב את הדגימות לבר-קוד בשפופרת אחת 15 מ"ל. העברת כל פקד פיצוי צינור mL 1.7 נפרדים.
  9. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.

6. תא Permeabilization עבור צביעת אנטיגן תאיים

התראה: המרכיב העיקרי של פרם מאגר השלישי הוא מתנול רעיל (שאיפת והעור קשר) וזה דליק. . לטפל.

  1. 2 מ"ל של פרם מאגר השלישי להעביר צינור 15 מ"ל. יוצאים ב-20 ° C, אז זה קרה כקרח על השימוש.
    הערה: ניתן יהיה להשאיר את המאגר פרם ב-20 ° C מתחילת הניסוי.
  2. להוסיף 1.5 mL המאגר הקר פרם באוכלוסייה תא לבר-קוד (בשפופרת 15 מ"ל) ו- 100 µL לכל פקד פיצויים (ב מ ל 1.7 צינורות) drop-wise בעת vortexing כדי למנוע התאים להתאחד.
  3. העבר את התאים ישירות ל-80 מעלות צלזיוס. להשאיר מינימום של 30 דקות.
    הערה: זה טבעי כדי להשהות את הניסוי בשלב זה. תאים במאגר פרם יכול להיות מאוחסנת לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס.

7. נוגדן מכתים

הערה: ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים ספציפיים פוספו המדווחת.

  1. העבר את התאים מ-80 מעלות צלזיוס קופסה של קרח.
  2. לשטוף 3 x עם זרימה לשטוף.
    הערה: זה חשוב להוסיף זרימת שטיפת עודף לראות בגדר תא, למשל, להוסיף 3 מ"ל של שטיפת זרימה באוכלוסייה תא לבר-קוד ו- 1 מ"ל כל פקד פיצוי.
  3. צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend האוכלוסייה תא לבר-קוד באמצעי אחסון של שטיפת זרימה, אשר מאפשר µL 25 של השעיה תא לכל כתם פוספו-נוגדן. Resuspend את הפקדים פיצוי ב 200 µL של זרימה לשטוף.
  5. להכין נוגדנים מכתים בצלחת V-התחתון טוב 96. עוצמת הקול הסופי יהיה µL 50/טוב. לכל טוב, מוסיפים נוגדן ספציפי פוספו מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של µL 10, סמן משטח מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של 15 µL, 25 µL של התא השעיה.
    הערה: נוגדן דילולים, צריך להיות טיטרציה לפני הניסוי. כוללים שליטה isotype.
  6. להשאיר את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
  7. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם זרימה השטיפה (למלא בהם הבארות).
  8. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  9. Resuspend תאי µL 150 של זרימה לשטוף.

8. הכנת פיצוי שולט

  1. היכונו פקדים פיצוי fluorochromes מצומדת נוגדנים במקביל ההכתמה נוגדן. השתמש חרוזים פיצוי לפי הוראות הספק.

9. לזרום Cytometry ניתוח

הערה: הניסוי ניתן להפעיל על cytometer של זרימה עם גבוהה תפוקה סמפלר (HTS).

  1. למטב את המתח צינור (PMT) האופטיקה עם הפקד וללא רבב.
  2. להפעיל פקדי פיצוי ולחשב את המטריקס פיצוי.
  3. הפעל את הדגימות. הקצב אירוע צריך להיות בהתאם למפרטים כלי.

10. gating אסטרטגיה וניתוח נתונים

  1. לייבא את הקבצים FCS מהניסוי לתוכנת ניתוח cytometry זרימה כמו FlowJo או Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
  2. אסטרטגיה חסימה
    1. בחר לימפוציטים על ידי התוויית האס-A לעומת FSC-A במגרש נקודה צפיפות.
    2. להציג לימפוציטים ולבחור ללבישה על ידי האס-A לעומת FSC -ו
    3. להציג את תאים בודדים ושער התא להקליד על-ידי התוויית האס-A נגד דה מרקר משטח.
    4. להציג את האוכלוסייה סוג התא פסיפיק בלו לעומת צפיפות האס-A מגרש ובחר האוכלוסיה FCB השונות בהתבסס על שלהם פסיפיק בלו מכתים בעוצמה (ראה איור 1 א').
    5. מגרש בערוץ נוגדן פוספו נגד הערוץ FCB, או כמו של heatmap (ראה איור 1A) כדי להציג את האירועים זירחון.
  3. לחשב באמצעות הסינוס ההיפרבולי ההופכי (arcsinh) של MFI (חציון פלורסנט בעוצמה) השליטה isotype ' פוספו-האות לעומת פוספו-אותות (רמות זרחון הבזליים, ראה איור 1D), או של מגורה לעומת אוכלוסיות תאים unstimulated (ראה איור 1E).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים העיקריים של פרוטוקול cytometry זרימה פוספו מומחשים איור 1A. בדוגמה שהוצגו, תאים CLL היו מוכתמים הכימית barcoding פסיפיק בלו-דילולים ארבע. Barcoding תלת מימדי יכול להתבצע על-ידי שילוב שלושה צבעים barcoding, כמופיע ב איור 1B. הדגימות בודדים הם deconvoluted אז על ידי gating הבאים על כל barcoding ריאגנט נגד האס-A (איור 1C). מידע מפורט אודות ריאגנטים barcoding מפורטים בטבלה 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה כדי למדוד רמות זרחון החלבון בתאים בודדים. מאז השיטה מסתמכת על צביעת עם נוגדנים, cytometry זרימה פוספו מוגבל על ידי נוגדנים זמינות. יתר על כן, על מנת לקבל תוצאות אמינות, לכל הנוגדנים צריך להיות טיטרציה ונבדקה לפני השימוש. פרוטוקול מפורט עבור טיטור של נוגדנים ספציפיים פוספו כבר תיאר במקום12. במהלך עיצוב לוח, שיקול של יחס אות לרעש היא קריטית. בדוגמה שהוצגו, כל פוספו-נוגדנים היו מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647. Fluorophore הזה לעיתים קרובות מספק ההפרש אופטימלי ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נערך במעבדה של פרופסור קייטיל Taskén, נתמכה על ידי החברה לסרטן נורווגית Stiftelsen כריסטיאן גרהרד Jebsen. יוהנס לאנדסקרון, מריאן Enger הם הכירו לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010מדיום תרבית תאים
סרום בקר עובריThermoFisher Scientific10270169תוסף למדיום תרבית תאים
נתרן פירובטThermoFisher Scientific11360-039תוסף למדיום תרבית תאים
MEM חומצות אמינו לא חיוניותThermoFisher Scientific11140-035תוסף למדיום תרבית תאים
LymphoprepAlere Technologies ASמדיוםשיפוע צפיפות
1114547 Anti-IgMSouthern Biotech2022-01לגירוי קולטן תאי B
BD Phosflow Fix Buffer IBD557870מאגר קיבוע
BD Phosflow Perm Buffer IIIBD558050מאגר פרמביליזציה
Alexa Fluor 488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005מגיב ברקוד
פסיפיק כחול Succinimidyl EsterThermoFisher ScientificP10163מגיב ברקוד
פסיפיק תפוז Succinimidyl Ester, מלח טריאתילאמוניוםThermoFisher ScientificP30253מגיב ברקוד
חרוזי פיצוימוגדר על ידי משתמשמינים נכונים תגובתיות
שפופרות פלקוןמוגדרות על ידי משתמש
צינורות אפנדורףמוגדרות על ידי משתמש
96 באר צלחות V-תחתונותמוגדרות על ידי משתמשתואמות לצנטריפוגות ציטומטר זרימה
מוגדרות על ידי משתמשעבור צינורות אפנדורף, צינורות פלקון וצלחות
אמבט מיםמוגדר על ידי משתמשטמפרטורה מווסתת
זרימה ציטומטרמוגדר על ידי משתמשעם דגימת תפוקה גבוהה (HTS)
שםחברהמספר קטלוגיהערות
< חזק>אנטיגן
AKT (pS473)טכנולוגיות איתות תאים4075<חזק>שיבוט: D9E
<חזק>התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים;, המטולוגיקה, 101(2):e59-62
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)Santa Cruz Biotechnologysc-8398Clone: F-1
התייחסות: Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)בקטון דיקינסון פארמינגן558443<חזק>שיבוט: J117-1278
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים;, Haematologica, 101(2):e59-62
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/ITK (pY180)בקטון דיקינסון פארמינגן564846<חזק>שיבוט: N35-86
<חזק>התייחסות: Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770
Btk (pY551)בקטון דיקינסון פארמינגן558129<חזק>שיבוט: 24a/BTK (Y551) 
התייחסות: Kalland et al., 2012, Modulation of Proximal Signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)BecktonDickinson Pharmingen558134clone: 24a/BTK (Y551) 
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (עמ' 142)בקטון דיקינסון פארמינגן558489clone: K25-407.69
התייחסות: Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)Cell Signaling Technologies9716Clone: D2C8
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Iκ B&אלפא;טכנולוגיות איתות תאים5743<חזק>שיבוט: L35A5
<חזק>התייחסות: Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B in…, דם, 129(6): 759-770
LAT (pY171)בקטון דיקינסון פארמינגן558518<חזק>שיבוט: I58-1169
<חזק>התייחסות: Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)בקטון דיקינסון פארמינגן558577<חזק>שיבוט: 4/LCK-Y505 
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו>., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)בקטון דיקינסון פארמינגן560043<חזק>שיבוט: J114-64
<חזקהתייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו- CD28…, Biochem J, 460(3): 399-410
NF-κ B p65 (pS529)בקטון דיקינסון פארמינגן558422<חזק>שיבוט: K10-895.12.50
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κ B p65 (pS536)טכנולוגיות איתות תאים4887<חזק>שיבוט: 93H1
<חזק>התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו- CD28…, Biochem J, 460 (3): 399-410
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה…, Exp Cell Res, 318 (14): 1611-9
p38 MAPK (pT180 / Y182)טכנולוגיות איתות תאים4552<חזק>שיבוט: < / חזק> 28B10
<חזק>התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)Cell Signaling Technologies4375Clone: E10
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול מפחיתים…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)טכנולוגיות איתות תאיםNN<חזק>שיבוט: 16G8
<חזק>התייחסות: אירית ואחרים, 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2;, דם, 109(6):2589-96
p53 (pS20)טכנולוגיות איתות תאיםNNclone: Polyclonal
התייחסות: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 שכפול וביטוי יתר של Bcl-2 …, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
התייחסות: Irish et al., 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2…, דם, 109(6):2589-96
p53 (pS46)טכנולוגיות איתות תאיםNN<חזק>שיבוט: פוליקלונלי
<חזק>התייחסות: אירית ואחרים, 2007, שכפול Flt3 Y591 וביטוי יתר של Bcl-2…, דם, 109(6):2589-96
p53 (pS392)טכנולוגיות איתות תאיםNNclone: Polyclonal
התייחסות: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 שכפול וביטוי יתר של Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ 2 (pY759)בקטון דיקינסון פארמינגן558498<חזק>שיבוט: K86-689.37
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)בקטון דיקינסון פארמינגן558590<חזק>שיבוט: J112-906
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)טכנולוגיות איתות תאים4851<חזק>שיבוט: D57.2.2E
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)טכנולוגיות איתות תאים9257<חזק>שיבוט: G9
<חזק>התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו-ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 מניע אנדותל פרו-דלקתי;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)בקטון דיקינסון פארמינגן558438<חזק>שיבוט: J141-668.36.58 
הפניה: Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)בקטון דיקינסון פארמינגן612597<חזק>שיבוט: 4a 
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)בקטון דיקינסון פארמינגן557815<חזק>שיבוט: 4/P-STAT3
<חזק>התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו>., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)Zymed/ThermoFisher Scientific71-7900Clone: Polyclonal
Uzel et al., 2001, איתור STAT-4 זרחני תוך תאי על ידי ציטומטריית זרימה, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)בקטון דיקינסון פארמינגן612599<חזק>שיבוט: 47/Stat5(pY694)
התייחסות: Myhrvold et al., 2018, פרופיל תאים בודדים של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T באמצעות CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)בקטון דיקינסון פארמינגן612601<חזק>שיבוט: 18/P-Stat6
התייחסות: < / חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות פוספו-חלבון ב.., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284
SYK (pY525 / Y526)טכנולוגיות איתות תאים12081<חזק>שיבוט: < / חזק> C87C1
<חזק>התייחסות: < / חזק> Myhrvold et al., 2018, פרופיל תא בודד של רמות חלבון פוספו ב.., Oncotarget, 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, מעכבי טירוזין קינאז טחול reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)בקטון דיקינסון פארמינגן557817<חזק>שיבוט: 17A/P-ZAP70
<חזק>התייחסות: Skå nland et al., 2014, גירוי משותף של תאי T דרך CD2 ו-CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, אפנון של איתות פרוקסימלי בנורמלי וטרנספורמציה;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, דפוסים מובהקים של איתות קולטני תאי B ב…, דם, 129(6): 759-770

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
  2. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  3. Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
  4. Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
  5. Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478(2012).
  6. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  7. Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
  8. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  9. Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
  10. Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
  11. Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).
  12. Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
  13. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  14. Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
  15. Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
  16. Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
  17. Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).
  18. Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).
  19. Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Phospho Flow CytometryFluorescent Cell BarcodingSingle Cell SignalingBiomarker DiscoveryPeripheral Blood Mononuclear CellsChronic Lymphocytic LeukemiaFlow Cytometry AnalysisCell StimulationAntibody StainingData Acquisition

מאמרים קשורים