מאמר שיטה

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

DOI:

10.3791/58448

⸱

7 בינואר 2019

 , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. יעד מרכזי של רפואה רגנרטיבית היא לחדש את שריר הלב מת לאחר MI. למרות מספר אסטרטגיות שימשו להתחדש שריר הלב, טיפול בתאי גזע נשאר בגישה הגדולות כדי לחדש את שריר הלב מת הלב MI. לצבירת ראיות מצביע על הנוכחות של תאי גזע לב תושב (CSCs) בלב למבוגרים, ההשפעות שלהם אנדוקרינית ו/או paracrine על התחדשות לב. עם זאת, בידוד CSC, שלהם אפיון ובידול לכיוון תאי שריר הלב, במיוחד cardiomyocytes, נותר אתגר טכני. במחקר הנוכחי, סיפקנו שיטה פשוטה עבור בידוד, אפיון, הבידול של CSCs מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה הדרגתי של צפיפות בידודו של CSCs, היכן הלב הוא מתעכל על ידי פתרון II collagenase 0.2%. כדי לאפיין את CSCs מבודדים, הערכנו את הביטוי של סמנים CSCs/לב Sca-1, NKX2-5 ו- GATA4, סמנים pluripotency/stemness OCT4, SOX2 ו- Nanog. אנחנו גם לקבוע את הפוטנציאל התפשטות של CSCs מבודדים על ידי culturing אותם בצלחת פטרי והערכה הביטוי של דה מרקר התפשטות Ki-67. להערכת פוטנציאל התמיינות של CSCs, בחרנו CSCs שבע עד עשר דקות ימים תרבותי. נוכל להעביר אותם צלחת חדשה עם מדיום בידול cardiomyocyte. הם מודגרת ב חממה תרבות התא במשך 12 יום, ואילו המדיום בידול משתנה כל שלושה ימים. CSCs הבדיל אקספרס סמנים ייחודיים cardiomyocyte: actinin, טרופונין אני. לפיכך, CSCs מבודדים עם פרוטוקול זה יש stemness וסמנים לב, שיש להם פוטנציאל התפשטות ובידול לכיוון השושלת cardiomyocyte.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת לב איסכמית, כולל אוטם שריר הלב (MI), היא הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי גזע, ולשם רגנרציה שריר הלב מת נשאר בגישה הגדולות כדי לשפר את תפקוד הלב MI הלב2,3,4,5. סוגים שונים של תאי גזע שימשו כדי לחדש את שריר הלב מת וכדי לשפר את תפקוד הלב הלב MI. הם יכולים להיות בהרחבה מחולקת6 תאי גזע עובריים ותאי גזע למבוגרים. בתאי גזע בוגרים, סוגים שונים של תאי גזע היו בשימוש, כמו7,תאי תאי מח עצם-derived8, גזע mesenchymal שמקורם במח העצם9,10, רקמת שומן 11,12, ואת הטבור13ו-14,CSCs15. תאי גזע יכולים לקדם התחדשות לב עד אנדוקרינית ו/או paracrine פעולות16,17,18,19,20. עם זאת, מגבלה עיקרית של טיפול בתאי גזע הוא קבלת מספר תאי גזע יכולים להתרבות ו/או להבדיל לכיוון ספציפי השושלת לב21,22. השתלת עצמיים, allogenic של תאי גזע הוא אתגר חשוב טיפול בתאי גזע9. CSCs יכול להיות שיטה טובה יותר עבור התחדשות לב כי הם נגזרים מתוך הלב, הם יכול להיות בקלות רבה יותר מובחן שושלות לב מאשר בתאי גזע ללא דום לב. לכן, זה מקטין את הסיכון של טרטומה. בנוסף, ההשפעות האנדוקריניות, paracrine של CSCs, כגון exosomes ו- miRNAs נגזר על CSCs, יכול להיות יעיל יותר מאשר סוגים אחרים של תאי גזע. לפיכך, CSCs נשאר אפשרות טובה יותר עבור התחדשות לב23,24.

למרות CSCs מועמד טוב יותר עבור התחדשות לב ליבה MI בשל מוצאם הלב, מגבלה עיקרית עם CSCs הוא פחות תשואה בגלל חוסר של שיטת בידוד יעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות הבידול לקוי של CSCs כלפי cardiomyocytes שושלת היוחסין2,25,26,27. כדי לעקוף את המגבלות האלה, חשוב לפתח פרוטוקול יעיל בידוד CSC, אפיון של בידול לכיוון הלב השושלת. אין סמן מקובל יחיד עבור CSCs, ספציפי תא-פני המבוסס על סמן בידוד של CSCs מניב פחות CSCs. כאן, אנחנו לתקנן בגישה פשוטה צנטריפוגה מעבר צבע כדי לבודד CSCs מהלב העכבר זה היא חסכונית ותוצאות תשואה מוגברת של CSCs. CSCs מבודדים אלה ניתן לבחור עבור סמני משטח תאים ספציפיים על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית לקצר. בנוסף CSCs בידוד, סיפקנו פרוטוקול תרבות CSC, אפיון של בידול כלפי השושלת cardiomyocyte. לפיכך, אנו מציגים שיטה אלגנטית כדי לבודד, לאפיין, תרבות, להבדיל CSCs העכבר למבוגרים לבבות (איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיור, הרדמה, ושל הקרבה של עכברים בוצעו בעקבות הפרוטוקול IACUC המאושרים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

1. חומרים

  1. שחור C57BL/6J לשימוש 10 - עד השבוע ה-12, עכברים זכרים, כל הזמן ללא צורך במיקור חוץ במתקן בעל חיים מוסדיים, עבור בידודו של CSCs. CSCs יכול גם להיות מבודד עכברים אישה שאינה בהריון.
  2. לעקר את כל הדרוש מכשירי הניתוח, לרבות מספריים כירורגיים, מספריים כירורגיים בסדר, shank מעוקל מלקחיים להב כירורגי, על ידי autoclaving לפני המתת החסד של העכבר.
  3. להכין CSC מאגרי בידוד במצב סטיריליים ואחסן אותם ב 4 ° C על קרח. מאגרים אלה כוללים polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון מותאם צפיפות של 1.077 g/mL, של Dulbecco לא שלם שונה בינוני של הנשר, 1 x של מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), ונקניק תא תרבות כיתה 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). להכין 1% collagenase II מניות פתרון (מסונן, עיקור) הפתרון עובד 0.2% ב- HBSS.
  4. שומרים שהחומרים תרביות רקמה במצב מעוקר ב אבטחה הקבינט, כולל צלחת פטרי 10 מ מ, צלחת 6-ובכן, צלחת 24-ובכן, T-25, T-75 תרבות מבחנות, צינורות חרוט 15-mL ו- 50-mL פיפטות סרולוגית חד פעמיות עם 40-מיקרומטר ו- 100 -strainers תא מיקרומטר עם מסננים 0.22-מיקרומטר.
  5. לחטא את 10-µL, 200-µL ועצות 1,000-µL פיפטה על ידי תא לחץ.
  6. להשתמש ללא אבקת nitrile כפפות ו-70% אתנול כדי לשמור על מצב סטרילי לאורך כל הניסוי.
  7. משתמשת במלבין 10% כמו חיטוי.
  8. השתמש זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינונית, cardiomyocytes בידול בינוני על התרבות ועל הבידול של CSCs, בהתאמה.

2. שיטת בידוד תאי גזע לב

  1. המתת חסד גבר בוגר ארבעה עד חמישה (או אישה שאינה בהריון) עכברים באמצעות תא2 CO. לתקן הזרועות של העכבר בכל על קרטון ניתוח נפרד עם סיכות או קלטות דביק.
  2. תרסיס אתנול 70% על העכבר להיפטר מחיידקים חיצוניים ולשמור על התנאי סטיריליים במהלך קציר של הלב. אעשה חתך עם מספריים באמצע הבטן וחותכים את העור מן הבטן אל החזה בקו ישר. מסירים את העור משני צידי החתך האמצעי כדי לנקות את אזור הבטן של העור, שערות. באמצעות פינצטה ומספריים, חותכים את הסרעפת מתחת קשת הצלעות.
  3. פתח את חלל בית החזה של העכבר על ידי חיתוך קשת הצלעות בתוך המנוע. לחשוף את הלב ולהסיר את הדם ליד הלב. יש לשטוף את האזור שסביב הלב עם קרה כקרח PBS להיפטר דם באזור הלב.
  4. לנתח את הלב באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. מקום בלב בצלוחית 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
  5. Palpitate הלב באמצעות מלקחיים shank מעוקל ולהסיר את שאריות הדם בתוך הלב.
  6. להשתמש בלב שלם ניתוקה של CSCs.
  7. העברת כל ארבע או חמש לבבות כל צינור חרוטי 50-mL המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשמור את הצינורית על הקרח עד עיבוד נוסף.
  8. נגב האחורה של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ליצירת סביבה מעוקר. לעקר את הצינור המכיל הלב וחומרים נדרשים אחרים עם 70% אתנול. למקם את הצינור המכיל הלב אבטחה הקבינט עיבוד נוסף.
  9. להעביר את הלבבות צלחת פטרי 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשטוף את הלבבות שוב על-ידי palpating כדי להסיר שאריות דם בתוך הלב. לשנות את הפתרון HBSS לשטוף אחרי זה כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם.
  10. חותכים את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית בצלוחית 100-מ מ המכיל 5-7 מ של פתרון HBSS. להחזיק כל לב עם זוג מלקחיים ולהשתמש זוג מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית כדי לחתוך את הלב לחתיכות 2 כדי 4-מ מ. לשנות את הפתרון HBSS בתדירות גבוהה כדי להבטיח HBSS ודוחף. מינצ הלבבות בפתרון HBSS.
  11. Centrifuge הרקמה טחון ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע ולשמור בגדר.
  12. Resuspend בגדר ב- 5-6 מ"ל של 0.2% collagenase II פתרון צינור חרוטי 50-mL. עוצמת הקול של collagenase פתרון צריך להיות כמעט 1.5 - ל שתיים פי לנפח של בגדר.
    הערה: למערכת העיכול של רקמות, collagenase 0.2% ו- 2.5 U/mL dispase פתרון יכול להחליף 0.2% collagenase II. השתמש אמצעי כמעט שווה לפתרון dispase collagenase לי פתרון.
  13. ביסודיות מערבבים בגדר 0.2% collagenase II פתרון על-ידי לזעזע את הצינורית או נדנדה את הצינורית על מטרף ב 75 x g למשך 45-60 דקות ב 37 º C. לנער את הצינור נמרצות על ידי היד לאחר כל 20-30 דקות כדי לשפר את פירוק.
  14. Triturate את המיקס רקמת lysed באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ ל, עצה 1-mL פיפטה מביצועם הגוש רקמה לתוך התליה תא בודד.
    הערה: כדי להשיג התאוששות מקסימלית של CSCs, triturate את המיקס פירוק לפחות 5 דקות. אם הרקמה הגושים הם יחסית גדול, חותכים את קצה טיפ 1-mL פיפטה עם מספריים או סכין כירורגית ולהשתמש בו עבור trituration.
  15. לעצור את פירוק אנזימטי של הרקמה על ידי הוספת זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני. הוסף כמעט 2-3 x בינוני תחזוקה כמה שיותר נפח הרקמה lysed בשלב 2.14.
  16. עוברים התליה תא מתעכל מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל חתיכות רקמה מעוכל.
  17. חזור על שלב 2.16 באמצעות מסננת תא 40-מיקרומטר.
  18. להפריד את התאים באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. לצורך הקמת מכשול ההפרדה של תאים, בעדינות כיסוי של נפח שווה פילטרט של מעל polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון. לדוגמה, הוסף תחילה, 20 מ של פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן בצינור חרוט 50-mL ולאחר מכן, להוסיף 20 מ של פילטרט של מהשלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן.
    הערה: Prewarm polysucrose ופתרון diatrizoate נתרן ב 37 מעלות צלזיוס לפני להשתמש עם התאים. הוסף את פילטרט של שלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן מאוד לאט ובזהירות כדי למנוע כל ערבוב של שני הפתרונות. זה נחשב צעד מכריע.
  19. Centrifuge את הצינור המכיל שני פתרונות ב x 500 g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה דלי הנדנדה. להגדיר לצנטריפוגה במהירות האצה והאטה נמוך יותר כדי למנוע ערבוב של שני פתרונות עבור הפרדה נכונה CSCs. זהו שלב חשוב בבידוד CSC. לשים את הצינור המכיל את התערובת הדרגתיות לאט מאוד ללא הפרעה בתוך לצנטריפוגה ולהגדיר אותו עבור צנטריפוגה.
  20. . תוציא את המעיל באפי יחד עם פתרון נוסף מהשכבה העליונה באמצעות פיפטה 1-mL או פיפטה פסטר פלסטיק צינור סטיריליים 15-mL שכבה זו באפי יכיל את CSCs.
    הערה: יזהרו במהלך pipetting של מעיל באפי לא להוציא השכבה פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן כי זה רעיל CSCs.
  21. להוסיף אמצעי שווה של CSC תחזוקה בינוני התליה תא מהשלב 2.20 ומערבבים אותו כראוי כדי לנטרל משקעי polysucrose של נתרן diatrizoate פתרון, אם קיים.
  22. Centrifuge התליה תא לעיל ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  23. Resuspend בגדר ב 7-10 מ"ל של מדיום DMEM לא שלם, centrifuge זה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להיפטר כל שיורית polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון.
  24. לאסוף את צניפה, אשר מכיל את CSCs מטוהרים.
  25. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של CSC תחזוקה בינוני, לספור את מספר CSC, ולהשתמש בגדר של תרבות. כדי לספור את מספר CSC, השתמש Trypan blue מכתים של hemocytometer. עם ארבעה לבבות עכברים זכרים, התשואה של CSCs הוא ~1.8 מיליון.
  26. זרע CSCs בצלחת 6-ובכן תרבות מצופה פתרון ג'לטין 0.02% המכיל fibronectin 0.5%. השתמש 2 מ של תחזוקה מלאה בינוני זריעה. דגירה לצלחת תרבות בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  27. החלף את המדיום של תרבות CSCs מלאה CSC תחזוקה בינוני כל יום עד היום השלישי. לאחר מכן, לשנות את המדיום לסירוגין.
  28. לקבוע את הצמיחה של CSCs על ידי התבוננות אותם תחת מיקרוסקופ.

3. תרבות מעבר של תאי גזע לב ותחזוקה

  1. תרבות CSCs מבודדים במדיום אחזקה זמינים מסחרית. החלף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינוני לסירוגין. כאשר התרבות CSC הגיעה confluency, להעביר את CSCs צלחת חדשה מצופה עם הג'לטין ואת fibronectin, כפי שהוזכר בשלב 2.26. לנתק את CSCs בתרבית על-ידי מאגר דיסוציאציה תא אנזימטיות. בצע הפרוטוקול הסטנדרטי של דיסוציאציה התא לצלחת תרבות. בשלב זה, CSCs נחשבים-מעבר שלב 0 (P0).
  2. תרבות CSCs P0 בג'לטין חדש וצלחת מצופים fibronectin במדיום תחזוקה CSC מלאה ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%, מאפשרים להם להיות confluent ולאחר מכן בצע צעד 3.1 להיכנס מעבר 1 (P1) CSCs. חנות P1 CSCs חנקן נוזלי או להשתמש בהם עבור החוויה הקצאות.
  3. זרע 0.5 מיליון תאים צלחת. ובכן 6 או 1 מיליון תאים T-25 כדי לשמור על התרבות CSC בשלב הראשוני שלה.
  4. המעבר CSCs כאשר הם הופכים confluent 85%-90%. CSCs יכול להיות מחונן במדיום תחזוקה ועד ארבעה עד שישה שבועות
    הערה: לשמור על צפיפות זריעה הראשונית של CSCs גבוה יחסית (40% - 50%), כי בזריעה צפיפות נמוכה יותר, CSCs עשויות להשתנות המורפולוגיה שלהם שטוח וארוך.

4. אפיון של תאי גזע לב

  1. כדי לאפיין את CSCs בתרבית, לצפות בהם תחת ניגוד phage או מיקרוסקופ שדה בהיר. מניחים את הצלחת המכילות CSC על המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגדר את רמת ההגדלה נמוך למדי (10 X) כדי למקד את התאים. השתמש שלב חדות צמצם כדי לבחון את התאים. העלאת מידת ההגדלה ל- 20 X על-ידי שינוי העדשה המטרה תמונה CSCs. גידול המטרה 40 X, תמונה של CSCs. בעוד יומיים, CSCs מופיעים כמעט עגול צורה, אבל הגודל של התא גדל עם הזמן, בשבעה ימים, CSCs מופיעים כמעט גלילי במצב (איור 1 א' - ג' 1).
  2. לבצע immunostaining של CSCs עם סמנים של pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 או Nanog), התפשטות (Ki-67) (איור 2 א - 2D), הלב מוצא/ובתאים (Sca-1, NKX2-5 או GATA4) (איור 3 א - 3 C).
    1. עבור, immunostaining של CSCs הזרעים CSCs 10,000 לתוך צלחת 24-ובכן תרבות.
    2. למחרת (אחרי ה' 18-24), לתקן את CSCs µL 300 של 4% paraformaldehyde למשך 10 דקות.
    3. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    4. Permeabilize את CSCs עם µL 300 של 0.2% טריטון X-100 מדולל ב- PBS למשך 10 דקות.
    5. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    6. לבצע חסימת CSCs עם µL 300 של BSA 1% מעורבבת עם PBST (PBS + 0.1% Tween 20) או µL 300 של נסיוב עוף רגיל 10% מעורבבת עם PBST לשעה.
    7. דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון בן לילה ב 4 º C. לדלל נוגדן ראשוני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.
    8. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    9. דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון (ראה שלב 4.2.6) לשעה בטמפרטורת החדר. לדלל הנוגדן משני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.
    10. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    11. Counterstain את CSCs עם µL 200 של דאפי (1 µg/mL) מדולל ב- PBS במשך 5 דקות.
    12. לשטוף את CSCs 1 x עם µL 500 ל- PBS קר כקרח. לאחר מכן, מוסיפים 300 µL ל- PBS קר כקרח מכל קידוח.
    13. לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה. בצע את ההוראות של פלורסנט הדמיה, כגון להימנע אור ישיר על הצלחת. לקחת את הצלחת תרבות מתחת למיקרוסקופ. מקדו את התאים בהגדלות שונות. לבחון את התאים תחת שלב ניגוד ו/או מסננים שונים עירור ולשמור את התמונות.
    14. לאחסן את הצלחת בחושך ב 4 º C.

5. התמיינות של תאי גזע הלב לתוך Cardiomyocyte

  1. עבור הבידול של CSCs, זרע 500,000 CSCs בצלחת 6-ובכן עם 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני.
  2. דגירה לצלחת המכילה את CSCs ב חממה2 CO ב 37 º C. אפשר את CSCs לצרף להתרבות עד צמיחה תת confluent. אם המדיום לצהוב, להחליף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינונית.
  3. ב- 85% - 90% confluency, להחליף את המדיום תחזוקה 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) cardiomyocytes בידול בינוני. דגירה על צלחת חממה2 CO ב 37 ° C עד 2-3 שבועות.
  4. לשנות את המדיום בידול ד כל 2-3 להתבונן המורפולוגיה של CSCs תחת מיקרוסקופ בכל פעם במהלך המדיום לשנות על מנת להבטיח את התנאים תרבות טובה.
  5. לאחר 12 d של CSC תרבות במדיום בידול, התמונה CSCs עבור סמני בידול בעקבות immunostaining סטנדרטי של פרוטוקול (ראה שלבים 4.2.1 - 4.2.14). שמור את התמונות פלורסנט עבור הביטוי של סמנים cardiomyocytes (איור 4A - 4B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר הנוכחי, אנחנו מבודדים CSCs מ- 10 עד 12-בת C57BL/6J עכברים זכרים לבבות. . הנה, הוצגו שיטה פשוטה עבור CSC בידוד ואפיון באמצעות סמנים של pluripotency. אנחנו גם הציג שיטה אלגנטי עבור בידול CSC, אפיון CSCs זה הבדיל לכיוון cardiomyocytes השושלת. הבחנו מורפולוגיה צורת פלך של 2 עד 3-ימים-תרבותי CSCs במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1A ו 1B). מצאנו את שינוי המבנה של CSCs ב 7 ימים של תרבות תחזוקה בינוני, אשר במהלכו הופכים תאי גזע מאורך (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן השלבים הקריטיים של הפרוטוקול בידוד CSC. 1) תנאי סטיריליים חייבות להישמר לחילוץ של הלבבות של העכברים. כל זיהום במהלך החילוץ הלב עלול לסכן את איכות CSCs. 2) הדם להסירו לחלוטין לפני הא הלב, אשר נעשה על ידי מספר שוטף של כל הלב והלב חלקים עם HBSS פתרון. 3) החלקים הלב חייב להיות lysed לחלוטין להשעיה תא בודד עם פתרון collagenase. 4) חייב להיות prewarmed polysucrose, סודיום diatrizoate הדרגתיות הפתרון עבור הפרדת התאים. 5) חייב להיות prewarmed המדיום לתרבות CSC. 6) הנהרות CSCs במהלך זריעה בקערה תרבות צריך להיות גבוה, כי ב- c...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת, חלקים, המענקים מכוני הבריאות הלאומיים HL-113281 ו- HL116205 כדי פאראס קומאר מישרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>עכבריםמעבדת ג'קסון, ארה"במלאי מס' 000664
<חזק>נוגדנים:
OCT4-Abcamab18976 (פוליקלונל ארנב)OCT4-נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה
SOX2Abcamab97959 (פוליקלונל ארנב)SOX2 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
NanogAbcamab80892 (פוליקלונל ארנב)Nanog - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
Ki67Abcamab16667 (פוליקלונל ארנב)Ki67 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
Sca IMilliporeAB4336 (פוליקלונל ארנב)Sca I נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (פוליקלונל עזים)NKX2-5 - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה
GATA4Abcamab84593 (פוליקלונל ארנב)GATA4 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
MEF2Cסנטה קרוזsc-13268 (פוליקלונל עזים)MEF2C - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
טרופונין IMilliporeMAB1691 (חד שבטי עכבר)טרופונין I - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה
חוסמתאקטיניןמיליפורMAB1682 (חד שבטי עכבר)נוגדן אקטינין-ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
ANPMilliporeAB5490 (פוליקלונלי עכבר)ANP - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת
אלכס פלואור-488 בדוק אנטי ארנבטכנולוגיית חייםמס' A21441
אלכס פלואור-594 עז נגד ארנבטכנולוגיית חייםמס' A11012
אלכס פלואור-594 ארנב נגד עזיםטכנולוגיית חייםמס' A11078
אלכס פלואור-488 בדוק נגד עכברטכנולוגיית חייםמס' A21200
אלכס פלואור-594 בדוק אנטי עזטכנולוגיית חייםמס' A21468
שםחברהCatalog NumberComments
מדיום תרבית:
CSC מדיום תחזוקהMilliporeSCM101הערה: עבור תרבית CSC, PBS או מדיום DMEM לא שלם שימש לשטיפת התאים
מדיום התמיינות קרדיומיוציטיםMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompany>Catalog Number>Comments
>מאגר בידוד תאים:
פוליסוכרוז ותמיסת נתרן דיאטריזואט (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
קולגנאז ISigmaC0130
תמיסת DispaseSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
<חזק>ריאגנטים אחרים:
BSASigmaA7030
סרום בדיקה רגילמעבדת וקטורS3000
תמיסת DAPIApplichemA100,0010Dapi, ריכוז עבודה-1 ומיקרו; גרם/מ"ל
טריפן כחולBiorad145-0013
טריפסיןסיגמאT4049
StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאיםתרמו פישרA1110501
פורמלדהידסיגמא158127
טריטון X-100אקרוסCas מס' 900-293-1
טווין 20פישר סינטיפיקפריט מס' 160170
אתנולתרמו מדעי
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>חומרי תרבית רקמות:
100 מ"מ צלחת פטריתרמו סיינטיפיק
צלחת 6 בארותThermo Scientific
צלחת 24 בארותThermo Scientific
T-25 בקבוקThermo Scientific
T-75 בקבוקThermo Scientific
15 מ"ל צינור חרוטיThermo Scientific
50 מ"ל צינור חרוטיThermo Scientific
40 ומיקרו; מכתים תאים mפישר סיינטיפיק22363547
100 ומיקרו; מכתים תאים mפישר סיינטיפיק22363549
0.22 ומיקרו; m מסנןפישר סיינטיפיק09-719C
10 מ"ל מזרקBDRef מס' 309604
10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L קצות פיפטהפישר סיינטיפיק
5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטה מפלסטיק חד פעמיתרמו מדעי
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>מכשירים
מכונת צנטרופוגהThermo ScientificLEGEND X1R צנטריפוגה
EVOS מיקרוסקופ טכנולוגייתחיים מונה
תאים אוטומטיBiorad
שקופית ספירת תאיםBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 מילוי
<חזק>שם< חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>מכשירים כירורגיים:
מספריים כירורגייםכלי מדעי משובח מספריים
כירורגיים עדיניםכלי
עקומת שוק מלקחייםכלי מדעי משובח
להב כירורגימדעי משובח
פיפטמדעי משובח כלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162(2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265(2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75(2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiac Stem CellsCSC IsolationDensity GradientTissue DigestionCollagenase IICell CharacterizationMarker ExpressionDifferentiation ProtocolCardiomyocyte DifferentiationCell Proliferation

מאמרים קשורים