ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהוי מדויק וספציפי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתאים הסלולר ורקמות שונים חיוני למחקר של חמצון-חיזור מוסדר איתות בהגדרות ביולוגי. ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא השיטה רק ישיר כדי להעריך רדיקלים חופשיים חד משמעית. היתרון שלו הוא שהוא מזהה רמות הפיזיולוגיות של מינים ספציפיים עם ירידה לפרטים גבוה, אבל זה דורש טכנולוגיה מיוחדת, הכנת הדוגמא זהיר, ולהבטיח הפקדים המתאימים לפירוש מדויק של הנתונים. Hydroxylamine מחזורית ספין הגששים להגיב באופן סלקטיבי סופראוקסיד או אחרים רדיקלים ליצירת אות nitroxide זה ניתן לכמת על ידי EPR ספקטרוסקופיה. ספין תא חדיר הגששים וזונדים ספין שנועד לצבור במהירות בתוך המיטוכונדריה לאפשר קביעת ריכוז סופראוקסיד בתאים הסלולר שונה.
תאים בתרבית, השימוש הסלולרי חדיר 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) יחד עם וללא תא אטום סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) רעלני או השימוש תא חדיר פג-SOD, מאפשר הבידול של חוץ-תאי של סופראוקסיד cytosolic. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido מיטוכונדריאלי] piperidinium dichloride (mito-טמפו-H) מאפשר מדידה של ROS מיטוכונדריאלי (בעיקר סופראוקסיד).
ניתן להחיל ספין הגששים וספקטרוסקופיה EPR גם למודלים ויוו . סופראוקסיד יכול להתגלות חוץ-תאית נוזלים כגון דם ונוזלי מכתשי, כמו גם רקמות כגון רקמת הריאה. מספר שיטות מוצגים לעבד, לאחסן רקמות למדידות EPR ולהעביר תוך ורידי 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) ספין המקדח בתוך vivo. בזמן מדידות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, המתקבל במבחנה ויוו דגמים יכול גם להיות מאוחסן ב- 80 ° C ודוגמאות נותחו על ידי EPR-77 K... הדגימות יכול להיות מאוחסנת באורווה צינורות מיוחדים ב-80 מעלות צלזיוס ולהפעיל ב K 77 כדי לאפשר מעשית, יעיל, ושיטה לשחזור מקלה על אחסון, העברת דגימות.
מבוא
בעוד אמצעים של סטרס חמצוני, מינים חמצן תגובתי חשובים בחקר מחלות מגוונות בכל מערכות איברים, הגילוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) הוא מאתגר עקב מחצית חיים קצר תגובתיות גבוהה. טכניקת פאראמגנטיים תהודה (EPR) אלקטרון הוא השיטה ברורה וחד משמעית ביותר לגילוי רדיקלים חופשיים. ספין הגששים יש יתרונות על פני הגששים פלורסנט הנפוצות. למרות הגששים פלורסנט הם יחסית זול וקל להשתמש ולספק גילוי מהיר, רגיש של ROS, יש להם מגבלות רציניות בשל אותות מלאכותית, חוסר יכולת לחשב ריכוזים ROS, וחוסר כללי ירידה לפרטים1 .
כדי להקל על השימוש של EPR עבור מחקרים ביולוגיים, מגוון רחב של ספין הגששים היו מסונתז שיכול למדוד מגוון מינים רדיקלים חופשיים ביולו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו בדנוור אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. הכנת נוגדנים
-
Diethylenetriaminepentaacetic חומצה (DTPA) מניות (150 מ"מ)
- להוסיף 2.95 גר' DTPA (393.35 g/mol) עד 10 מ"ל מים יונים.
- כדי להמיס DTPA, להוסיף 1 M NaOH dropwise ולהביא pH של 7.0.
- להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל מים עבור ריכוז DTPA הסופי של 150 מ מ, ולאחסן ב 4 º C.
-
פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) (50 מ מ, pH 7.4)
- להכין 5 מ' של נתרן כלורי (NaCl) (g 58.44/mol; 29.22 g/100 מ"ל).
- להכין 1 מ' של אשלגן פוספט dibasic HK2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איתור סופראוקסיד CMH אומתה באמצעות ה-X / הקמב ץ סופראוקסיד יצירת מערכת כדי להדגים כי האות nitroxide (ס. מ..) היה מלא מעוכבים על ידי SOD, בעוד קטלאז היו אין השפעה (איור 1 א'). סופראוקסיד סה כ, חוץ-תאית הוערך אז בתאים 264.7 גלם על ידי תאים ומוכנסות עם החללית ספין CMH תא חדיר + /-SOD רעלני. Nitroxide הריכוז נמדד תא ההשעיה והן מאגר, אשר הראו כי הערכים של שני הסוגים לדוגמה היו דומים בשל equilibration מהירה של המכשיר ספין (איור 1B
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הערכת ייצור רדיקלים חופשיים בהגדרות ביולוגי חשוב להבין חמצון-חיזור מוסדר איתות על בריאות ומחלה, אבל המדד של המינים הללו הוא מאוד מאתגר בשל זמן מחצית החיים הקצר של רדיקלים חופשיים מינים וטכני מגבלות עם השיטות הנפוצות. EPR הוא כלי חשוב ורב עוצמה בביולוגיה חמצון-חיזור, כמו גם את שיטת ברורה וחד משמעית רק לגילוי רדיקלים חופשיים. בפרויקט זה, נדגים שיטות EPR מעשי בעיצוב ניסויים, הכנת דוגמאות כדי לזהות ROS באמצעות ספין רגשים תאים סלולריים שונים במבחנה , תאי רקמות שונות ויוו. כמו כן, אנו מספקים שיטות מעשיות להתמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר באוניברסיטת קולורדו של רפואה דין פרס תשתיות מחקר אסטרטגי, R01 HL086680-09, 1R35HL139726-01, כדי E.N.G. ו- UCD CFReT מלגת פרס (הוא). המחברים תודה ד ר סנדרה איטון, ד ר גארת איטון (באוניברסיטת דנבר), ד ר ג'רלד רוזן, ד ר יוסף עמ' קאו (אוניברסיטת מרילנד), ד ר תהיה ונקאטרמאן (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) דיונים מועילים ואני ג'ואן Maltzahn, אשלי Trumpie, אייבי מקדרמוט (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) לקבלת תמיכה טכנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | מדיה לתרבית תאים |
| חומצה דיאתילנטריאמינפנטאצטית (DTPA) | סיגמא אולדריץ' | D6518-5G | |
| נתרן כלורי (NaCl) | פישר סיינטיפיק | BP358-212 | המשמש להכנת 50 מ"מ מאגר מי מלח פוספט על פי סיגמא אלדריש |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | משמש להכנת 50 מ"מ מאגר מלח פוספט על פי סיגמא אלדריש |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P-5379 | משמש להכנת 50 מ"מ מאגר מלח פוספט על פי Sigma aldrish |
| מאגר קרבס-הנסלייט (KHB) | (אלפא אזר, היל) | J67820 | |
| אריתרוציטים בקר סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) | סיגמא אולדריץ' | S7571-30KU | |
| פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) | סיגמא אולדריץ' | P1585-1MG | מתמוסס ב-DMSO |
| אנטימיצין A (AA) | סיגמא אולדריץ' | A8674-25MG | מתמוסס באתנול ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (MW בשימוש הוא המשקל המולקולרי הממוצע לארבעה מנות) |
| 1-הידרוקסי-3-מתוקסיקרבוניל-2,2,5,5-טטרמתילפירולידין. HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-הידרוקסי-3-קרבוקסי-2,2,5,5-טטרמתילפירולידין . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-הידרוקסי-4-[2-טריפנילפוספוניו)-אצטמידו]-2,2,6,6-טטרמתילפיפרידין, 1-הידרוקסי-2,2,6,6-טטרמתיל-4-[2-(טריפנילפוספוניו)אצטמידו]פיפרידיניום דיכלוריד ( מיטו-טמפו-H) | אנזו מדעי החיים | ALX-430-171-M005 | |
| 1-הידרוקסי-2,2,6,6-טטרמתילפיפרידין-4-איל-טרימתילאמוניום כלוריד . HCl (CAT1H) | אנזו מדעי החיים | ALX-430-131-M250 | |
| הפרין | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| דיפניליודוניום כלוריד | Sigma Aldrich | 43088 | |
| מלח דפרוקסמין מסילאט | סיגמא אולדריץ' | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| מותג חד פעמי BLAUBRAND מיקרופיפטות, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | נימים |
| צינורות פלואורופולימר חלקי PTFE 3/16 אינץ' OD x 1/8 אינץ' תעודת זהות | NORELL | 1598774A | צינורות טפלון |
| פקקי גומי סיליקון לצינורות מדגם NMR לצינורות דופן דקים בעלי OD של 4 מ"מ-5 מ"מ (3.2 מ"מ עד 4.2 מ"מ ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano ספקטרומטר EPR ספסל עליון | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
מקורות
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
