כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההיפופוטם איתות הוא מווסת ההכפלה של גודל איבר ויש לו תפקידים חשובים לביולוגיה סרטן ופיתוח. בשל האתגרים הטכניים, זה נשאר קשה להעריך את הפעילות של מסלול איתות זה ומפרשים בתוך הקשר הביולוגי. הספרות הקיימת על מדכאי גדולים (באמת) מסתמך על שיטות הינן איכותיות, לא יכול בקלות להיות קנה המידה להמציא להקרנה. לאחרונה, פיתחנו ביוסנסור מבוססי ביולומינסנציה כדי לפקח על הפעילות קינאז של רכיב מרכזי נצמדתי-a של המפל קינאז היפו. כאן, אנו מתארים את נהלי איך הזה ביוסנסור נצמדתי (השרירים-BS) יכול לשמש כדי לאפיין היפו מסלול הרגולטורים. ראשית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חוקרים את השפעת מועמד חלבונים overexpressed (למשל, VEGFR2) על פעילות השרירים באמצעות השרירים-BS. לאחר מכן, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש עבור מסך מעכבי קינאז בקנה מידה קטן. פרוטוקול זה יתכן כבניין יכול להיות קנה המידה-up כדי לבצע במסכים גדולים יותר, אשר ללא ספק יזהה הרגולטורים הרומן של הנתיב היפו.
מבוא
ההיפופוטם איתות לשביל זוהה לראשונה בדרוזופילה כרגולטור הרומן של צמיחת תאים ושל בעלי חיים בגודל1,2. מאז גילויו הראשונית, הרכבה ראיות בצורה משכנעת הראו כי מסלול היפו משחק תפקידים חיוניים לפיתוח (למשל, התפתחות עוברית מוקדמת, בקרת גודל האיבר, תלת-ממדית [תלת-ממד] מורפולוגיה), tumorigenesis ( למשל, התפתחות גידולים, גרורות, אנגיוגנזה, התחמקות המערכת החיסונית, אי יציבות גנומית, תגובת המתח, עמידות לתרופות), והומאוסטזיס רקמות (למשל, חידוש תאי גזע, בידול, התחדשות רקמות לאחר פציעה) 3 , 4 , 5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חקירת מווסת בשם של היפו איתות באמצעות השרירים-BS
-
ציפוי, תרביות תאים תאים
- הכנת תרבית תאים
- חמים 1 x PBS, DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך כ 30 דקות.
- ניקוי יסודי ארון אבטחה עם 70% אתנול.
- הצב תרביות רקמה מנות, פיפטות פסטר, פיפטות סרולוגית, טיפים פיפטה וחטף תרביות רקמה כנדרש.
- להוציא 1 x PBS, התקשורת, טריפסין-EDTA מהאמבטיה מים, לנקות אותם עם 70% אתנול, והציבו אותם בשכונה.
- תחזוקה, ציפוי של התאים עבור תרביות תאים
- לבחור קו תא ביעילות גבוהה תרביות תאים (למשל, HEK293) עבור הניסוי. בדוק....
- הכנת תרבית תאים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נצמדתי-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות השרירים (איור 3). בניסוי זה, שימש Renilla בקרה פנימית. הביטוי ארעית של הפה-5SA, צורה פעילה המכונן של הפה, גורם להגברת רמות של מטרות תעתיק הפה עלייה עוקבות נצמדתי פעילות קינאז דרך מסלול משוב הוקמה25. MST, activator במעלה הזרם של השרירים בשביל היפו (איור 1), גם מגביר את עוצמת האות ביוסנסור. עם זאת, ביטוי VEGFR, אשר מפעילה PI3K/.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ואילו השביל היפו משחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים שונים, ומוביל dysregulation של הנתיב היפו סרטן6, איך מסלול היפו מוסדר בתגובה לגירויים שונים אינה מובנת לחלוטין. בנוסף, חלה לא כמותית ומערכת בזמן אמת כדי להעריך את הפעילות של רכיבי הליבה היפו. לאחרונה, אנחנו פיתח ואומת על ביוסנסור הרומן למדידת פעילות קינאז נצמדתי מסלול היפו24. ביוסנסור הזה יכול לשמש לא רק לניטור באופן כמותי ומדויק היפו איתות פעילות בתאים חיים, אלא גם עבור מסכי של שהתרופות המתוות מסלול היפו לטיפול בסרטן........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ קנדי המכון לבריאות למחקר (CIHR #119325, 148629), את קנדי השד סרטן הקרן (CBCF) כדי XY. TA נתמך על ידי את המלגה לתואר שני של קנדה וניהר הבינלאומי אונטריו המלגה לתואר שני. HJJVR נתמך על ידי המלכה אליזבת השנייה במלגה ללימודי תואר שני במדע וטכנולוגיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>טריפסין-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| <חזק>סרום בקר עוברי (FBS) | Sigma | F1051 | |
| <חזק>DMEM | סיגמא | D6429-500 מ"ל | DMEM עם גלוקוז גבוה |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| <חזק>5x מאגר ליזה פסיבי | Promega | E194A | 30 מ"ל |
| <חזק>Dual-Glo® מערכת בדיקת לוציפראז | Promega | E2940 | ערכת 100 מ"ל |
| <חזק>20/20 לומינומטר | טרנר ביוסיסטמס | 998-2036 | לומינומטר קורא צינור יחיד |
| <חזק>GloMax® נווט עם מזרקים כפולים | Promega | GM2010 | 96-בארות קורא צלחות לומינומטר |
מקורות
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
