מאמר שיטה

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

DOI:

10.3791/58444

⸱

1 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול לדור של cationic nanoliposomes, אשר מבוססת על שיטת יבש-סרט והוא יכול לשמש עבור הכספת, אספקה יעילה של במבחנה עיבד RNA שליח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של RNA שליח (mRNA)-מבוסס הרפוי עבור הטיפול במחלות שונות הופך יותר ויותר חשוב בגלל החיובי מאפייני במבחנה עיבד mRNA (IVT). עם העזרה של IVT mRNA, דה נובו הסינתזה של חלבון הרצוי יכולה להיגרם ללא שינוי מצב פיזיולוגי תא היעד. יתר על כן, חלבון ביוסינטזה אפשר לשלוט בדיוק בגלל ההשפעה ארעית של IVT mRNA.

עבור תרביות תאים יעיל של תאים, nanoliposomes (NLps) עשוי לייצג רכב משלוח בטוח ויעיל עבור mRNA טיפולית. מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת יעילה ובטוחה cationic NLps המורכב של DC-כולסטרול, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (סמים) כמו וקטור משלוח עבור IVT mRNA. NLps נתקל מוגדרת גודל, התפלגות אחידה, וקיבולת גבוהה complexation, ולא יכול להיות מיוצר בשיטת סרט יבש. יתר על כן, אנו מציגים מערכות בדיקה שונים כדי לנתח את complexation שלהם, תרביות תאים efficacies באמצעות סינתטי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) ה-mRNA, כמו גם את השפעתם על יכולת הקיום התא. בסך הכל, פרוטוקול שהוצגו מספקת גישה יעילה ובטוחה mRNA complexation, אשר עשוי לקדם ולשפר את הממשל של mRNA טיפולית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של mRNA שונה עבור יישומים טיפוליים הראו פוטנציאל גדול האחרונים של שנים. מחלות לב וכלי דם, דלקתיות, monogenetic, כמו גם בפיתוח חיסונים, ה-mRNA הוא מבטיח התרפויטי1.

חלבון בתחליפי עם ה-mRNA מציע כמה יתרונות על פני הטיפול הגנטי הקלאסית, אשר מבוססת על תרביות תאים DNA לתוך תאי היעד2. הפונקציה mRNA יוזם ישירות ב- ציטוזול. למרות את פלסמיד דנ א (pDNA), הבונה של גדילי כפול, מעגלי DNA המכיל אזור יזם רצף גנטי קידוד של חלבון טיפולית3, גם במעשי ציטוזול, זה ניתן רק לשלב לתוך תאים אשר עוברים מיטוזה בזמנו של תרביות תאים. זה מפחית את מספר התאים transfected1,רקמת4. באופן ספציפי, תקנים של רקמות עם פעילות מיטוזה חלש, כגון תאי לב, הוא קשה5. בניגוד pDNA, תרביות תאים של תרגום של mRNA להתרחש mitotic ותאי mitotic ב רקמות1,6. שילוב נגיפי DNA לתוך הגנום המארח עשוי לבוא עם אפקטים מוטגניות או החיסון תגובות7,8, אך לאחר תרביות של תאים תאים עם קידוד החלבון mRNA, דה נובו הסינתזה של החלבון הרצוי מתחיל באופן עצמאי9,10. יתר על כן, ניתן להתאים את סינתזת חלבונים דווקא הצורך של המטופל באמצעות מינונים בודדים, ללא מפריע הגנום ולסכן אפקטים מוטגניות11. הפוטנציאל הפעלת החיסונית של mRNA לאכסון שנוצר יכול להיות הוריד באופן דרמטי באמצעות uridine הדמה ו- 5'-methylcytidine במקום uridine, cytidine12. Uridine מדומה mRNA שונה יש גם הוכח להיות יציבות ביולוגית מוגברת ו translational קיבולת גבוה משמעותית של13.

כדי שתוכל להפיק תועלת מן המאפיינים המבטיח של מבוסס ה-mRNA טיפול ביישומים רפואיים, זה חיוני כדי ליצור הרכב המתאים עבור הובלה של mRNA לתוך התא. הרכב הזה צריך לשאת רעיל מאפיינים במבחנה ויוו, להגן על ה-mRNA נגד נוקלאז השפלה וספק ספיגת הסלולר מספקת זמינות ממושך, תרגום של mRNA14.

בין כל סוגי נושא אפשרי למסירה ויוו סמים, כגון פחמן, נקודות קוונטיות ליפוזומים, האחרון היה למד ביותר15,16. ליפוזומים הם שלפוחית המורכב השומנים bilayer10. הם amphiphilic עם הידרופוביות וכן מקטע הידרופיליות, דרך הסדר עצמית של מולקולות אלה, שכבה כפולה כדורית הוא בנוי17. בתוך ליפוזומים, סוכני טיפולית או סמים יכול להיות אנקפסולציה, לפיכך, מוגן מפני השפלה אנזימטי18. ליפוזומים המכיל N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium כלוריד (DOTMA)19[1, 2-bis (oleoyloxy)-3-פרופאן (trimethylammonio)] (DOTAP)20ו- dioctadecylamidoglycylspermine (כלבים)21, או DC-כולסטרול22, ובכן מאופיין, שימוש תכוף עבור תרביות תאים סלולריים עם ה-DNA או RNA.

ליפוזומים cationic מהווים ליפופרוטאין הטעון חיובית של פוספוליפיד לא טעונים23. תרביות תאים באמצעות ליפוזומים cationic הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור הובלה של חומצות גרעין לתוך תאים24,25. החלקיקים השומנים cationic בצורה מתחמי עם קבוצות פוספט טעונים שלילית עמוד השדרה של מולקולות של חומצות גרעין26. אלה lipoplexes כביכול לצרף פני השטח של קרום התא והזן את התא באמצעות אנדוציטוזה או אנדוציטוזה-כמו-מנגנונים27.

בשנת 1989, מאלון ואח. בהצלחה תיאר cationic בתיווך השומנים mRNA תרביות תאים28. אולם, באמצעות תערובת של DOTMA ושל 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (סמים), הקבוצה מצאו כי DOTMA בא לידי ביטוי תופעות ציטוטוקסיות28. בנוסף, Zohra. et al. הראה כי DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-פרופאן כלוריד) יכול לשמש ריאגנט תרביות תאים mRNA29. עם זאת, עבור תרביות תאים יעיל של תאים, DOTAP אמור לשמש בשילוב עם חומרים כימיים אחרים, כגון fibronectin29 או סמים30. עד כה, DOTMA היה השומנים cationic הראשונה בשוק המשמש עבור משלוח ג'ין31. ליפידים אחרים משמשים להגנה טיפולית או במקצועות בשלבים שונים של ניסויים קליניים (למשל, EndoTAG-אני, המכיל DOTAP כנשא שומנים בדם), כעת נחקרת ב שלב-II קליניים משפט32.

עבודה זו מתארת את פרוטוקול עבור הדור של NLps המכיל כולסטרול DC וסמים. שיטה זו מקלה על ביצוע ומאפשר את הדור של NLps בגדלים שונים. המטרה הכללית של דור NLp שימוש בשיטת סרט יבש היא ליצור ליפוזומים עבור complexation mRNA, ובכך מאפשר את תרביות תאים תאים מסתיימים ויעילה במבחנה14,33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור של Cationic Nanoliposomes (איור 1)

  1. להמיס ליפידים DC-כולסטרול (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] כולסטרול הידרוכלוריד) וסמים (dioleoyl phosphatidylethanolamine), נמסר כאבקה, ב כלורופורם להשגת ריכוז סופי של 25 מ"ג/מ"ל.
    הערה: אחסן את שומנים מומסים ב-20 ° C.
  2. לעבוד עם תמיסת ליפידים שתי מניות 25 מ"ג/מ"ל. µL מיקס 40 של מומס DC-הכולסטרול, µL 80 של הסם מומס בבקבוקון זכוכית.
    הערה: כמות השומנים הכולל הוא 3 מ"ג. כדי למנוע אידוי מהיר של ההרדמה, במקום ליפידים על קרח במהלך pipetting.
  3. לאדות את הכלורופורם למשך 15 דקות תחת תזרים גז ארגון. לאחר מכן, למלא את desiccator של סיליקה ג'ל, למקם את הבקבוק פתוח זכוכית בתוך ולהחיל ואקום למשך הלילה כדי לוודא כי הכלורופורם הנותרים הוא התאדה, סרט השומנים נוצר בתוך הבקבוק זכוכית.
    הערה: עובד מהר, יש להימנע ממגע מיותר של2 O.
  4. נתרענן הסרט השומנים בנוי עם 1 מ"ל של מים נטולי נוקלאז מערבולת המתלה למשך 15 דקות (איור 2 א). לאחר מכן, מניחים את המתלים לתוך אמבט sonication לשעה (איור 2B).
    הערה: ההשעיה תהיה מעט עכורים.
  5. להרכיב את מכבש מיני לפי הוראות היצרן, ממלאים מזרק עם השומנים ההשעיה, ולמקם את המזרק מלא ולא עם מזרק ריק משני צידי המתקן. הקש את השומנים ההשעיה דרך הקרום של מזרק אחד לשני, 20 x – x 25, כדי הבלטת ההשעיה (איור 2C).
    הערה: גודל NLps נקבעת לפי גודל הנקבוביות הקרום משמש.
  6. אחסן את NLps בקבוקון זכוכית ב 4 ° C עד שימוש נוסף.
    הערה: לאחר זמן אחסון ממושך, NLps יוצבו באמבטיה sonication שוב למשך 15 דקות על ידי 35 קילו-הרץ כדי לעקוף את היווצרות מורכבות.

2. במבחנה שעתוק של ה-mRNA סינתטי

  1. להכין את eGFP-הקידוד mRNA בעקבות הפרוטוקול שפורסם מוקדם יותר34.
  2. להגביר את רצף eGFP מ פלסמיד עם 0.7 מיקרומטר פארווערטס (5'-TTG GAC CCT מס רווחי הון ACA גה GCT AAT ACG-3') ולא הפוך (5'-T120 CTT CTT מעשה חטיבתי GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') תחל ופולימראז את קיט עם ה-PCR.
    1. מערבבים µL 20 של פתרון מאגר מסחרי אשר משנה את אופן הפעולה ההיתוך של DNA (טבלה של חומרים), כמו גם µL 20 של המיקס 5 x הערכה פולימראז. להוסיף 7 µL של כל פריימר (ואחורה).
    2. להוסיף 25 ng של פלסמיד eGFP התערובת, 2 µL של פולימראז הערכה פולימראז.
      הערה: לשמור את פולימראז על הקרח לפני pipetting זה הפיתרון.
    3. להוסיף נטולת נוקלאז H2O לתערובת, עד נפח של 100 µL.
    4. להפעיל את מחזורי PCR thermocycler בעקבות פרוטוקול טבלה 1.
  3. לטהר את רצף ה-DNA קידוד eGFP עם ערכת טיהור PCR.
    1. לכן, לערבב את פתרון ה-PCR עם 500 µL מאגר איגוד הערכה ולהשתמש בה כדי למלא עמודות טיהור.
    2. Centrifuge את העמודות במהירות המרבית עבור 1 דקות וזורקים את פילטרט.
    3. הוסף µL 750 מאגר לשטוף את העמודה, צנטריפוגה שוב בקצב המרבי מהירות של 1 דקות, ולמחוק את פילטרט.
    4. חזור על השלב צנטריפוגה 1 x כדי להסיר את המאגר המסנן עמודה.
    5. להעביר את העמודה צינור 1.5-mL טריים.
    6. להוסיף 20 µL של נוקלאז ללא H2O העמודה, תקופת דגירה של 1 דקות, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות המרבית. חזור על שלב זה.
    7. למדוד את הריכוז של ה-DNA עם photometer ואחסן אותו ב-20 ° C.
    8. ביצוע הניתוחים איכות הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. להוסיף 0.5 גר' agarose במאגר טריס-בוראט-EDTA (TBE), לחמם אותו במיקרוגל בחום גבוה עד agarose זה התפרקה לחלוטין.
    9. להוסיף 5 µL של פתרון ג'ל מכתים agarose נוזלי, למלא את הפתרון אל החדר ג'ל והמתן עד הג'ל הוא polymerized.
    10. מיקס 200 ng של ה-DNA עם 2 µL של 6 x בטעינת צבע ומילוי היא אמצעי הקצה של µL 12-Pipette סולם הדנ א, כמו גם את דגימת דנ א, לתוך הבארות ג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה מאובטח ב- 100 וולט.
    11. לנתח את הג'ל באמצעות תחנת ג'ל-ניתוח תחת אור UV.
  4. לרוץ שעתוק במבחנה ליצירת mRNA של רצף הדנ א עם במבחנה שעתוק ערכת המכיל T7-פולימראז, תחליף את נוקלאוטידים ששונה UTP, CTP עם ענבל-UTP, מתיל-CTP.
    1. עבור במבחנה שעתוק, מערבבים את החומרים הבאים בטבלה 2.
      הערה: להחליף 1.5 µL של מתיל-CTP עם 1:10 Cy3-CTP מעורבבת עם H ללא נוקלאז2O במהלך שעתוק במבחנה של eGFP mRNA כדי להשיג Cy3-מצב רוח mRNA.
    2. דגירה המיקס התגובה IVT במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. להוסיף 1 µL של DNase. אני מפולימראז T7 קיט, דגירה זה למשך 15 דקות על ידי 37 ° C כדי לעכל את תבנית ה-DNA.
  5. כדי לטהר את ה-mRNA, להשתמש ערכת ניקיון RNA.
    1. ממלאים את התמהיל IVT לנפח של 100 µL עם H ללא נוקלאז2O.
    2. להוסיף 350 µL של פירוק מאגר, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    3. מוסיפים 250 µL של 100% אתנול ומערבבים שוב. Pipette את התערובת לתוך העמודות ' ניקוי '.
    4. צנטריפוגה 15 s ב- 8,000- g ולהשליך פילטרט של.
    5. להוסיף 500 µL של המאגר כביסה לעמודה, צנטריפוגה שוב על 15 s ב- 8,000 x gוהסר פילטרט של.
    6. לשטוף את העמודה 1 x עם 500 µL של המאגר לשטוף, צנטריפוגה למשך 2 דקות ב x 8000 g.
    7. להעביר את העמודה לתוך צינור התגובה 1.5-mL טריים. Elute את ה-mRNA 2 x על ידי דגירה 1-מין של 20 µL של נוקלאז ללא H2O בממברנה עמודה, ואחריו צנטריפוגה 1-מין במהירות המרבית.
  6. הסר את קבוצות פוספט mRNA באמצעות ערכת dephosphorylation. להוסיף µL 4.5 מאגר פוספטאז x 10 ו- 1 µL של פוספטאז mRNA, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  7. לטהר את ה-mRNA שוב, בצע את הפעולות 2.5.1 - 2.5.7.
  8. למדוד את concertation mRNA עם photometer.
  9. להשתמש בג'ל כדי לנתח את הטוהר ואת גודל mRNA. לכן, להכין עם ג'ל agarose כמתואר בצעדים 2.3.9 - 2.3.10.
    1. 3.3 מיקס µL formamide, µL 1 של 37% פורמלדהיד, µL 1 של 10 x גברים, µL 1.7 של 6 x טוען לצבוע עם 200 ng של mRNA ממלאים אותו עד 10 µL נטולת נוקלאז H2O עבור כל דגימה ו RNA סמן.
    2. דגירה המיקס 10 דקות ב 65 ° C עבור ה-mRNA דנטורציה. לטעון הבארות של הג'ל עם ה-mRNA, סמן RNA ולהפעיל את הג'ל מאובטח ב- 100 וולט.
    3. לנתח את הג'ל באמצעות תחנת דוק ג'ל עם אור UV.

3. complexation של mRNA סינתטי

  1. להפשיר את mRNA סינתטי בקרח, מערבולת שזה, צנטריפוגה זמן קצר לפני לפתוח את הצינור.
  2. מיקס 10 µL של mRNA סינתטי (ריכוז ה-mRNA הוא 100 ng/µL) עם 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL או 20 µL של NLp השעיה (ריכוז NLp הוא 3 מ"ג/מ"ל). צנטריפוגה בקצרה, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עבור מבנה nanolipoplex.
    הערה: אל תערבב בין על-ידי pipetting. זה יכול להוביל אובדן נפח. מערבולת זמן קצר עבור ערבוב יסודי.
  3. להוסיף 1 מ"ל של תא רגיל בינוני nanolipoplexes ומערבבים אותם על-ידי pipetting למעלה ולמטה.

4. ניתוח של יעילות כימוס Nanoliposomes

  1. כדי לבצע את הניסויים כימוס, להשתמש בערכה כימות RNA.
  2. הכן את הפתרון עובד על ידי דילול של 1:200 הפלורסנט עבור מגוון גבוהה ו- 1:2,000 עבור וזמינותו נמוכה-טווח.
    הערה: להפשיר את הפלורסנט על קרח. הכינו את הפתרון עובד ישירות לפני השימוש.
  3. להכין את טווח גבוה וטווח נמוך רגיל עקומות באמצעות 1 מ"ל של פתרון 2 µg/mL במלאי של eGFP mRNA ב H נטולת נוקלאז2O.
    הערה: על העיקולים רגיל, השתמש mRNA שישמש בניסויים אנקפסולציה.
  4. השתמש בטבלה 3 עבור הכנת תקן גבוהה-טווח (20 ng/mL-µg 1/mL).
  5. על תקן נמוכה-טווח, לדלל eGFP 2 µg/mL mRNA מניות פתרון 1:20 להשגת ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל. להכין תקן נמוכה-טווח (1 ng/mL - 50 ng/mL) כפי שמתואר בטבלה 4.
  6. לשלב 1 µg של eGFP ה-mRNA (10 µL) ו- 7.5 µg של NLps (2.5 µL) דגירה במשך 20 דקות ב- RT.
    הערה: לשמור את ה-mRNA על קרח כדי למנוע השפלה.
  7. להוסיף 1 מ"ל של נוקלאז ללא H2O טופס nanolipoplexes, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  8. להוסיף 1 מ"ל של 1:200 או 1:2,000 של הפתרון עובד של RNA הפלורסנט דגימות שעברו אנקפסולציה, תקנים, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT בחושך.
  9. Pipette את הסטנדרטים ודוגמאות שבו כפילויות לתוך צלחת 96-ובכן שחור ולמדוד את זריחה ב- 530 ננומטר על קורא microplate (איור 3).

5. הכנה של התאים תקנים

  1. צלחת 1.5 x 105 A549 תאים/טוב של צלחת 12-ובכן 1 י לפני תרביות תאים.
  2. תקופת דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תא רגיל בינוני (גלוקוז DMEM/גבוהה עם 10% עוברית שור סרום [FBS], 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) של 24 שעות לפני תרביות תאים.

6. תרביות תאים של תאי

  1. לשטוף את מוכנה תאים x 1 עם mL 1/PBS טוב (בלי Ca2 /Mg2 +).
  2. להוסיף 1 מ"ל של תערובת nanolipoplex מוכן, המכיל µg 1 של ה-mRNA מקופל לתוך 1-µL, 2.5-µL, 5-µL, 10-µL או NLps 20-µL, אל באר אחת של צלחת מוכנה עם תאים A549 eGFP.
  3. להוסיף את המתלים nanolipoplex לתאים, דגירה על התנאים הקבועים במשך 24 שעות ביממה לנתח את היעילות תרביות תאים, או במשך 24 שעות ביממה ו- 72 h כדי לנתח את הכדאיות תא לאחר תרביות תאים.
    הערה: תרביות תאים עם NLps לא דורשת את שינוי בינוני.

7. ניתוח של תאים תקנים יעילות Cytometry זרימה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

  1. הסר את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל/טוב PBS (ללא Ca2 +/Mg2 +) כדי להסיר את NLps הנותרים.
  2. להכין את התאים cytometry זרימה.
    1. Trypsinize התאים עם 500 µL/טוב טריפסין/EDTA (0.05%) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות להפסיק את התהליך, בטל את טריפסין על-ידי הוספת כמות זהה (500 µL טוב) של בינוני המכילים FBS רגיל.
    2. Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב x 400 גרם , הסר בזהירות את תגובת שיקוע בלי לגעת בגדר התא.
    3. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS (ללא Ca2 /Mg2 +).
    4. Resuspend תאי µL 300 בפתרון קיבוע 1 x ולהעביר את התאים לתוך צינורות cytometry זרימה.
    5. לנתח את התאים-488 ננומטר ב cytometer זרימה (איור 4A).
      הערה: מערבולת התאים 1 x ישירות לפני מדידה.
  3. להכין את התאים פלורסצנטיות מיקרוסקופ.
    1. לתקן את התאים עם 1 מ ל/טוב 100% מתנול, אשר אוחסן בעבר ב-20 ° C.
    2. להוסיף 500 nM µL/טוב 300 דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) התפרקה ב- PBS (ללא Ca2 +/Mg2 +), תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.
    3. הסר את הפתרון דאפי ולשטוף את התאים שוב עם 100% מתנול המאוחסנים ב-20 ° C.
    4. לנתח את התאים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 4B).
      הערה: השתמש אורכי הגל עירור/פליטה הבאים: eGFP 488/509 ננומטר, דאפי 358/461 nm ו Cy3 550/570 ננומטר.

8. תא הכדאיות Assay

  1. להמיס 5 מ"ג של MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד) 1 מ"ל של RPMI (ללא פנול אדום).
    הערה: MTT מומס חייב להיות עוד יותר 1:10 מדולל (הריכוז הסופי: 0.5 מ"ג/מ"ל) ב- RPMI לפני השימוש.
  2. לשטוף את התאים transfected 3 x עם 1 מ ל/טוב PBS (ללא Ca2 +/Mg2).
    הערה: השרידים של המדיום תא רגיל לחלוטין להסירם.
  3. להוסיף 500 µL/טוב של 1:10 מדולל MTT פתרון על התאים ואת תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. להסיר את הפתרון MTT מתאי לאחר דגירה ולהוסיף µL 500/דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) טוב. דגירה שוב 10 דקות ב 37 º C.
  5. Pipette הפתרון דימתיל סולפוקסיד ברחם לתוך צלחת 96-ובכן ברור-התחתון ולמדוד את ספיחה-540 nm באמצעות קורא microplate.
  6. הגדר את הכדאיות של התא ללא טיפול ב- 100% ולחשב את הכדאיות תא של קבוצות אחרות לעומת תאי בקרה ללא טיפול (איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול כמתואר, NLps המורכב של ליפידים DC-כולסטרול וסמים הוכנו באמצעות השיטה יבש-סרט (איור 1). במהלך ההכנות, הפתרון nanoliposome מציג שלבים שונים עכירות (איור 2).

ניתן ואז לנתח את היעילות כימוס של NLps לאחר העטיפה של µg 1 של mRNA קידוד eGFP על-ידי ניתוח הסכום חינם של mRNA, אשר היה לא עוברת אנקפסולציה, באמצעות ערכת כימות RNA (איור 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הציג מתאר את הדור של NLps עם יעילות גבוהה כימוס של mRNA לאכסון שונה, כמו גם של תרביות תאים אמין של תאים במבחנה. יתר על כן, NLps להבטיח את שחרורו של mRNA, אשר בתורו, מתורגם חלבון פונקציונלי בתוך התאים. בנוסף, transfections באמצעות NLps יכול להתבצע במדיום תא רגיל, וכתוצאה מכך גבוהה תא viabilities במהלך תרביות תאים, והאחרונה עד שלושה ימים לאחר תרביות תאים.

להשתמש mRNA טיפולית, עצמי בהרכבת מערכת העברת היא עדיפה. ריאגנטים הנפוץ ביותר תרביות תאים כוללים cationic שומנים, כולל ליפוזו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, דרמשטדט, גרמניהA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]כולסטרול הידרוכלוריד (DC-כולסטרולAvanti, אלבמה, ארה"ב700001
4  ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניהD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, היידלברג, גרמניה
Cell Fix (10x)BD Biosciences, היידלברג, גרמניה340181
ChloroformMerck, דרמשטדט, גרמניה102445
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, היידלברג, גרמניה20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, אלבמה, ארה"ב850725
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeiss Axio, Oberkochen, גרמניה
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה11668019
מיני מכבשAvanti, אלבמה, ארה"ב
מים נטולי נוקלאזQiagen, הילדן, גרמניה129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה11058021
מאגר PBS (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה70011044
ערכת ריאגנט RNA Quant-iT Ribo GreenThermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניהQ33140
RPMI (עם פנול אדום)Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה11835030
ג'ל סיליקהקארל רוט, קרלסרוהה, גרמניהP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה25300054
HotStar HiFidelity PolymeraseKit Qiagen, הילדן, גרמניה202602
ערכת טיהור PCR QIAquickQiagen, הילדן, גרמניה28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, סן דייגו, ארה"בN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, סן דייגו, ארה"בN-1014
ציאנין 3-CTPPerkinElmer, בייסוויילר, גרמניה
RNeasy Mini KitQiagen, הילדן, גרמניה74104
ערכת תמלול MEGAscript T7Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניהAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G מבנה כובע RNA אנלוגימעבדות ביולוגיות ניו אינגלנד, איפסוויץ', ארה"בS1411L
פוספטאז אנטארקטיחדש England Biolabs, איפסוויץ', ארה"בM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה16500-500
GelRedBiotium, פרמונט, ארה"ב41003
peqGOLD DNA סולםתערובת VWR, פנסילבניה, ארה"ב25-2040
Invitrogen 0.5-10kb סולם RNAפישר סיינטיפיק, Gö teborg,
שבדיה		11528766
)NEL580001EA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cationic NanoliposomesmRNA DeliveryDry Film MethodExtrusion TechniqueFlow CytometryFluorescence MicroscopyDC CholesterolDOPEeGFP mRNACell Viability

מאמרים קשורים