הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58389

⸱

25 במרץ 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

במאמר זה

סיכום

סרטן השחלות טפסים גרורות לאורך כל חלל הצפק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך, שימוש חומצה פולית-קולטן ממוקד תהודה משופרת משטח nanoprobes פיזור ראמאן לגלות נגעים עם ירידה לפרטים גבוהה באמצעות הדמיה רציומטרי. Nanoprobes מנוהלים intraperitoneally חי לעכברים, הדימויים נגזר לתאם עם היסטולוגיה.

תקציר

סרטן השחלות מייצג הגידול גניקולוגיות הקטלני ביותר. רוב החולים להציג בשלב מתקדם (פיגו שלב III או IV), כאשר מקומית גרורתי מורחים כבר התרחשה. עם זאת, סרטן השחלות יש תבנית ייחודית של התפשטות גרורתית, כי שתלים גידול נכללות בתחילה חלל הצפק. תכונה זו עלולה לאפשר, עקרונית, על כריתה מלאה של הגידול שתלים עם כוונת המרפא. רבים נגעים גרורתי הם מיקרוסקופיים, שהופך אותם קשה לזהות ולטפל. נטרול micrometastases כזה הוא האמין להיות יעד מרכזי לקראת חיסול הישנות הגידול ולהשיג ההישרדות לטווח ארוך. ראמאן הדמיה עם משטח תהודה משופרת nanoprobes פיזור ראמאן ניתן להתוות מיקרוסקופיים גידולים עם רגישות גבוהה, בשל שלהם בהיר, חתימות ספקטרליות bioorthogonal. כאן, אנו מתארים את הסינתזה של שני 'טעמים' של nanoprobes כזה: סטריאוטיפ functionalized-נוגדן שמכוונת את הקולטן חומצה פולית – overexpressed בסרטן השחלות רבים — ואת nanoprobe של שליטה שאינן ממוקדות, עם ספקטרה ברורים. Nanoprobes הם שיתוף בניהול intraperitoneally את העכבר דגמי גרורתי אדנוקרצינומה השחלות אנושי. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ממוריאל סלואן קטרינג במרכז לחקר הסרטן. חלל הצפק החיות בניתוח חשוף, שטף, סריקה עם microphotospectrometer ראמאן. לאחר מכן, החתימות ראמאן של nanoprobes שני decoupled שימוש באלגוריתם התאמת הריבועים הפחותים קלאסית, ציוני הקבלה שלהם בהתאמה לחלק לספק אות רציומטרי של חומצה פולית, ממוקדות על הגששים untargeted. בדרך זו, גרורות מיקרוסקופיות הם דמיינו עם ירידה לפרטים גבוה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא כי יישום מקומי לתוך חלל הצפק — אשר יכול להיעשות באופן נוח במהלך הליך כירורגי — ניתן לתייג גידולים בלי החולה לחשיפה nanoparticle מערכתית. חיובי כוזב אותות הנובעות שאינם ספציפיים עקידת nanoprobes על גבי משטחים הקרביים ניתן לסלק על-ידי ביצוע בגישה רציומטרי שבו מוחלות nanoprobes לסריקה והתיקיות שאינן ממוקדות עם חתימות ראמאן ברורים כמו תערובת. ההליך כיום עדיין מוגבל על ידי חוסר ראמאן רחב-שדה מסחרי מערכת המצלמה, שיאפשר פעם זמין עבור היישום של טכניקה זו בתיאטרון ההפעלה הדמיה.

מבוא

ראמאן הדמיה עם 'פיזור ראמאן משופרת משטח' חלקיקים (SERS) הראו הבטחה גדולה ב בהתוויית נגעים במגוון של הגדרות וסוגי לגידול שונים רבים1,2,3,4 . היתרון העיקרי של חלקיקים SERS היא חתימה ספקטרלי שלהם, כמו טביעות אצבע, מנקר אותם unquestionable זיהוי זה הוא לא מבולבל על ידי הרקע הביולוגי אותות5. בנוסף, עוצמת האות הנפלט עוד יותר מוגבר עם השימוש של מולקולות כתב (צבעים) עם ספיגת maxima בקנה אחד עם הלייזר עירור, והוליד "פיזור משופר משטח תהודה ראמאן" (SERRS) חלקיקים עם אפילו יותר רגישות6,7,8,9,10,11,12.

מכשול אחד צריך לטפל עבור האימוץ של חלקיקים SE(R)RS13 ו רבים אחרים nanoparticle בונה14,15 לשימוש קליני הוא שלהם במצב של הממשל, כפי לעירוי הזרקה גורמת מערכתית חשיפת הסוכן, ולא מחייבת בדיקות מקיפות כדי לא לכלול תופעות לוואי אפשריות. במאמר זה, אנו מציגים פרדיגמה שונה המבוססת על היישום של חלקיקים באופן מקומי ויוו, ישירות לתוך חלל הצפק במהלך הניתוח, ואחריו צעד כביסה כדי להסיר את כל חלקיקי לא מאוגדת1. גישה זו עולה בקנה אחד עם רומן גישות טיפוליות הנמצאות תחת חקירה גם שימוש מקומי החדרה של סוכנים לתוך חלל הצפק, נקרא כימותרפיה מחוממת בקרום הבטן (HIPEC). לכן, העיקרון עצמו צריך להיות קל יחסית לשלב לתוך זרימת עבודה קלינית. חקרו את biodistribution של חלקיקים לאחר היישום בקרום הבטן, ואנו לא מקיימות בכל ספיגתו מחזור מערכתי1לזיהוי. בנוסף, הגישה יישום מקומי עוקף את פחמיות של חלקיקים על ידי מערכת reticuloendothelial, כך המספרים של חלקיקים נדרש מופחתים בצורה ניכרת. עם זאת, כאשר למריחה על העור, חלקיקים functionalized-נוגדן נוטים לדבוק על כל אחד מהמשטחים הקרביים אפילו בהיעדר המטרה שלהם. על מנת למזער את אותות חיובי כוזב עקב הידבקות nanoparticle שאינם ספציפיים, אנחנו רודפים אחרי בגישה רציומטרי, איפה nanoprobe מולקולרי יישוב מספק את האות ספציפי, nanoprobe של שליטה שאינן ממוקדות, עם ספקטרום ראמאן שונה, חשבונות שאינם ספציפיים רקע16,17. הראו מתודולוגיה זו של תהודה משופרת משטח למריחה ספקטרוסקופיית ראמאן רציומטרי לאחרונה במודל של עכברים של סרטן השחלות ' מאטום לשקוף '1.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח שני nanoprobes SERRS, אחד ממוקד, אחד שאינם ספציפיים, להיות מיושם באופן מקומי במודלים של העכבר, על מנת תמונה של ביטוי/השכיחות של סרטן הקשורים סמן באמצעות זיהוי רציומטרי של שני רגשים ויה ראמאן הדמיה. בעבודה זאת, הקולטן חומצה פולית (FR) נבחרה כיעד, כמו זה upregulated סמן סרטן השחלות רבים18,19. Microimaging ראמאן עם חלקיקים מבוססי SERS הוכח גם עבור סרטן תאים זיהוי20. שלושה ייחודי "טעמים" של ראמאן חלקיקים הם מסונתז, אחד הנובעות טביעות האצבע שלה צבע אורגניים שונים. חלקיקים מורכב בצורת כוכב זהב גרעין מוקף פגז סיליקה ומדגימים פלזמון משטח תהודה כ 710 ננומטר. הכתב ראמאן (צבען אורגני) הוא להפקיד במקביל להיווצרות מעטפת סיליקה. לבסוף, עבור nanoprobes, ממוקדות FR (αFR-NPs) הפגז סיליקה הוא מצומדת עם נוגדנים, ואילו nanoprobes שאינן ממוקדות (nt-NPs) הן passivated עם טפט של פוליאתילן גליקול (PEG).

טכניקה זו שימש בהצלחה למפות מיקרוסקופיים גידולים במודל xenograft של העכבר של ' מאטום לשקוף ' סרטן שחלה גרורתי (SKOV-3), הממחיש את תחולתן לשימוש ויוו. ניתן להאריך אותו גם עבור שימוש ברקמות נכרת, גידול phenotyping, או קביעת שוליים לאחר debulking כפי שמוצג המחקר cognate21.

SERRS nanoprobes מספקים פלטפורמה חזקה להקמת יישוב תגיות מרובות עבור סמנים ביולוגיים, מסונתז עם תגובות כימיות פשוטה כפי שתואר סכמטי באיור1. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הסינתזה של שני סוגים של SERRS nanoprobes (סעיפים 1-3), הפיתוח של מודל העכבר מתאים סרטן השחלות (סעיף 4), הממשל של nanoprobes והדמיה (סעיף 5), ולבסוף ניתוח הנתונים, ויזואליזציה (סעיף 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ממוריאל סלואן קטרינג במרכז לחקר הסרטן (#06-07-011).

1. זהב Nanostar הליבה סינתזה

הערה: Nanostars זהב משמשים ליבות בשני טעמים של nanoprobes SERRS השתמשו בניסוי זה.

  1. להכין 800 מ ל 60 מ מ חומצה אסקורבית (C6H8או6) פתרון במים (DI) יונים ו- 8 מ של 20 מ מ tetrachloroauric חומצה (HAuCl4) פתרון די מים. להצטנן עד 4 ° C.
  2. יש לבצע פעולה זו התגובה ב 4 º C. מקום בקבוקון חרוט המכיל 800 מ של הפתרון חומצה אסקורבית על צלחת מגנטית stir, זירוז מערבולת יציבה. להוסיף במהירות 8 מ ל תמיסה חומצית tetrachloroauric לתוך המערבולת. תוך שניות, nanostars יהוו, הפתרון יניחו בצבע כחול כהה. במקרה הצבע בכל עת הופך ורוד או סגול, המסמלת את היווצרות nanospheres, צריכים להיות מושלך ההשעיה, הסינתזה reattempted.
  3. שופכים את המתלים nanostar לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה למשך 20 דקות (4 ° C, 3,220 x g). וארוקן את תגובת שיקוע עוזבים µL 200 משוער של הפתרון בתוך כל שפופרת. לשלם זהירות שלא להפריע בגדר של חלקיקים בתחתית הצינורית.
    הערה: תגובת שיקוע צריך יש גוון כחול בגלל שנותרו nanostars על תנאי.
  4. שימוש של micropipette, להתסיס את הפתרון להשעות ולאסוף חלקיקים מהצינור כל. חלק בגדר אפשר לדחוס בתחתית הצינורית, לא resuspend אפילו עם נמרצת pipetting-להשליך את החלק הזה.
  5. להעביר את המתלים nanoparticle קלטת דיאליזה (MWCO 3.5 kDa), dialyze לפחות שלושה ימים נגד 2 ל' מים DI, שינוי המים מדי יום. אחסן nanostars דיאליזה ב 4 ° C עבור עד חודש בשינויים מים כל 3-4 ימים.
    הערה: יש לשמור את nanostars במקום דיאליזה עד הדרושים עבור התגובה silication, כמתואר בסעיף 2.

2. היווצרות של המעטפת סיליקה

הערה: שלושה טעמים של ראמאן nanoprobes הם מסונתז. הנוהל סינתזה הוא זהה עבור שניהם, כאשר ההבדל היחיד הוא המולקולה כתב ראמאן (צבען) בשימוש. בניסוי זה, משמשים פרכלורט IR780 ו- IR140. התגובה צריכה להתבצע תמיד בתוך מיכלי פלסטיק. הסינתזה להרחבה, ניתן לכוונן את הכמות הרצויה של injectate הנדרשים. כאן, סינתזה אצווה בינונית המתואר, אשר ניתנים לשינוי באופן ליניארי אחסון נמוך יותר או גבוה יותר לפי הצורך, עם ריכוזים אותו ואת זמני התגובה. התגובות עבור שני הסוגים nanoprobe SERRS יכול להתבצע במקביל. שים לב כדי למנוע זיהום צולב. Sonication צריכה להתבצע עבור redispersion של ננו-חלקיק כדורי לאחר צנטריפוגה במהלך שטיפת מדרגות, או לאחר חלקיקים אוחסנו לתקופה העולה על שעה אחת. Sonication צריכה להתבצע עד חלקיקים מושעים בבירור אל הפתרון, בדרך כלל עבור 1 s.

  1. צינור A (50 מ ל חרוט צינור), לערבב 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל, µL 500 של הפנסיון, 200 µL DI מים, µL 60 של צבע (פרכלורט IR780 או IR140, 20 מ מ ב DMF (dimethylformamide)).
  2. צינור ב' (צינור חרוטי 15 מ"ל), לערבב 3 מ"ל של אתנול µL 200 של. אמוניה מימית. Sonicate את nanostars מ- 1.4 שלב כדי לפזר לכל אשכול בפתרון ולהוסיף 1.2 מ של nanostars ברכבת התחתית.
    הערה: הפתרון אמוניה מימית היא הפכפכה ומאוד קשה פיפטה במדויק. אחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס, עד הצורך, כדי להקל על pipetting.
  3. במקום שפופרת A על מערבל מערבולת, זירוז מערבולת יציבה. במהירות להוסיף את התוכן של הרכבת התחתית B לתוך המערבולת ולהשאיר ערבוב במשך כ 5 ס להעביר מיד שייקרס ותן להגיב למשך 15 דקות תוך כדי טלטול-300 סל ד, בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר 15 דקות הדגירה, להרוות את התגובה על-ידי הוספת אתנול למלא את הצינורית 50 מ. צנטריפוגה כעשרים דקות ב 3,220 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  5. וארוקן את תגובת שיקוע, עוזב כ- 0.5 מ"ל של פתרון, נזהר שלא להפריע בגדר. להוסיף 1 מ"ל אתנול, להתסיס עם פיפטה כדי resuspend על חלקיקים. להעביר את שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL ולשטוף 4 פעמים עם אתנול על ידי צריך שתוציאו ב 11,000 x g למשך 4 דקות, כ רפה בעברית את תגובת שיקוע resuspending בגדר מאת ultrasonication עבור 1 s.
    הערה: בשלב זה, חלקיקים silicated יכול להיות functionalized, כמתואר בסעיף 3, או resuspended DI מים עם צעד נוסף כביסה, עבור אחסון ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע.

3. משטח Functionalization

הערה: IR780 SERRS nanoprobes להיות מצומדת עם חומצה פולית פילוח קולטן נוגדנים ויה crosslinker פג לטופס αFR-NPs; IR140 SERRS שליטה nanoprobes מצומדת עם טפט פג passivating, עבור nt-NPs. שני טעמים נוצרות באמצעות תגובה תיול-maleimide תגובות נפרדים אך במקביל.

  1. רחץ חלקיקים פעמיים על ידי צריך שתוציאו ב 11,000 x g למשך 4 דקות, כ רפה בעברית את תגובת שיקוע resuspending בגדר ב 1 מ"ל אתנול על-ידי ultrasonication. חזור על השלב כביסה פעם נוספת, אך redisperse ב 1 מ"ל של 85% אתנול, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) ו- 5% מים DI. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 h כדי להציג תיולים על פני השטח של חלקיקים.
  2. לשטוף חלקיקים תיול-functionalized על ידי צריך שתוציאו ב 11,000 x g למשך 4 דקות, כ רפה בעברית את תגובת שיקוע resuspending בגדר מאת ultrasonication, פעמיים באתנול, פעמיים ב- DI, ולבסוף ב- HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1- מאגר חומצה piperazineethanesulfonic) (10 מ מ, pH 7.1), להניח בצד.
    הערה: MES (2-(N- מורפולינו) חומצה ethanesulfonic) יש להשתמש מאגר או HEPES. מאגרי עם מליחות גבוהה יותר, כגון PBS (באגירה פוספט תמיסת מלח), עלול לגרום nanoparticle צבירה.
  3. עבור נוגדן functionalized αFR-NPs, להגיב µg 200 של נוגדנים (חומצה פולית נגד איגוד חלבון נוגדן שיבוט [LK26]) עם עודף טוחנת tenfold של פג crosslinker (אתר poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) ב- µL 500 מאגר MES (10 מ מ, pH 7.1) למשך 30 דקות.
  4. להסיר את עודף crosslinker ולרכז נוגדנים על ידי צריך שתוציאו את הפתרון נוגדן-יתד במסנן צנטריפוגליות (kDa MWCO 100). של המסננים צנטריפוגלי השתמשו במחקר זה, לבצע צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g ו- 23 ° C. לשחזר את הנוגדנים מצומדת בשפופרת טריים על-ידי היפוך המסנן צריך שתוציאו ב x 1000 g למשך 2 דקות.
  5. Pipette חלקיקים IR780 3.2 צעד לתוך הצינור עם הנוגדנים, להתסיס עם פיפטה לערבב. דגירה את התערובת במשך לפחות 30 דקות-טמפרטורת החדר, או, לחלופין, ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לטופס αFR-NPs.
  6. טופס nt-NPs, להוסיף 1% w/v המסתיימת מתוקסי (ז) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) מומס דימתיל סולפוקסיד כדי חלקיקים IR140 SERRS שלב 3.2, מגיבים לתת 500 µL MES מאגר (10 מ מ, pH 7.1) במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר, או, לחילופין ב 4 ° C את הלילה נעשה.
  7. בדרך כלל עכברים (סעיף 5), ספין למטה שני טעמים nanoprobe ב 11,000 x g למשך 4 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע להסיר את הפתרון עם נוגדנים unreacted חינם/פג, redisperse כל טעם במאגר MES (10 מ מ, pH 7.1)-600 ריכוז pM . כאשר resuspending חלקיקים, למזער חשיפה מיותרת באולטרסאונד, כדי למנוע דנטורציה של הנוגדן.

4. פיתוח מודל עכבר

  1. ליצור תרבות קבוע של שורת התאים אנושיים השחלות אדנוקרצינומה (SKOV-3). לחלופין, כדי לאפשר פיקוח על דרך ביולומינסנציה/פלורסצנטיות, השתמש transfected תאים לוק SKOV-3+/GFP+ . התרבות תאים RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בינוני עם 10% עגל עוברית סרום ומעבר פעמיים בשבוע. להזרקה, דגירה תאים עם 0.25% trypsin/0.05% EDTA למשך 3 דקות לנתק, ולאחר מכן לשטוף את resuspend ב- PBS ב 2 x 106 תאים/100 µL.
  2. להקים את המודל micrometastasis השחלות, להזריק µL 200 של תאים SKOV-3 על תנאי intraperitoneally לתוך athymic הנשי עכברים (עכברים FOXn1nu/FOXn1nu, בן 6-8 שבועות). התפשטות הצפק המופץ יתרחש בעוד כ- 4 שבועות. אם משתמש לוק SKOV-3+ תאים, ניתן לנטר הגידול עם ביולומינסנציה על ידי מתן 2 מ ג של חיפושית luciferin ב 50 PBS µL באמצעות הזרקת retroorbital.

5. Nanoprobe הזרקת והדמיה

  1. הכנת nanoprobes (αFR-NPs ו- nt-NPs) כפי שמתואר בסעיפים 1-3 ותערובת ביחס של 1:1, עבור ריכוז סופי של 300 pM כל אחד מסוגי במאגר MES (10 מ מ, pH 7.1). באופן אופציונלי, הכנת סטנדרטים של 30 pM של כל אחד הטעמים nanoprobe צינורות חרוטיים קטנים (100 µL).
  2. מזריקים intraperitoneally 1 מ"ל של ההשעיה nanoparticle כל עכבר, בעדינות לעסות את הבטן כדי להפיץ על חלקיקים בתוך חלל הצפק. להחזיר את העכבר לדיור שלה. אחרי 25 או יותר דקות, המתת חסד העכבר באמצעות חנק2 CO.
  3. הדקו את העכבר על משטח כירורגי, במיקום פרקדן (עבור כל הבטן הדמיה, את הצרכים פלטפורמה להיות הניתן להרכבה בארון תקשורת לבמה מיקרוסקופ זקופה).
    1. בעזרת מלקחיים משוננות ומספריים לנתיחה, להסיר את העור כדי לחשוף את הצפק ולבצע חתך הסאגיטלי גדול (בין 2 ו 3 ס מ אורך) כדי לחשוף את כל הבטן. לצרף את המדפים הצפק על הפלטפורמה. לשטוף את החלק הפנימי של חלל הצפק לפחות 60 מ"ל של PBS באמצעות בקבוק פלסטיק שפריץ.
      הערה: כדי לאפשר הדמיה בלא הפרעה של כל הבטן, המעיים צריך להיות גייסה או טוחנות. עבור כריתה, נכרות עם מצדו של כלי מצע המעי העליון על מנת להפחית דימום לתוך חלל הבטן.
    2. לחלופין, כדי התמונה איברים ספציפי, לסלק אותם לאחר כביסה PBS ולמקם אותן לשקופית מיקרוסקופ.
  4. להעביר את הפלטפורמה או שקופיות microspectrophotometer ראמאן עם תצורת אופטי זקוף, שלב ממונע עבור הדמיה; השתמש מערכת מסחרית עם 300 מגה-וואט 785 ננומטר דיודת לייזר, עם סריג של 1,200 חריצים לכל מ מ, שמרכזו בנקודה 1,115 ס מ-1.
    1. להתמקד באזור עניין באמצעות אופטיקה אור לבן, parfocal עם לייזר ראמאן. בחר אזור לדימות, את הרזולוציה הרצויה; בדו ח זה שימש מצב רכישה במהירות גבוהה (ספקטרום רכשה בתאורה לייזר מתמשך עם הבמה מיקרוסקופ כל הזמן זז, עם רזולוציה מרחבית אפקטיבית 14.2 מיקרומטר מאת מיקרומטר 200; בהגדלה x 5, 100 מגה-וואט חשמל אובייקטיבי, ו < 100 ms חשיפה לכל נקודת).
      הערה: הצינורות עם nanoprobes הפניה מ- 5.1 שלב ניתן להניח בתוך אזור שבעורך במידת הצורך, כדי לספק סטנדרטים פנימיים עבור הניתוח עוקבות. ודא כי אין מקורות אור חיצוני שאינו הלייזר להגיע אל המטרה.
  5. לחלופין, להכין המדגם עבור עיבוד היסטולוגית ואימות על ידי קיבוע paraformaldehyde 4% ב- PBS בן לילה ב 4 º C. לשטוף עם PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות פעמיים. לשמור את הדגימה 70% אתנול במים עד רגיל לעיבוד היסטולוגית והטבעה פרפין. עבור אימות היסטולוגית של הגידולים, סעיפים (בעובי 5 מיקרומטר) מ בעומקים שונים של בלוק פראפין יכול להיות מוכתם hematoxylin ואאוזין (H & E).

6. עיבוד נתונים והדמיה

הערה: כל עיבוד הנתונים בוצע עם ממשק משתמש גרפי פותח בתוך הארגון, באמצעות תוכנה מסחרית. כל הפונקציות בשימוש יש מקבילות כלליים זמינים בסביבות מחשוב אחרים.

  1. לקבל הפניה spectra עבור שני הטעמים, על-ידי חוקר את המתלים טהור של כל אחד. ספקטרום הפניה יכול להיגזר נקודת סריקות של nanoprobes, הדמיה של nanoprobes טוב-פלטות, או על ידי הכללת הפניות פנימיות הסריקות ניסיוני צינורות הפניה (ראה צעד 5.1).
  2. של תהליך מוקדם ספקטרום הפניה, באמצעות חיסור בסיסית (מסנן ויטאקר, λ = 200), נורמליזציה על-ידי האזור תחת עקומת, מסנן נגזרות Savitzky-Golay (להתאים פולינום מדרגה שנייה, רוחב, נגזרות מסדר ראשון = 15 צעדים). אלה ספקטרה עיבוד מקדים ישמש הפניות עבור דגם הריבועים הפחותים קלאסית (CLS).
  3. של תהליך מוקדם את הנתונים לדוגמה מתוך התמונה באותו אופן כמו ספקטרום הפניה. לקבל ציונים CLS עבור כל נקודת דגימה באמצעות אלגוריתם CLS זמינים. הציונים CLS (DCL) ישיר הם פשוט את הקואורדינטות של ההקרנה של קשת מדגם על שטח ליניארי שהוגדר על-ידי המטריצה ההופכית מוכללת (מור-פנרוז ההופכי) הספקטרום הפניה. אחרים התאמה אלגוריתמים ניתן להשתמש (הריבועים הפחותים חיובי, שיטת הריבועים הפחותים חלקית או אחרים).
    הערה: כמה אלגוריתמים הולם יכול להצמיח ציונים שליליים, אשר בהקשר זה אינם פיזיים. אם זה המקרה, אפשרות לקבוע סף כדי לא לכלול ציונים שליליים או אלגוריתם הריבועים הפחותים חיובי מאולצות להיות מועסק במקום.
  4. לחשב את היחס נקודתית של הציונים בכל ההתייחסות עבור חלקיקים יישוב (ציוניםαFR) על הציונים בכל ההתייחסות עבור חלקיקים שאינם ממוקדות (ציוניםnt). אם הציונים לא שלילי, היחס יכול להתבטא באופן לוגריתמי:
    R = יומן10(ציוניםαFR/ ציוניםnt).
    היחס R מוצגת בצורה הטובה ביותר בקנה מידה צבע מתפצלים ממורכז כאפס, לבטא שפע יחסי של הגששים ב סדרי גודל. יכול להיות בשכבות התמונה שתיווצר על גבי התמונה אור לבן של המדגם, כדי לחשוף את תחומי ביטוי הקולטן חומצה פולית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

למטרות בקרת איכות, חלקיקים יכול להיות מאופיין באמצעות מגוון של שיטות במהלך תהליך סינתזה, לרבות TEM, DLS, ננו-חלקיק מעקב ניתוח ו- UV/Vis ספיגת ספקטרוסקופיה, כמוצג באיור2.

בדרך זו, את גודל גרעין nanostar זהב (שמתואר סעיף 1), היווצרות של המעטפת סיליקה (סעיף 2) functionalization פני השטח הבאים (סעיף 3) יכול להיות מאומתים (איור 2). בדרך כלל, הגודל (hydrodynamic קוטר) של היסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הדרכה עבור הסינתזה של שני "טעמים" של SERRS nanoprobes, ותעסוקה שלהם בעכברים ראמאן הדמיה של השחלות גידול overexpressing הקולטן חומצה פולית, שימוש באלגוריתם רציומטרי. היתרון העיקרי של ראמאן הדמיה על טכניקות דימות אופטי אחרות (כגון קרינה פלואורסצנטית) הוא יחודיות גבוהה של האות nanoprobe זה לא יכול להיות מבולבל עם סימנים ממקור ביולוגי. בזו התגלמות של ראמאן הדמיה, חלקיקים לא ניתנת לווריד, אך באופן מקומי, באמצעות הזרקה בקרום הבטן ואחריו צעד ליחיד כביסה. מתודולוגיה זו, לאחר תרגומו נכנס לזירה קליני, מיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

• M.F.K. מוצג כלא ממציא בכמה שהונפקו או ממתינות לפטנטים הקשורים לעבודה זו. M.F.K. הוא שותף ומייסד ריו הדמיה, inc., שמטרתה לתרגם SERRS חלקיקים המרפאות.

• המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים כלכליים מתחרים אחרים.

תודות

מקורות המימון (ל M.F.K.) הם הכירו: NIH R01 EB017748, R01 CA222836, K08 CA16396; דיימון ראניון-Rachleff חדשנות פרס DRR-29-14, כיכר פרשינג זון פרס על ידי כיכר פרשינג זון סרטן מחקר הברית, והן MSKCC מרכז הדמיה מולקולרית & ננוטכנולוגיה (CMINT) ופיתוח טכנולוגיה מעניקה. התודות הם גם להרחיב את התמיכה מימון גרנט המסופקים על ידי מענק הליבה-NIH MSKCC (P30-CA008748).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>שם המגיב
חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץ'A5960
3-MPTMSסיגמא-אולדריץ'175617
אמוניום הידרוקסיד (28%)נוגדן נגד קולטן סיגמא-אולדריץ
פולאט [LK26] AbCamab3361
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ276855
דימתיל סולפוקסיד (נטול מים)סיגמא-אולדריץ'276855
אתנולסיגמא-אולדריץ'792780
IR140סיגמא-אולדריץ'260932
IR780 פרכלורט*סיגמא-אולדריץ576409הופסק*
איזופרופנולסיגמא-אולדריץ'650447
N.N.דימתילפורממידסיגמא-אולדריץ'227056
פוליאתילן גליקול757853
פוליאתילן גליקול-מלימידסיגמא-אולדריץ'900339
חומצה טטרכלורואוריתסיגמא-אולדריץ'244597
טטראתיל אורתוסיליקטסיגמא-אולדריץ'86578
*IR792סיגמא-אולדריץ'425982*אלטרנטיב
<חזק>שם הציוד
קלטת דיאליזה (3,500 MWCO)ThermoFIsher87724
מסננים צנטריפוגלייםMilliporeUFC510096
inVia מיקרוסקופ רמאן קונפוקלירנישו
MATLAB (v2014b)ארגז
PLS (v8.0)מחקר
' 338818 ' ' , , הכלים של Mathworks וקטור עצמי

מקורות

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570(2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277(2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33(2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008(2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SERRS
ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.