המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. יעד מרכזי של רפואה רגנרטיבית היא לחדש את שריר הלב מת לאחר MI. למרות מספר אסטרטגיות שימשו להתחדש שריר הלב, טיפול בתאי גזע נשאר בגישה הגדולות כדי לחדש את שריר הלב מת הלב MI. לצבירת ראיות מצביע על הנוכחות של תאי גזע לב תושב (CSCs) בלב למבוגרים, ההשפעות שלהם אנדוקרינית ו/או paracrine על התחדשות לב. עם זאת, בידוד CSC, שלהם אפיון ובידול לכיוון תאי שריר הלב, במיוחד cardiomyocytes, נותר אתגר טכני. במחקר הנוכחי, סיפקנו שיטה פשוטה עבור בידוד, אפיון, הבידול של CSCs מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה הדרגתי של צפיפות בידודו של CSCs, היכן הלב הוא מתעכל על ידי פתרון II collagenase 0.2%. כדי לאפיין את CSCs מבודדים, הערכנו את הביטוי של סמנים CSCs/לב Sca-1, NKX2-5 ו- GATA4, סמנים pluripotency/stemness OCT4, SOX2 ו- Nanog. אנחנו גם לקבוע את הפוטנציאל התפשטות של CSCs מבודדים על ידי culturing אותם בצלחת פטרי והערכה הביטוי של דה מרקר התפשטות Ki-67. להערכת פוטנציאל התמיינות של CSCs, בחרנו CSCs שבע עד עשר דקות ימים תרבותי. נוכל להעביר אותם צלחת חדשה עם מדיום בידול cardiomyocyte. הם מודגרת ב חממה תרבות התא במשך 12 יום, ואילו המדיום בידול משתנה כל שלושה ימים. CSCs הבדיל אקספרס סמנים ייחודיים cardiomyocyte: actinin, טרופונין אני. לפיכך, CSCs מבודדים עם פרוטוקול זה יש stemness וסמנים לב, שיש להם פוטנציאל התפשטות ובידול לכיוון השושלת cardiomyocyte.
מבוא
מחלת לב איסכמית, כולל אוטם שריר הלב (MI), היא הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי גזע, ולשם רגנרציה שריר הלב מת נשאר בגישה הגדולות כדי לשפר את תפקוד הלב MI הלב2,3,4,5. סוגים שונים של תאי גזע שימשו כדי לחדש את שריר הלב מת וכדי לשפר את תפקוד הלב הלב MI. הם יכולים להיות בהרחבה מחולקת6 תאי גזע עובריים ותאי גזע למבוגרים. בתאי גזע בוגרים, סוגים שונים של תאי גזע היו בשימוש, כמו7,תאי תאי מח עצם-derived8, גזע mesenchymal שמקורם במח העצם<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דיור, הרדמה, ושל הקרבה של עכברים בוצעו בעקבות הפרוטוקול IACUC המאושרים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
1. חומרים
- שחור C57BL/6J לשימוש 10 - עד השבוע ה-12, עכברים זכרים, כל הזמן ללא צורך במיקור חוץ במתקן בעל חיים מוסדיים, עבור בידודו של CSCs. CSCs יכול גם להיות מבודד עכברים אישה שאינה בהריון.
- לעקר את כל הדרוש מכשירי הניתוח, לרבות מספריים כירורגיים, מספריים כירורגיים בסדר, shank מעוקל מלקחיים להב כירורגי, על ידי autoclaving לפני המתת החסד של העכבר.
- להכין CSC מאגרי בידוד במצב סטיריליים ואחסן אותם ב 4 ° C על קרח. מאגרים אלה כוללים polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון מותאם צפיפות של 1.077 g/mL, של Dulbecco לא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר הנוכחי, אנחנו מבודדים CSCs מ- 10 עד 12-בת C57BL/6J עכברים זכרים לבבות. . הנה, הוצגו שיטה פשוטה עבור CSC בידוד ואפיון באמצעות סמנים של pluripotency. אנחנו גם הציג שיטה אלגנטי עבור בידול CSC, אפיון CSCs זה הבדיל לכיוון cardiomyocytes השושלת. הבחנו מורפולוגיה צורת פלך של 2 עד 3-ימים-תרבותי CSCs במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1A ו 1B). מצאנו את שינוי המבנה של CSCs ב 7 ימים של תרבות תחזוקה בינוני, אשר במהלכו הופכים תאי גזע מאורך (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
להלן השלבים הקריטיים של הפרוטוקול בידוד CSC. 1) תנאי סטיריליים חייבות להישמר לחילוץ של הלבבות של העכברים. כל זיהום במהלך החילוץ הלב עלול לסכן את איכות CSCs. 2) הדם להסירו לחלוטין לפני הא הלב, אשר נעשה על ידי מספר שוטף של כל הלב והלב חלקים עם HBSS פתרון. 3) החלקים הלב חייב להיות lysed לחלוטין להשעיה תא בודד עם פתרון collagenase. 4) חייב להיות prewarmed polysucrose, סודיום diatrizoate הדרגתיות הפתרון עבור הפרדת התאים. 5) חייב להיות prewarmed המדיום לתרבות CSC. 6) הנהרות CSCs במהלך זריעה בקערה תרבות צריך להיות גבוה, כי ב- c.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת, חלקים, המענקים מכוני הבריאות הלאומיים HL-113281 ו- HL116205 כדי פאראס קומאר מישרה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>עכברים | מעבדת ג'קסון, ארה"ב | מלאי מס' 000664 | |
| <חזק>נוגדנים: | |||
| OCT4-Abcam | ab18976 (פוליקלונל ארנב) | OCT4-נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה | |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (פוליקלונל ארנב) | SOX2 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| Nanog | Abcam | ab80892 (פוליקלונל ארנב) | Nanog - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (פוליקלונל ארנב) | Ki67 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| Sca I | Millipore | AB4336 (פוליקלונל ארנב) | Sca I נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (פוליקלונל עזים) | NKX2-5 - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (פוליקלונל ארנב) | GATA4 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| MEF2C | סנטה קרוז | sc-13268 (פוליקלונל עזים) | MEF2C - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| טרופונין I | Millipore | MAB1691 (חד שבטי עכבר) | טרופונין I - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה |
| חוסמתאקטינין | מיליפור | MAB1682 (חד שבטי עכבר) | נוגדן אקטינין-ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| ANP | Millipore | AB5490 (פוליקלונלי עכבר) | ANP - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת |
| אלכס פלואור-488 בדוק אנטי ארנב | טכנולוגיית חיים | מס' A21441 | |
| אלכס פלואור-594 עז נגד ארנב | טכנולוגיית חיים | מס' A11012 | |
| אלכס פלואור-594 ארנב נגד עזים | טכנולוגיית חיים | מס' A11078 | |
| אלכס פלואור-488 בדוק נגד עכבר | טכנולוגיית חיים | מס' A21200 | |
| אלכס פלואור-594 בדוק אנטי עז | טכנולוגיית חיים | מס' A21468 | |
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| מדיום תרבית: | |||
| CSC מדיום תחזוקה | Millipore | SCM101 | הערה: עבור תרבית CSC, PBS או מדיום DMEM לא שלם שימש לשטיפת התאים |
| מדיום התמיינות קרדיומיוציטים | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | >Catalog Number | >Comments |
| >מאגר בידוד תאים: | |||
| פוליסוכרוז ותמיסת נתרן דיאטריזואט (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| קולגנאז I | Sigma | C0130 | |
| תמיסת Dispase | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| <חזק>ריאגנטים אחרים: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| סרום בדיקה רגיל | מעבדת וקטור | S3000 | |
| תמיסת DAPI | Applichem | A100,0010 | Dapi, ריכוז עבודה-1 ומיקרו; גרם/מ"ל |
| טריפן כחול | Biorad | 145-0013 | |
| טריפסין | סיגמא | T4049 | |
| StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאים | תרמו פישר | A1110501 | |
| פורמלדהיד | סיגמא | 158127 | |
| טריטון X-100 | אקרוס | Cas מס' 900-293-1 | |
| טווין 20 | פישר סינטיפיק | פריט מס' 160170 | |
| אתנול | תרמו מדעי | ||
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>חומרי תרבית רקמות: | |||
| 100 מ"מ צלחת פטרי | תרמו סיינטיפיק | ||
| צלחת 6 בארות | Thermo Scientific | ||
| צלחת 24 בארות | Thermo Scientific | ||
| T-25 בקבוק | Thermo Scientific | ||
| T-75 בקבוק | Thermo Scientific | ||
| 15 מ"ל צינור חרוטי | Thermo Scientific | ||
| 50 מ"ל צינור חרוטי | Thermo Scientific | ||
| 40 ומיקרו; מכתים תאים m | פישר סיינטיפיק | 22363547 | |
| 100 ומיקרו; מכתים תאים m | פישר סיינטיפיק | 22363549 | |
| 0.22 ומיקרו; m מסנן | פישר סיינטיפיק | 09-719C | |
| 10 מ"ל מזרק | BD | Ref מס' 309604 | |
| 10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L קצות פיפטה | פישר סיינטיפיק | ||
| 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטה מפלסטיק חד פעמי | תרמו מדעי | ||
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| ><חזק>מכשירים | |||
| מכונת צנטרופוגה | Thermo Scientific | LEGEND X1R צנטריפוגה | |
| EVOS מיקרוסקופ טכנולוגיית | חיים מונה | ||
| תאים אוטומטי | Biorad | ||
| שקופית ספירת תאים | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 מילוי | |
| <חזק>שם | < חזק>חברה | ><חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| ><חזק>מכשירים כירורגיים: | |||
| מספריים כירורגיים | כלי מדעי משובח מספריים | ||
| כירורגיים עדינים | כלי | ||
| עקומת שוק מלקחיים | כלי מדעי משובח | ||
| להב כירורגי | מדעי משובח |
מקורות
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. A....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
