מאמר שיטה

הרומן שיטות לניהול תוך-אפי בהרדמה אינהלציה כדי להעריך את האף-אל-מוח תרופות

DOI:

10.3791/58485

⸱

14 בנובמבר 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Nihon University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שתי שיטות רומן מינהל תוך-אפי יציב בהרדמה אינהלציה עם לחץ פיזי חיות ניסוי. גם נתאר שיטת הערכה כמותית של סמים רמות הפצה במוח באמצעות מסלול האף-אל-מוח באמצעות radiolabeled14ג]-אינולין כמו מצע מודל של מקרומולקולות מסיסים במים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניהול תוך-אפי דווח כדי להיות שביל פוטנציאליים עבור משלוח האף-אל-מוח של סוכני טיפולית העוקפות את מחסום הדם - מוח. עם זאת, היו כמה דיווחים בדבר לא רק ניתוח כמותי אלא גם תנאי ניהול אופטימלי של משטרי החקירות של משלוח האף-אל-מוח. התקדמות מוגבלת במחקר על מנגנונים מסלול האף-אל-מוח באמצעות מכרסמים מייצג של ליקוי משמעותי מבחינת תכנון מערכות אספקה האף-אל-מוח עבור תרופות.

כדי לקבל איזושהי התקדמות בהקשר זה, אנו פיתח, הערכה שתי שיטות רומן מינהל תוך-אפי יציב בהרדמה שאיפת חיות ניסוי. גם נתאר שיטת הערכת רמות הפצת סמים במוח דרך השביל האף-אל-מוח באמצעות התווית על-ידי רדיו [14ג]-אינולין (משקל מולקולרי: 5,000) כמו מצע מודל של מקרומולקולות מסיסים במים.

בתחילה, פיתחנו פרוטוקול ניהול תוך-אפי מבוסס פיפטה שימוש במסיכות באופן זמני openable, שאיפשר לנו לבצע ניהול אמין כלפי בעלי חיים תחת הרדמה יציב. באמצעות מערכת זו, [14ג]-אינולין היתה אפשרות להעביר את המוח עם שגיאה ניסוי קטן.

לאחר מכן פיתחנו פרוטוקול ניהול תוך-אפי פרוגרמה תעלות הפוכה מן הצד דרכי הנשימה דרך הוושט, אשר פותחה כדי למזער את ההשפעות של סיווג בשחרור ליחה (MC). טכניקה זו הובילה רמות גבוהות באופן משמעותי [14ג]-אינולין, אשר זוהה באופן כמותי הריח הנורה המוח הגדול, המוח המוארך, מאשר השיטה פיפטה. זה מופיע כי השמירה של הפתרון סמים בחלל האף היה גדל באופן משמעותי על ידי המינהל פעיל באמצעות מזרק משאבה בכיוון ההפוך המטאלקאמפ לתוך חלל האף.

לסיכום, שתי שיטות של ניהול תוך-אפי שפותחו במחקר זה צפוי להיות מאוד שימושי טכניקות להערכת פרמקוקינטיקה בחולדות. שיטת תעלות הפוכה, בפרט, עשוי להיות שימושי עבור הערכת הפוטנציאל המלא של האף-אל-מוח משלוח סמים מועמדים

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomedicines כמו פפטידים, oligonucleotides נוגדנים נחשבים יש פוטנציאל היישום בתור הרומן סוכני טיפולית להפרעות במערכת העצבים המרכזית עקשן שיש כיום אין טיפול מרפא. אולם, מאחר שרוב biomedicines הם מקרומולקולות מסיסים במים, משלוח מהדם למוח באמצעות ניהול תוך ורידי או אוראלי הוא קשה מאוד בשל התנגדות של מחסום הדם - מוח (BBB).

בשנים האחרונות, ניהול תוך-אפי דווח כדי להיות שביל פוטנציאליים עבור משלוח האף-אל-מוח של סוכני טיפולית אשר ימנע BBB1,2,3,4,5. עם זאת, היו דיווחים מעטים יחסית לגבי ניתוח כמותי של האף-אל-מוח מסלול משלוח6. יתר על כן, היו כמעט אין דיווחים על ניהול אופטימלי ויצר ותנאים משטרי מינון, כגון עוצמת, פעמים, פרקי זמן, מהירות, החקירות של משלוח האף-אל-מוח. הליקויים הנ ל יכול להיות מיוחסות מהסיבות הבאות: (i) אופטימלי שיטה מינהל תוך-אפי עבור עכברים טרם שתוקם, והוא הניהול תוך-אפי (ii) מאת pipetting, המשמש בדרך כלל, מאופיין בדרך כלל מאת וריאציה interindividual בקרב חיות עקב סיווג בשחרור ליחה (MC), ובכך לעיתים קרובות המוביל underestimations של הפוטנציאל משלוח האף-אל-מוח בפועל של תרופה מסוימת.

שאיפת הרדמה באמצעות איזופלוריין (חניכה: 4%, תחזוקה: 2%) עם שאיפה מסכת מכרסמים צבר השימוש הנרחב, עם המטרה של צמצום או ביטול הכאב הקשורים לניתוח מתבצע על חיות ניסוי. השימוש של מסיכות הופכת פשוטה יחסית לביצוע טיפוסי והתרופות האמריקני בחיות ניסוי בהרדמה שאיפה דרך המסלולים תת עורית, בקרום הבטן, תוך ורידי. עם זאת, במקרה של הממשל תוך-אפי, המסכה צריך יוסרו באופן זמני מן החיות עבור והתרופות האמריקני. עם תחזוקה מתחת לגיל 2% איזופלוריין, בעלי חיים בדרך כלל לעורר במהירות מן ההרדמה אינהלציה. כאשר אמצעי האחסון המינהל לכל במינון גדול, זה יכול לגרום הפתרון סמים יזרום חלל האף לתוך הוושט, ולכן מנה גדולה אחת יכול ויהיה צורך ניתן לפרק מינונים קטנים מרובים עבור ניהול תוך-אפי קטן בעלי חיים. ניהול תוך-אפי מחייבת הסרת המסכה לניהול חוזרות ולא מספיק זמן לאספקה מתמשכת חלל האף, יש הסתברות גבוהה המעוררים עכברים מן ההרדמה במהלך ההליך המינהל. זה מקשה מאוד לבצע ניהול תוך-אפי תחת הרדמה מדינה יציבה, כנראה תורמת וריאציית interindividual נצפתה האף-אל-מוח המסירה בין מכרסמים.

במחקר זה, לכן פיתחנו שתי שיטות רומן מינהל תוך-אפי יציב תחת הרדמה אינהלציה, אשר לכפות לחץ פיזי על החיות ניסיוני. עבור השיטה הראשונה, השתמשנו מסיכה זמנית openable המאפשרת ניהול תוך-אפי במהלך הרדמה אינהלציה. החלק openable של המסכה משלבת פקק סיליקון יכול לשמש על פי תזמון ניהול כדי להקל על הניהול תוך-אפי יציבה באמצעות פיפטה. השיטה השנייה, בצינורית הוכנס בניתוח לעבור מהוושט אל תוך חלל האף, מזרק משאבה היה אז מצורף לזה כך הפתרון סמים יכול ישירות ובאמינות להישלח אל תוך חלל האף תחת שאיפת יציב הרדמה. בשיטה זו ניתן לשפר את המסירה של תרופות למוח באמצעות תוואי האף-אל-מוח, כי על-ידי מזעור באופן משמעותי את ההשפעות של MC, יהיה משופר סמים retentively בחלל האף. בנוסף, אנו מתארים שיטה להערכת באופן כמותי את רמות הפצת סמים (% למוח במינון שהוחדר/g) במוח באמצעות התווית על-ידי רדיו [14ג]-אינולין [משקל מולקולרי (MW): 5,000] כמו מצע מודל של מסיסים במים מקרומולקולות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר בבעלי חיים (#AP17P004) בוצעה בהתאם להנחיות אושרה על ידי אכפת לי חיה אוניברסיטת ניהון שימוש הוועדה (בטוקיו, יפן). מחקר זה (#17-0001) אושרה על ידי מרכז הספר לרוקחות, האוניברסיטה ניהון Radioisotope.

1. בעלי החיים שבהם משתמשים עבור ניהול תוך-אפי בהרדמה אינהלציה

  1. בית העכברים ניסיוני בכלובים מפלדת תחת מחזור/כהה 12-h (אור-8:00-8:00 PM), עם טמפרטורה מבוקרת ומתוחזק על 23 ± 1° C, לחות של 50% ± 10%, ו- ad libitum גישה למזון ולמים.
  2. לפני ניסויים, עזים ומתנגד העכברים דרך שאיפה של 2% איזופלוריין, חניכה הבאים-ריכוז של 4%. לאשר את הרמה הנדרשת של ההרדמה על-ידי בדיקה היעלמותו של פני השטח בטעותו.

2. הכנת פתרון ניהול

  1. להכין פתרון ניהול [14ג]-אינולין (50 μM, 0.5 μCi/mL לכל עכבר) על ידי דילול בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט, ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.

3. תוך-אפי הממשלים עבור עכברים

  1. Micropipette השיטה באמצעות מסיכת אינהלציה באופן זמני openable (איור 1)
    הערה: טכניקה זו הוא שינוי של פרוטוקול ניהול תוך-אפי באמצעות micropipette שהוקם על ידי פריי. et al. 3
    1. לתקן עכברים במצב פרקדן על לקדמת על ידי מקליטה את איברי גופם בהרדמה אינהלציה עם 2% איזופלוריין (איור 1 א').
    2. לנהל הנפח הכולל של פתרון ניהול 25-μL את העכבר כל במרווחי זמן 30-s, דרך מנות 1-2 μL לחילופין מנוהל בנחיריו ימין ועל שמאל בעוד העכברים קבועים בהרדמה אינהלציה (איור 1B ו- C).
    3. הערה: פסולת הגז המרדים הוא לנקות באמצעים פעילים (מנדפים הוד, אבטחה קשה ducted הקבינט, ואקום, וכו ') כאשר נפתח את המסכה ואת האמצעים פסיבי (גז הרדמה פסולת cannister) סגור
  2. הפוך תעלות m ethod מן הצד דרכי הנשימה דרך הוושט (איור 2)
    הערה: טכניקה זו הוא שינוי של פרוטוקול קליטה תוך-אפי עבור חולדות שהוקם על ידי אני תולה. et al. 7
    1. לתקן עכברים במצב פרקדן על לקדמת על ידי מקליטה את איברי גופם בהרדמה אינהלציה עם 2% איזופלוריין.
    2. שיער בצוואר מגולח, prepped באמצעות יישום betadine או chlorhexidine ולאחריה שטיפה אלכוהול.
    3. לחשוף את קנה הנשימה ואת הוושט על ידי הרחבת העור מתחת הגרון עם מלקחיים לאחר ביצוע חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) עם מספריים.
    4. לעשות חתך (1 מ מ) לקנה באמצעות מספריים.
    5. הכנס בצינורית (קוטר פנימי: 0.58 מ"מ, קוטר חיצוני: מ מ 0.965) לאורך של 1.2 ס מ ולצרף בצד השני של הצינורית הפנימי של מסיכת אינהלציה.
    6. אעשה חתך (1 מ מ) הוושט באמצעות מספריים, להוסיף את הצינורית (קוטר פנימי: 0.28 מ מ, קוטר חיצוני: 0.61 מ"מ) לאורך של 1.4 ס מ לכיוון החלק האחורי של חלל האף, מאתרים ומפסיקים את זה (איור 2 א ו- B).
      הערה: ההליכים 3.2.2 כדי 3.2.4 בוצעו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה × 10.
    7. לצרף מחט (27G × 1/2) מזרק 1-mL מלא פתרון ניהול וחבר לתכנות המיקרו-מזרק משאבה.
    8. להתחבר מעל המחט אל הצינורית זה היה מוכנס לתוך הוושט-3.2.5 (איור 2C).
    9. לנהל את הנפח הכולל של 25 μL [14ג]-פתרון אינולין בקצב קבוע (μL 5/דקה) (איור 2C ו- 2D).

4. כמותיים הניסוי באמצעות התווית על-ידי רדיו מקרומולקולות מסיסים במים ([14ג]-אינולין)

  1. לערוף העכברים ניסויית תחת הרדמה, לפתוח את אחת מגולוגולות שלהם, באמצעות מספריים מהצד של המוח המוארך, תוך דאגה שלא יגרמו נזק המוח.
  2. תמצית בקפידה את כל המוח על ידי חפנה באמצעות מיקרו-מרית של הגולגולת.
  3. המקום נייר סינון לחלח עם תמיסת מלח על צלחת פטרי המאוחסן על קרח.
  4. במקום שכל שחולצו על נייר הסינון בטעימת.
  5. לנגב את הדם הקפדה על פני השטח של המוח באמצעות מקלון צמר גפן לחלח עם תמיסת לחסל לפחות את השפעת [14ג]-אינולין בדם על פני השטח של המוח.
  6. לנתח את המוח במהירות, ולחלק אותם לשלושה חלקים: הריח הנורה המוח הגדול, המוח המוארך (כולל של פונס).
  7. מקום במוח דגימות רקמה solubilizer ב 50 מעלות לשעה.
  8. להוסיף 10 μL של קוקטייל גזים הדגימות המוח.
  9. העברה של aliquot 25 μL של הפתרון המינהל מומס נצנוץ בקוקטייל בקבוקון נצנוץ כדי לקבוע הרדיואקטיביות של הפתרון יישומית.
  10. למדוד את התפרקויות רדיואקטיביות דקה [14ג] המדגם המוח (X [14ג]המוח) והפתרון יישומית ([14ג] Xמנה ב) במונה נצנוץ נוזלי מצויד מתאים כבל מוצלב תיקון עבור 3H ו- 14ג.

5. ניתוח נתונים

  1. לחשב את הסמים הפצה רמות (%) עבור המנה מוזרק (מזהה %) באמצעות המשוואה הבאה:
    מזהה % ⁄g המוח = (X [14ג]המוח/ [14ג] Xבמינון) × 100,
    איפה Xבמוח (המוח dpm/g) הכמות [14ג] - אינולין נמדד רקמת המוח, Xב מנה (פתרון μL dpm/25) הוא הריכוז [14ג] - אינולין בפתרון לשימוש תוך-אפי המינהל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מראה את14ג]-אינולין רמות (מזהה % ⁄g המוח) הריח הנורה (א), המוח (B), לבין המוח המוארך (ג) שהושג באמצעות שני סוגים של המינהל תוך-אפי העריך במחקר הנוכחי. ניהול תוך-אפי באמצעות פיפטה מופעלת שיטת מסירת [14ג]-אינולין למוח באמצעות אינהלציה openable מסכות (איור 1). תחת הרדמה אינהלציה, תוצאות כמותיות חשף אין וריאציה interindividual ניסיוני בין החיות שנבדקו, כמצוין שגיאת התקן נמוכה. כאשר שיטת הניהול חלל האף הוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האף-אל-מוח מסירת תרופות צפויה להיות השפעה מובהקת על הפרעות במערכת העצבים המרכזית, כי מסלול זה מייצג את נתיב תחבורה ישירה עוקף BBB. שלושה מסלולים האף-אל-מוח שונים דווח תאריך8. הראשון הוא מסלול עצב הריח, אשר עובר מן רירית חוש הריח של רירית האף הקדמי דרך העצב הריח. השני הוא מסלול העצב, אשר מעביר של רירית מערכת הנשימה של רירית האף לגזע המוח ב hindbrain דרך העצב המשולש. השלישי הוא מסלול CSF, אשר מופץ ברחבי המוח דרך CSF. מסלול האף-אל-מוח משכה תשומת לב רבה ביחס הממשל של מקרומולקולות הידרופיליות, הנוטים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פרטיים אוניברסיטת מחקר מיתוג הפרויקט MEXT; מענק הסיוע עבור מדעי Research (C) (17 K 08249 [אל טי-קיי, ט. ס]) מן האגודה יפן לקידום המדע (JSPS); מענק למחקר קואופרטיב של הקרן אוסאצ'י לקידום של ביוכימיה [ל ט. ס], קרן המדע טקדה [אל טי-קיי]. אנו מודים מר הוא נקרא יויה ניטו, גב' אסאמי אקיקו על סיוע טכני חשוב שלהם בביצוע הניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכבר ddYיפן SLC, בע"מזכר, 4-6 שבועות, 20-30 גרם
איזופלורןפייזרv002139
הגדרת איזופלורןSHINANO ייצור ושות' בע"מ.SN-487-OTAir, SN-489-4
מסכת איזופלורןSHINANO ייצור ושות', בע"מ.למכרסמים קטנים
מסכת איזופלורן (סוג הניתן לפתיחה)SHINANO ייצור ושות', בע"מ.הזמנות מיוחדות
קופסת הרדמהSHINANO ייצור ושות' בע"מSN-487-85-02
מספריים לניסויים בבעלי חיים-1NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-27H
מספריים לניסויים בבעלי חיים-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-13H
פינצטה-1FINE SCIENCE TOOLS INC.11272-30Dumont #7 Dumoxel
פינצטה-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.A-12-1
צינור צינורית (PE-50)בקטון, דיקינסון ושות'.5069773תעודת זהות: 0.58 מ"מ, OD: 0.965 מ"מ
צינור צינורית (SP-10)NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.KN-392תעודת זהות: 0.28 מ"מ, OD: 0.61 מ"מ
מכונת גילוחMARUKAN, LTD.מיקרוסקופ סטריאוסקופי DC-381
Olympus CorporationSZ61
מחט 27G 1/2 ב-13 מ"מTERUMO CORPORATIONNN-2738R
מזרק 1 מ"לTERUMO CORPORATIONSS-01T
משאבת מזרקמדעי המוחNE-1000
קרום תאיתToyo Roshi Kaisya, Ltd.
מיקרו מריתShimizu Akira Inc.91-0088
Micropipette (0.5-10 uL)Eppendorf AGZ368083
שבב פיפטהEppendorf AG0030 000.811
קלטתTimeMed Labeling System, Inc.T-534-Rלקיבוע עכבר
[14C]-אינוליןכימיקלים אמריקאים עם תווית רדיו בע"מ.ARC0124A0.1 mCi/mL
EtOHWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-00461
מונה נצנוץ נוזליPerkin Elmer Life and Analytical Sciences, IncTri-Carb 4810TR
00011090

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
  2. Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
  3. Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5(2008).
  4. Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
  5. Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
  6. Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
  7. Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
  8. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
  9. Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
  10. Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
  11. Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
  12. Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
  13. Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים