Method Article

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלורופלסט הוא אברון חיוני כי הוא אחראי על תהליכים שונים התאית בצמחים, כגון פוטוסינתזה וייצור של מטבוליטים משניים רבים ושומנים. מהכלורופלסט לדרוש מספר רב של חלבונים אלה תהליכים פיזיולוגיים שונים. מעל 95% של כלורופלסט חלבונים הם מקודד גרעין והן מיובאים לתוך מהכלורופלסט של ציטוזול לאחר התרגום ריבוזומים cytosolic. לפיכך, הייבוא נכונה או פילוח של חלבונים אלה כלורופלסט מקודד גרעין כדי מהכלורופלסט חיוני לתפקוד תקין של מהכלורופלסט, כמו גם על תא צמח. כלורופלסט גרעין מקודדת חלבונים מכילים רצפי אותות פילוח מסוים כדי מהכלורופלסט. מכונות מולקולריות מקומי כלורופלסט או ציטוזול מזהה אותות אלה ולבצע את תהליך הייבוא. כדי לחקור את המנגנונים של חלבון ייבוא או המיקוד מהכלורופלסט ויוו, פיתחנו מהיר, יעיל מבוססי פרוטופלאסט שיטה לנתח חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט של תודרנית. בשיטה זו, אנו משתמשים protoplasts מבודד מן העלים רקמות של תודרנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור שימוש protoplasts כדי לחקור את המנגנון שבאמצעותו חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלורופלסט הוא אחד organelles החשובים ביותר צמחים. אחת מהפונקציות העיקריות של מהכלורופלסט היא לבצע פוטוסינתזה1. מהכלורופלסט לבצע גם רבים תגובות ביוכימיות אחרות לייצור של חומצות שומן, חומצות אמינו, נוקלאוטידים ו מטבוליטים משניים רבים1,2. עבור כל תגובות אלו, מהכלורופלסט דורשים מספר רב של סוגים שונים של חלבונים. עם זאת, הגנום כלורופלסט מכיל רק כ-100 גנים3,4. לכן, מהכלורופלסט עליך לייבא את רוב החלבונים שלהם ציטוזול. למעשה, רוב החלבונים כלורופלסט הראו להם אפשרות לייבא את ציטוזול לאחר תרגום-4,-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול של צמחים תודרנית

  1. להכין 1 L Gamborg B5 בינונית (B5) על-ידי הוספת 3.2 g של B5 בינוני כולל ויטמינים, 20 גר' סוכרוז, 0.5 גר' 2-(N-morpholino) אתאן sulfonic חומצה (MES) כדי כ- 800 מ ל מים יונים, והתאימו את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). הוסף יותר יונים מים להביא את הנפח הכולל 8 הוסף ל 1g של phytoagar ו אוטוקלב למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס.
  2. לאפשר המדיום מגניב עד 55 ° צלזיוס, שופכים 20 – 25 מ של המדיום B5 לתוך צלחת פטרי (9 ס מ קוטר, 1.5 ס מ גובה) על ספסל נקי. מתייבשים צלחות במשך 2-3 ימים, לארוז אותם עם גלישת נקי, לשמור אותם במקרר עד לשימוש.
  3. לחטא תודרנית לבנה זרעים עם 1 מ"ל אתנול 70% (v/v) בשפופרת צנטרפוגה (ה-tube) ע י נ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייבוא של חלבונים לתוך מהכלורופלסט יכולים להיבדק באמצעות שתי גישות: מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח immunoblot לאחר ההפרדה מרחביות-דף-מתווכת. כאן השתמשנו RbcS-nt:GFP, פיוז'ן לבנות קידוד N-מסוף 79 חומצת אמינו משקעי RbcS המכיל את פפטיד טרנזיט דבוקה GFP. כאשר חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט, זריחה ירוק האותות החלבון היעד RbcS-nt:GFP צריך להתמזג עם אותות פלואורסצנט אדום כלורופיל אוטומטי-זריחה, כפי שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1). החפיפה קרוב של .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיפקנו פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts של תודרנית ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. שיטה זו היא חזקה על חקירת תהליך הייבוא חלבון. טכניקה זו פשוטה, תכליתי שימושית לבחינת הפגיעה המכוונת החלבונים מטענים המיועד ל מהכלורופלסט. באמצעות שיטה זו, protoplasts מוכנות רקמות עלים של תודרנית11,12 אשר ניתן להשיג צמחים בשלבי גדילה שונים רבים החל מוקדם מאוד עלים בוגרים לגמרי. עם זאת, יש לנקוט בעת גידול הצמחים המשמשים פרוטופלאסט הכנה. יש להשתמש צמחים בריא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו בוצע עם תומך של הקואופרטיב תוכנית מחקר מדעי החקלאות ופיתוח טכנולוגיה (פרויקט מס ' PJ010953012018), ניהול פיתוח כפרי, המענק קרן מחקר לאומי (קוריאה) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2016R1E1A1A02922014), הרפובליקה של קוריאה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GAMBORG B5 בינוני כולל ויטמיניםDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
אגר, אבקהJUNSEI24440S1201
סרט כירורגי מיקרופור3M1530-0
להב כירורגי אל חלד No.10FEATHERלא זמין
, 50 מ"לSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.צלולאז לא זמין
ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.לא זמין
ALBUMIN, BOVINE (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
סידן כלורי, DIHYDRATEMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
מסך עבור CD-1SIGMAS1145
מסכים עבור CD-1SIGMAS3895
צלחת פטריSPL מדעי החיים10090
פיפטה פסטרהילגנברג3150102
צנטריפוגה מעבדה / BENCH-TOPVISION SCIENTIFICVS-5500N
נתרן כלוריJUNSEI19015S0350
אשלגן כלוריSIGMAP3911-1KG
D-גלוקוז,ביו בייסיקGB0219
אשלגן הידרוקסידDUKSAN40
סידן חנקתי טטרהידרטSIGMAC2786-500G
פולי (אתילן גליקול)SIGMAP2139-2KG
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSIGMAM2393-500G
שפופרת 13 מ"ל, 100x16 מ"מ, PPSARSTEDT55.515
שקופיות מיקרוסקופMARIENFELD1000412
משקפי כיסוי מיקרוסקופMARIENFELD101030
תא ספירהMARIENFELD650030
Axioplan 2 מיקרוסקופ הדמיהCarl Zeissלא זמין
מיקרו שפופרת 1.5 מ"לSARSTEDT72.690.001
2- מרקפטואתנולSIGMAM3148-250 מ"ל
נתרן דודציל סולפט (SDS), פרוטאומיקה בדרגתVWRM107-500G
TRIS, VWR בדרגה טהורה במיוחד0497-5KG
DTT (DL-DITHIOTHREITOL), דרגת ביוטכנולוגיהVWR0281-25G
ברומופנול מלח נתרן כחול ACSVWR0312-50G
גליצרולJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. נוגדן חד שבטי (JL-8)TAKARA632381
צינור חרוטי נטול מים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles