מאמר שיטה

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

DOI:

10.3791/58390

⸱

21 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מפורט עבור לוח שש-marker immunofluorescence מולטיפלקס אופטימיזציה שבוצעו, באמצעות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות עבור תוצאות עקביות יותר זמן הליך קצר יותר. גישה זו ניתן להתאים ישירות על ידי כל מעבדה לחקר חיסונית-אונקולוגיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המשך ההתפתחויות חיסונית-אונקולוגיה דורשות הבנה מוגברת של המנגנונים של סרטן אימונולוגיה. ניתוח immunoprofiling של דגימות רקמה של פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע ביופסיות (FFPE) הפך להיות כלי מרכזי להבנת המורכבות של הגידול אימונולוגיה, גילוי סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן. ניתוח Immunoprofiling של רקמות דורש הערכת סמנים משולב, כולל תאים דלקתיים subpopulations ואת המערכת החיסונית מחסומים, microenvironment הגידול. כניסתו של הרומן immunohistochemical מולטיפלקס שיטות מאפשר ניתוח multiparametric יעיל יותר של מקטעי רקמת בודד מאשר monoplex רגיל אימונוהיסטוכימיה (IHC). אחד immunofluorescence מולטיפלקס זמינים מסחרית (אם) שיטה המבוססת על tyramide-אות הגברה, בשילוב עם ניתוח מיקרוסקופי מולטי ספקטריאליות, מאפשר הפרדה אות טוב יותר של סמני מגוונות בתוך הרקמה. מתודולוגיה זו הוא תואם השימוש unconjugated נוגדנים העיקריים מוטבו עבור IHC רגיל על דגימות רקמה FFPE. במסמך זה אנו נתאר בפירוט פרוטוקול אוטומטית המאפשרת מולטיפלקס אם תיוג של דגימות רקמה קרצינומה עם פאנל נוגדן מולטיפלקס שש-marker הכוללת PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ו- AE1/AE3 cytokeratins עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole כמו counterstain גרעין התא. פרוטוקול לוח רב-חלקים ממוטבת ב הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטיות לזמן מוכתמים, כי היא קצרה יותר מזו של פרוטוקול ידני, ניתן ישירות חלה על ידי כל חוקר המעבדה ללימודי חיסונית-אונקולוגית על דגימות רקמה אנושית של FFPE. תיארו גם הם מספר פקדים, כלים, כולל שיטת בקרת ירידה לבקרת איכות בסדר של לוח אם חדש מולטיפלקס, שימושיות עבור אופטימיזציה ואימות של הטכניקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח Immunoprofiling של דגימות רקמה FFPE הגידול הפך מרכיב חיוני של מחקרים חיסונית-אונקולוגיה, במיוחד עבור גילוי של אימות של סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן בהקשר של ניסויים קליניים1 ,2. IHC הדפסות כסף, שימוש chromogens כימיים כגון diaminobenzidine, נשאר טכניקה סטנדרטית בפתולוגיה אבחון עבור immunolabeling של ביופסיה רקמות3. IHC רגיל יכול לשמש גם עבור סרטן רקמות immunoprofiling, כולל את כימות של subpopulations של לימפוציטים סרטניים הקשורים והערכה של רמות הביטוי של מחסומים מערכת החיסון כגון ליגנד מוות תאים מתוכנת 1 (PD-L1)4 ,5. IHC רגיל הוא מוגבל, אולם זה אנטיגן אחד בלבד יכול להיקרא לכל סעיף הרקמה. מאחר immunoprofiling מחקרים דורשות בדרך כלל הניתוח של הביטוי בשילוב של מספר סמנים, השימוש IHC סטנדרטי ידרוש צביעה של רקמת מקטעים מרובים, אחד צבעונית עם סמן בודד, ויהיה, לכן, מוגבל באופן משמעותי לניתוח של דגימות רקמה קטנות כגון ביופסיות מחט הליבה. בשיטות הרגילות IHC מוגבלים גם להערכה של סמנים הן coexpressed על ידי אוכלוסיות מגוונות תא, כפי שמקובל עם סמנים מחסום מערכת החיסון כגון PD-L1, הבאה לידי ביטוי על ידי מקרופאגים סרטניים הקשורים והן תאים סרטניים. מגבלה זו דווחה על-ידי פתולוגים לניתוח כמותי של סמן IHC לידי תא מגוון סוגי6ב, למשל, השימוש הרגיל monoplex IHC. התפתחות טכניקות IHC הדפסות כסף מולטיפלקס העסקת מגוונות chromogens צבעוניים על מייצג סעיף זהה רקמת קידום על פני השיטה IHC monoplex סטנדרטי,7 למרות הם נשארים מוגבל על-ידי immunolabeling של כמה סמני ולהציג גם מהווה אתגר טכני חשוב על הערכה נכונה של סמני לידי ביטוי באותו התאים subcellular של אוכלוסיות תאים באותו.

ההליכים הנ ל לגבי זמינות הרקמה דגימות קליניות, כמו גם המגבלות של מולטיפלקס טכניקות IHC הדפסות כסף, נתנו עלייה על הצורך לפתח שיטות מולטיפלקס משופרת ללימודי חיסונית-אונקולוגיה בהתאם תיוג פלורסנט בשילוב עם מערכות זה יעיל יכול להפריד את האותות של fluorophores מרובים לאותה השקופית הדמיה. טכניקה אחת כזו מבוססת על tyramide אות הגברה (TSA) בשילוב עם מיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות הדמיה עבור צבע יעיל ההפרדה8. ערכת מבוסס-TSA זמינים מסחרית מעסיקה fluorophores אופטימיזציה עבור הדמיה מולטי ספקטריאליות8 (ראה טבלה של חומרים). יתרון קריטי של מערכת זו הוא התאימות שלו עם אותו ללא תווית העיקרי נוגדנים כבר מאומת, אופטימיזציה עבור תקן הדפסות כסף IHC9,10,11. פעולה זו מאפשרת לא רק אופטימיזציה מהירה יותר, אלא גם גמישות ב השינויים אופטימיזציה ו לוח שילוב מטרות חדשות. יתר על כן, ניתן למטב את שיטת TSA מולטיפלקס immunofluorescence (mIF) זמינים מסחרית במערכות הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטי, המאפשר העברה ישירה של monoplex IHC הדפסות כסף כדי mIF.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור לוח mIF ללימודי חיסונית-אונקולוגיה המבוסס על אוטומטי mIF TSA מכתים ומשתמש בסורק מולטי ספקטריאליות עבור הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות הותאם, שונה על ידי כל משתמש מעבדה עם גישה מכשור המתואר, ריאגנטים. הפרוטוקול כולל פאנל של שישה ראשי נוגדנים עבור immunoprofiling של קרצינומות: PD-L1, PD-1, CD68 (כמו סמן פאן-מקרופאג), CD8 (תאי T-ציטוטוקסיות), Ki-67, ו AE1/AE3 (פאן-cytokeratin, משמש סמן אפיתל לצורך הזיהוי קרצינומה של תאים). מחקר שנערך לאחרונה מתאר אופטימיזציה של פרוטוקול mIF TSA ידנית באמצעות הדפסות כסף IHC כהפניה סטנדרטי כדי לאמת את תירגע צביעת12. השיטה מעודכן המובאת כאן פותחה באמצעות ערכת TSA זמינים מסחרית, שבע-צבע באופן ממוכנת הוספת גוון לסמלים, באופן דרסטי קיצור הזמן מכתימים מ 3 – 5 ימים ש 14, תוך גם שיפור מרקם של ההכתמה מיטבי. בנוסף הראשי פרוטוקול מפורט המובאת כאן, מקטע תוספת חומרים כולל שיטת "טיפה-שליטה", תהליך בקרת איכות נוספים כדי להעריך את פאנל mIF חדש, כמו גם הערות טכניות עבור אופטימיזציה, פתרון בעיות, פיתוח של פאנלים מולטיפלקס חדשים כדי לסייע למשתמש מעבדה כדי להגדיר ולמטב את השיטה TSA mIF לפאנלים mIF מותאם אישית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול המובאת כאן מתאר כיצד לבצע immunoprofiling של לוח mIF באמצעות TSA עבור שישה נוגדנים (CD68, ki67, PD-L1, PD-1 CD8, AE1/AE3) על הוספת גוון לסמלים אוטומטית (ראה טבלה של חומרים). הפרוטוקול גם מתאר כיצד לבצע את הפקדים טיפה לבקרת איכות של פאנל mIF חדש (ראה תוספת חומרים). ב פרוטוקול זה, מכתים מתבצע בעזרת שקופיות FFPE וללא רבב שמונה מן האדם שקדים (בקרה חיובית) שמונה מוכתם שקופיות מחלוקה אמבריולוגיה אדנוקרצינומה. השקופית הראשונה משמש מלאה מולטיפלקס מכתים עם כל הסמנים שש, השקופית השניה עבור הפקד isotype שבו מנוצלים אין נוגדנים הראשי את שש שקופיות הנותרים עבור הפקדים טיפה (ראה תוספת חומרים). פקד נוסף בשביל לרקמות autofluorescence מומלץ בחום ולא תמיד להיכלל מתחם בתי קולנוע ללמוד (ראה תוספת חומרים). עם זאת, החוקרים יכולים להעסיק הגידול סוגים אחרים של פקדים על-פי מטרות הפרוייקט שלהם. מעבדה משתמשים ללא ניסיון קודם עם שיטת TSA mIF וטכניקות סורק מולטי ספקטריאליות צריך לקרוא את מדריך פיתוח IHC מולטיפלקס (זמין באינטרנט, בכתובת http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). למרות מדריך זה מתאר פרוטוקול ידנית, הוא גם מספק דרך טובה להכיר mIF מכתימה את השיטה. כל מקטעי רקמת המועסקים פרוטוקול זה היו anonymised ואושר על פי הצהרת הלסינקי.

1. דגימות רקמה

  1. בחר מדגם אנושי שקדים FFPE המכיל היפרפלזיה הלימפה כדי לשמש מדגם אדנוקרצינומה אמבריולוגיה FFPE ידוע PD-L1 ובקרה חיובית חיובית. סקור את hematoxylin אאוזין (H & E) ומגלשות מאבני סרטן ריאות שנבחר כדי לאשר הנוכחות של גידול. חשוב למנוע גידולים עם אזורי שופע של נמק כפי זה עשוי להגדיל את צביעת הרקע לא ספציפית.
    הערה: עבור מיטוב זה, להימנע משימוש בלוקים פרפין אוחסנו עבור 10 שנים או יותר רקמות עם מראה מיובשים בבלוק פרפין (התייעץ עם טכנאי היסטולוגיה).
  2. שימוש של מיקרוטום, חותכים 10 סעיפים טורי ברציפות מ כל בלוק, עבה 4 מיקרומטר. הר הסעיפים על משטח זכוכית הטעון חיובית המשמש IHC, מקטע אחד לכל שקופית.
    הערה: חייב להיות מותקן מקטעים שטוח לחלוטין ללא קמטים, כמו קמטים עשויה ליצור חפצים מוכתמים. מספר השקופיות של הסעיפים טורי מ- 1 עד 10.
  3. הכנת שקופית חדשה H & E על החלק הראשון. סקור את השקופית H & E עם העזרה של פתולוג כדי לאשר הנוכחות של שקדים גידול רקמות או ריאה שנותרה בגוש.
    הערה: בשקופית זו H & E יכול לעזור, מאוחר יותר, עם המבחר של האזורים של ריבית עבור ניתוח מולטי ספקטריאליות ו- phenotyping.
  4. חנות מוכתם מקטעים בתוך קופסת פלסטיק שקופיות ב 4 ° C עד שלושה חודשים.

2. בריאת mIF החדש התוכנית Staining על הוספת גוון לסמלים האוטומטית: רישום של ריאגנטים

הערה: ריאגנטים להתווסף לרשימה ריאגנט בתוכנות אוטומטיות הוספת גוון לסמלים לפני הם זמינים עבור שימוש בפרוטוקולים. ראה את הטבלה של חומרים למידע על הגירסה דגם ותוכנות אוטומטיות הוספת גוון לסמלים.

  1. לחץ על הכרטיסיה ריאגנטים בתוך התוכנה הוספת גוון לסמלים אוטומטית. לחץ על הוסף כדי לייעד ריאגנט חדש. הזן את השם (למשל, "520 TSA ריאגנט") ואת השם המקוצר (למשל, "520 TSA"), וציין כי יש לכל היותר שמונה תווים. בחר משניים מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר את הספק. אל תשנה יחיד/זוגי כתם של יחיד/שקריאה DS. להגדיר את ברירת המחדל מכתים פרוטוקול פרוטוקול F. מוגדר פרוטוקול ברירת המחדל חיר ER1 20.
  2. שמור את מגיב חדש, וחזור על שלב מספר 2.1 עבור כל ריאגנטים המפורטים בטבלה1.

3. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: רישום של המכולות

  1. לכתוב את שמו של הכימית כדי לשמש בצד לכל מכולה. סרוק את הברקוד על הצד. בחלון הנפתח, בחר הכימית הנכון מהרשימה. בחר תאריך תפוגה ושמירה.
  2. חזור על הפעולות בשלב 3.1 עבור כל ריאגנטים המפורטים בטבלה1.
  3. לרשום את ערכת מחקר פתוח. לסרוק ברקודים הן בצד של ערכת ובצע מציגה על המסך. שם ערכת "מולטיפלקס מחקר ערכת 1." לרשום את aminomethane x tris (hydroxymethyl) 1 (טריס)-באגירה תמיסת מלח כחלק הקיט הזה (טבלה 1).

4. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: בריאת mIF פרוטוקול תוכנית

  1. פרוטוקול מולטיפלקס הבסיס הוא מראש עם השם אופל 7 מולטיפלקס על stainers האוטומטי החדש (ראה הגירסה דגם ותוכנות טבלה של חומרים). אתר את הפרוטוקול באמצעות סינון לפי "all" במקום "מועדף" על המסך פרוטוקול. אם הפרוטוקול הבסיסי לא קיים, לעדכן את התוכנה הוספת גוון לסמלים אוטומטית עם סיוע מהיצרן.
  2. כל השינויים צריך להתנהל על העתקי הפרוטוקול המקורי. לפני ביצוע שינויים, להציל את המקור וליצור עותק על-ידי לחיצה על הכרטיסיה פרוטוקולים , ואז לחיצה ימנית פרוטוקול אופאל 7 מולטיפלקס ובחירה עותק.
  3. לשנות את השם ל 7. הפרוטוקול מולטיפלקס 1 בחלון חדש, בחר את הכרטיסיה המשויך את המכשיר הנכון (דגם קומה או benchtop). להתאים את הפרוטוקול S1 טבלה משלימה. לחץ על הוספת ריאגנט הוסף שלב עיכוב peroxidase 10 דקות (לא במסגרת הפרוטוקול הסטנדרטי), בחר את המדכא peroxidase הכימית.
  4. לאשר השלבים חסימה לנצל את מאגר חסימה PKI. ודא כי כל נוגדן ראשוני מתייחס הכימית המתאים, כי נוגדנים משני שלבים לנצל של פולימר HRP, הזה ספקטרלי 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מסופק עם הקיט אוטומציה מולטי ספקטריאליות הוא מנוצל. לאשר כל האפשרויות על-ידי בדיקת הכימית זה שנקבע עבור כל שלב המתאימות בתפריט הנפתח על המסך פרוטוקול.

5. ממוכנות הוספת גוון לסמלים: תוספת של פקדים טיפה, פרוטוקול בקרה Isotype

  1. להעתיק את שם פרוטוקול מולטיפלקס 7 1 ולשנות אותו 7לפרוטוקול מולטיפלקס 1 CD68 טיפה. לשנות הכימית נוגדן CD68 העכבר אג ולשמור את הפרוטוקול.
  2. ליצור שישה פרוטוקולים חדשים יותר, אחד עבור כל פקד טיפה ואחד עבור הפקד isotype מלאה (שינוי לכל הנוגדנים isotypes המתאים) באופן זהה.

6. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: שקופית הכנת פרוטוקול

  1. העתק פרוטוקול prestaining * אופים ו Dewax ולשנות את פרוטוקול זה לאפות מולטי ספקטריאליות ו- h Dewax 2.
  2. התאם את פרוטוקול כדי להתאים את ריאגנטים שמוצג בטבלה 2. אופים שקופיות עבור 2 h ב 60 מעלות צלזיוס. Dewax ל 30 s ב- 72 מעלות צלזיוס.

7. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: הכנה של ריאגנטים

  1. להכין ערכת זיהוי מחקר אחד. מגיב אחד חייב להיות מקושר באופן קבוע עם ערכה זו, כך מילוי המיכל פתוח 30 מ ל המסומנים עבור 1 x באגירה טריס מלוחים (TBS) 1 x TBS, אתר זה בעמדה 1 (המרוחק ביותר הידית) מחקר לזיהוי ערכת המיועד מולטיפלקס ערכה מחקר 1. הזה ריאגנט ישויכו לצמיתות ערכה מחקר זו, אל תשנה מיקום לשימוש עתידי.
  2. תווית שני 30 מ ל פתוח מכולות בלוק מולטי ספקטריאליות , מולטי ספקטריאליות משנית. למלא את מיכל בלוק מולטי ספקטריאליות 30 מ של חסימה מאגר/נוגדן diluent הערכה מכתימים מולטי ספקטריאליות. למלא את מיכל מולטי ספקטריאליות משני 30 מ של אנטי-mouse/אנטי-rabbit משני נוגדן פולימר הערכה מכתימים מולטי ספקטריאליות.
  3. הכינו 10 7 mL מכולות פתוחות. האחסון הנדרש ב- microliters הוא 600 + (150 x [מספר השקופיות]). כל נוגדן יוחלו על 12 שקופיות במקרה זה (שקדים 6 ו- 6 ריאות). תיוג ואמצעי אחסון עבור כל מכולות מסומנים בטבלה3.
  4. לכל שפופרת נוגדן, תחילה להוסיף הנוגדן diluent, ואחריו נוגדן ראשוני מרוכז הכרכים המצוין בטבלה3. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
  5. להתכונן מכולה פתוחה 7 mL דאפי, באמצעות 4 טיפות דאפי להתרכז למיליליטר מזוקק פעמיים מים; סכום כולל של 16 להיות מוכתם דאפי (600 + [150 x 16] = 3,000 µL). להוסיף 3 מ ל מים מזוקקים-זוגי בתוספת 12 טיפות של דאפי ספקטרלי לתוך המיכל. להכין דאפי טריים עבור כל הפעלה.
  6. היכונו מכולה פתוחה 7 mL peroxidase מעכב. כל השקופיות 16 יטופלו עם מעכב peroxidase (600 + [150 x 16] = 3,000 µL). להוסיף 3 מ"ל של גוש peroxidase לתוך המיכל.
  7. לפני הכנת עבודה ריכוזים של fluors, resuspend כל fluors lyophilized על-ידי הוספת µL 75 של דימתיל סולפוקסיד כל שפופרת עבור חיל הים המסופקים על ידי היצרן. מערבבים על-ידי pipetting. . זה המניה עבור חיל הים TSA חנות ב 4 º C.
  8. להכין שישה מיכלי טיטור, אחד עבור כל עבור חיל הים. אמצעי האחסון הנדרש ב microliters הוא 350 + (150 x [מספר השקופיות]). כל עבור חיל הים יוחלו על השקופיות 16 במקרה זה (שקדים שמונה, שמונה ריאות). תיוג ואמצעי אחסון עבור כל מכולות מסומנים בטבלה4.
  9. כאשר כל ריאגנטים רשום והכינו, למקם לכל מכולה בכל מיקום ארון תקשורת ולטעון ריאגנטים כל על גבי הוספת גוון לסמלים אוטומטית. החללית יאשר את הנפח של כל מגיב.

8. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: לטעום מולטי ספקטריאליות מכתים וההתקנה

  1. התוכנה הוספת גוון לסמלים ממוכנת, לחץ על שקופית ההתקנה בחלק העליון של המסך. לחץ על הוסף המחקר. אכלס את החלון המוקפץ עם מזהה מחקר, לימוד שם, הערות.
    1. בחר את שם החוקר ניצוח מכתימים הפעל מתוך הרשימה הנפתחת. להשאיר את העוצמה dispense 150 µL. בחר מולטי ספקטריאליות Dewax עבור הכנת פרוטוקול. לחץ על הלחצן ' אשר ' הוסף שקופית. תחת הערות, הקלד "מגה-פלקס 123ABC ריאות 1." למלא את השדות הבאים כמצוין: סוג הרקמה = בדיקת רקמות; Dispense נפח = 150 µL; Staining מצב = יחיד, שוטף; סמן = שלילי; צביעת = הקלד "7 מגה-פלקס פרוטוקול 1"; הכנה = אופים מולטי ספקטריאליות, Dewax 2 h; חיר = חיר 20 דקות עם ER1.
  2. לחץ על הוסף שקופית ולשנות את ההערות ואת פרוטוקול כדי להוסיף על שקופיות בקרת ירידה והחלק שליטה isotype. כאשר כל השקופיות נוספו המחקר, סגור את חלון הוספת שקופיות ולהדפיס תוויות. להחיל את התוויות על אזור התוויות המתאים בכל שקופית.
  3. לטעון את השקופיות לתוך ארונות תקשורת, החל אריחי חיפוי לכיוון הנכון, להכניס ארונות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות ולאחר להנמיך את המגשים. המכשיר יסרוק את תוויות שקופיות.
  4. כאשר כל השקופיות ריאגנטים כבר שנסרקו והם יהיו נמדד. לחצן הפעלה (◄) יהפוך לפעיל. אם autostainer מזהה שגיאות, כגון עוצמת ריאגנט לא מספיקות, סמל אזהרה צהוב יופיע על-ידי המגש המושפעת. אם מתרחשת שגיאה, וימינה לחץ על סמל התראה, לתקן את השגיאה.
  5. ליזום מכתים מיד או לקבוע מועד התחלה מושהית. הפרוטוקול הוא כ 14 h במשך. הערה: ודא שהפרוטוקול ישלים בכל פעם כאשר השקופיות ניתן להסיר באופן מיידי כפי exess שטיפה יכול להשפיע תוצאות מוכתמים.

9. Coverslipping של השקופיות מולטי ספקטריאליות

  1. להסיר את השקופיות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות ולאחסן אותם במעמד שקועים 1 x TBS.
  2. הר הדגימות עם 1.5 מס coverslips, 15 µL של התקשורת הרכבה (ראה טבלה של חומרים). להסיר את כל הבועות על ידי לחיצה על בעדינות coverslip עם טיפ פיפטה.
  3. לאפשר את השקופיות לרפא ללילה בטמפרטורת החדר על הספסל מעבדה. ניתן לסרוק שקופיות משומרים מיד עם טיפול זהיר.

10. מולטי ספקטריאליות סורק

  1. כוח על הסורק מולטי ספקטריאליות, המחשב שלה (לקבלת מידע מודל ותוכנות, ראה טבלה של חומרים ). הפעל את תוכנת שליטה מיקרוסקופ. פתח דלת הכניסה של הסורק מולטי ספקטריאליות על-ידי לחיצה על כפתור רגיש למגע על החלק הקדמי של המכשיר. כל מנשא קפיץ בסורק בעל ארבע שקופיות. לטעון כל השקופיות לתוך נושאות ולהקליט את הסדר לפני טעינת נושאות לתוך המכשיר.
  2. בחר פרוטוקול ערוך ולחץ על בניו...; לאחר מכן, צור שם פרוטוקול 1 לוח מולטיפלקס ופקדים טיפה. ליצור את שם המחקר מולטיפלקס פיתוח לוח, לחץ על פרוטוקול ליצורוהקלד סקירה לסרוק מסנן דאפי; לאחר מכן, בחר כל שקופית סרוק , רזולוציה פיקסל 0.50 מיקרומטר (20 X). צריך להיות מיוצג כל להקות ומסננים. אם לא, לחץ על עריכה ומסננים להקות, בחר כל המסננים חמש (דאפי, FITC, CY3, טקסס Red ו- CY5) ולאחר מכן, לחץ על ערוך חשיפות.
  3. לטעון המוביל על-ידי בחירת חברת ההובלה עם תירגע מלא של ריאות אדנוקרצינומה. בחר את השקופית הנכונה באמצעות ממשק משתמש גרפי. פוקוס הרקמה באופן ידני או באמצעות פוקוס אוטומטי. נווט אל כל אזור עם צביעת דאפי מקובל ולחץ על חשיפה אוטומטי כדי להגדיר את החשיפה באלפיות שניה (0 – 2,000 ms).
  4. חזור על הפרוצדורה זהה עבור כל חמש מערכות סינון בעמודות לסרוק כל והן אזור MSI. הקפד לנווט לאזור בו מקובל מכתים ומקדו המיקרוסקופ לפני הגדרת החשיפה עבור כל רמת סינון ואת ההגדלה. Auto-חושפים עבור כל המסננים חמש 20 x הסריקה הכולל, 20 x מולטי ספקטריאליות הדמיה (MSI) אזורים מולטי ספקטריאליות. בחר רזולוציה פיקסל של 0.50 מיקרומטר (20 x). לשמור את הפרוטוקול ולחץ שוב כדי לחזור למסך הבית של התוכנה וקטרה; לאחר מכן, לחץ על סריקת שקופיות.
  5. לפתוח את הממשק עבור כל שקופית וקבע פעילות לסריקה. הגדר מחקר פיתוח לוח מולטיפלקס, מוגדר פרוטוקול 1 לוח מולטיפלקס ופקדים זרוקולאחר שקופית מזהה ערכת אבג123 ריאות מולטיפלקס, CD68 מולטיפלקס זרוק אבג123 ריאות, וכו ' . כאשר כל השקופיות סומנו כאנטי משימות מוגדרות, לחץ על סריקה. הסורק האוטומטי מולטי ספקטריאליות יבצע סריקות שקופית מלא של כל השקופיות באמצעות כל המסננים חמש.

11. מולטי ספקטריאליות סורק: הדמיות מולטי ספקטריאליות

  1. ברגע הסריקות הושלמו, לפתוח את התוכנה QPTIFF ("Phenochart") ולחץ על עומס שקופיות בפינה השמאלית העליונה. פעולה זו תפתח QPTIFF, וזו סריקת כל שקופית 5-מסנן. כל שכבה מכילה מידע אחד או יותר עבור חיל הים, אז השירות הוא מוגבל, אבל מבנה רקמות ודפוסים ביטוי רחב ניכרים והוא יכול לשמש כדי לבחור אזורי עבור MSI.
  2. נווט אל ופתח לשקופית הנכונה בחדר העבודה באמצעות עץ הנפתחת בצד השמאל. להיכנס (למעלה מימין) ראשי התיבות של המשתמש.
  3. בחר חמישה אזורים עבור MSI באמצעות הכלי חותמת בחלק העליון של המסך. התייעץ עם הפתולוג אם הם זמינים. תחת בחר עבור, בחר רכישה; תחת גודל שדות, בחר 1 x 1; תחת הגבלת שדה, בחר 0.5 מיקרומטר (20 x). בהתבסס על cytokeratin (CK) צביעת (בעיקר באזור Cy5), בחר במספר אזורים עם הגידול (CK +) וגם משתית (CK-) לדימות מהסריקה הכללית. חזור על הליך זה עבור כל שקופית.
  4. לאחר שבחרת את כל קבצי msi של, לסגור את התוכנה Phenochart ולחזור על התוכנה וקטרה . לשנות את המשימה מ סרוק ל- MSI עבור כל שקופית, לאחר מכן, לחץ על סרוק שוב לבצע את האוסף MSI.

12. ספקטרלי Unmixing

הערה: הצעד unmixing ספקטרלי נדרש עבור ערוץ ההפרדה וניתוח תמונה של השקופיות. לפני unmixing ספקטרלי מתבצע בתוכנה ידע, הספרייה ספקטרלי להיבנות באמצעות ריאות אדנוקרצינומה שקופיות מוכתם כל עבור חיל הים לבד ועם דאפי לבדה. הליך זה מתואר גם במדריך הנ ל מולטיפלקס IHC Assay פיתוח.

  1. עם השלמת הרכישה MSI, להשתמש בתוכנה ("ידע") unmixing ספקטרלי לפתוח קבצים בתיקיה MSI . קבצים אלה מסתיימות בסיומת סוג קובץ .im3.
  2. תחת תבנית תמונה, בחר Multispectral; תחת תבנית המדגם, בחר זריחה; ובחר תחת ספריית ספקטרלי מקור, ידע.
  3. כדי לבחור fluors, בחר ולאחר לטעון כל fluors 6, דאפי מהספריה בנוי עם ריאות אדנוקרצינומה ספריית השקופיות. לחץ על הכנת כל (השמאלי התחתון). תוכנה unmixing ספקטרלי יבצע ספקטרלי unmixing על כל התמונות פתוח, באמצעות הפרופילים ספקטרלי המוצעים.
  4. עם פתולוגית, להעריך את התבנית מכתימים מפני כתמים יחיד הדפסות כסף של אותו יעד בשקופיות רציפים של הרקמה זהה.

13. הערכה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית, אותות והחלשות של אותות

הערה: הכלי ספירות, המופיע כמו חץ עם חום תיבה קטנה, הוא הכלי החשוב ביותר עבור מיטוב מולטיפלקס, אמור לשמש בתדירות גבוהה (ראה תוספת חומרים). באמצעות הכלי ספירות בתוכנה unmixing ספקטרלי, להעריך את יחס אות לרעש, אשר לכל הפחות יעלה 10:1 (ראה תוספת חומרים עבור פתרון בעיות, הערכת תירגע מכתים עם הפקדים טיפה).

  1. 13.1. עם תמונה פתוחה בתוכנה unmixing ספקטרלי, לעסוק בכלי ספירות, סקר תמונות כדי להעריך את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל ערוץ. עוצמת היעד ברקמת הריאה הוא בין 10 ל- 20 סעיפים מנורמל. הכלי ספירות מנורמל מוצג באיור1.
  2. הכללת שקופיות עם האות המרבי ספירות אות פחות מ 10 או רגיל עבירות שטח של פחות מ-5 עבור כל סמן כך autofluorescence מכתים את המטרה לא להתחרות עם האות אותנטי.
  3. אל תכלול שקופיות עם מקסימום מונה גדול מ- 30 עבור כל ערוץ למנוע דימום ספקטרלי או unmixing ספקטרלי לא יעיל.
  4. כתובת ספירות מנורמל גבוה או נמוך על-ידי התאמת את הריכוז TSA.

14. ניתוח תמונות מולטי ספקטריאליות

  1. פתח אחד או יותר MSI ספקטרלי תוכנה unmixing , fluors בחר רק עבור unmixing זה מיוצגים בתמונה פתוחה לפחות אחת. לחץ על הכנת כל כדי unmix כל התמונות הצבע הנוכחי הפתוח להניב תמונות spectrally החלקיות.
  2. בחרו בכלי ספירות סקר ספירת על-פני כל תמונה על-ידי ריחוף מעל area(s) של עניין.
  3. בחר סמל העין כדי לפתוח את עורך נוף. לבחור ולכוונן את עוצמת התצוגה של כל אחד מערוצי עצמאית.
  4. בחרו קביעת תצורה כדי לפתוח את פילוח רקמות, פילוח תא, phenotyping ומודולים הבקיע. כלים אלה נדרשים לשם אימות אובייקטיבית מולטיפלקס מכתים מפני כתמים יחיד הדפסות כסף והוא יכול לשמש כדי להפיק נתונים כמותיים phenoptic (איור S1).
  5. השתמש את ייצוא tab כדי להציל את גווני אפור, פלורסנט, לא דחוס pathview בסגנון TIFF וקבצי נתונים מן המודולים ניתוח phenoptic עוד ניתוח, אחסון בארכיון של מצגות (איור S1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן יספק תוצאות כאלה באיור 2. להתחיל עם הערכה של ההכתמה של הפקד שקדים, החל האפיתל משטח תאים קשקשיים. היסטולוגיה של המדגם שקדים ניתן לסקור עם פתולוגית, באמצעות השקופית H & E כנקודת התייחסות. אם מקטעים IHC הדפסות כסף מבוצעות באמצעות הסמנים באותה רקמה באותו רחוב, ואז אלה ניתן להשתמש כדי לאשר את צפיפות, התפלגות של כל סמן בשקופית mIF. כפי שמוצג באיור 2א, רקמת שקדים צריך לספק ברורה cytokeratin AE1/...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המהפכה חיסוני סרטן מתמשך הוא פתיחת הרומן ומבטיח אפשרויות טיפוליות עבור חולי סרטן13. ההתקדמות בתחום חיסונית-אונקולוגיה דורשים ידע מוגברת של microenvironment גידול דלקתי, לא רק כדי להבין את הביולוגיה של מנגנוני החיסון המעורבים carcinogenesis, אלא גם למצוא חזוי סמנים ביולוגיים חדשים חיסוני מבוססי טיפולים1,2. בשל מורכבות הביולוגיה של הסרטן אימונולוגיה, חקירתו של דגימות רקמה הגידול בדרך כלל נדרש לפתח הרשימה המתארכת של סמני המערכת החיסונית, אשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי MedImmune, תכשירים הכללית R & D זרוע של חברת AstraZeneca. . סי-וו, K.R. ו- C.C.H. הם עובדים של מין הולל אלמר, אשר מייצר את ריאגנטים (TSA קיט) וסורקים מולטי ספקטריאליות ששימשו בעבודה זו. טרשת נפוצה, ארגז, A.H., W.Z., Bagnall ג, ג בראון, ג'יי, א. ל, K.S., M.R. ו J.R.C. עובדים של MedImmune עם בעלות מניות ו/או אינטרסים מניות או אפשרויות בחברת AstraZeneca.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיכה העריכה סופק על ידי דבורה Shuman של MedImmune.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תוכנת "InForm 2.4.2" לביטול ערבוב ספקטרלי וניתוח תמונהPerkinElmerCLS151066נקראת "תוכנת ביטול ערבוב ספקטרלי" בטקסט
Phenochart 1.0.9" תוכנת QPTIFF לבחירת MSI וצפייה בסריקת שקופיות כוללתPerkinElmerCLS151067נקראת "תוכנת QPTIFF" בטקסט
#1.5 CoverslipsSigma Aldrich2975246
200 הוכחה אתנולKoptecV1001
20x Tris-Buffered מלחVWRJ640-4L
נוגדן מדללDAKOS2203
אנטי-CD68 עכבר חד-שבטיDAKOM087601-2שיבוט PG-M1
אנטי-CD8 ארנב חד-שבטיVentanaM5392שיבוט SP239
אנטי-CK עכבר מונוקלונליDAKOM351501-2שיבוט AE1 / AE3
Anti-ki67 עכבר חד שבטיDAKOM724001-2שיבוט MIB-1
אנטי-PD-1 ארנבאיתות תאים# 86163שיבוט D4W2J
אנטי-PD-L1 ארנב חדשבטי Ventana790-4905שיבוט SP263
תמיסת הסרת שעווה בונדLeicaAR9222נקרא "תמיסת שעווה" בטקסט
פתרון אחזור אפיטופ בונד 1LeicaAR9961שנקרא "ER1" בטקסט
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640נקרא "ER2" בטקסט
Bond Open Containers, 30 מ"לLeicaOP309700נקרא "30 מ"ל מכולות פתוחות" בטקסט
Bond Open Containers, 7 מ"לLeicaOP79193נקרא "7 מ"ל מכולות פתוחות" בטקסט
Bond Polymer Refine DetectionLeicaDS9800נקרא "ערכת זיהוי כרומוגני" בטקסט
ערכת גילוי מחקר בונדLeicaDS9455נקרא "ערכת זיהוי מחקר" בטקסט
ערכת טיטרציה של בונדLeicaOPT9049נקרא "ערכת טיטרציה" בטקסט
Bond Universal Covertile NovocastraLeicaS21.2001נקרא "covertiles" בטקסט
תמיסת שטיפת בונד 10X תרכיזLeicaAR9590נקרא "תמיסת כביסה 10x" בטקסט
BondRX AutostainerLeicaנקרא "מכתים אוטומטיים" בטקסט
תוכנת BondRX גרסה 5.2.1.204Leicaנקרא "תוכנת צביעה אוטומטית" בטקסט
אוטומציה של 7 צבעים ערכת IHCPerkinElmerNEL801001KTנקראת "ערכת צביעה מולטי-ספקטרלית" בטקסט
Peroxidase BlockLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965נקרא "תושבת שקופיות" בטקסט
Starfrost Slides Fisher15-183-51
מיקרוסקופ מולטי-ספקטרלי של Vectra Polaris עם תוכנת "Vectra 3.0.5" לבקרת מיקרוסקופ מולטי-ספקטרליPerkinElmerCLS143455נקרא "תוכנת בקרת מיקרוסקופ" בטקסט
" חד שבטיים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FFPEIHCTSAPD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3Drop Control MethodSpectral Un mixing Software

מאמרים קשורים