הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

13.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

21 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו מציגים הרומן ונוהל יעיל הבידוד של לימפוציטים מ טלאים של פייה (PPs), בו ניתן להשתמש לאחר מכן ב- vivo ו- in vitro לקשרי מבחני פונקציונלי, כמו גם מחקרים cytometric זרימה של הזקיקים T עוזר, מרכז נבטי B תאים.

תקציר

ברירית המעיים, תאים חיסוניים מהווים ישות אימונולוגי ייחודי, אשר מקדם עמידות מערכת החיסון בזמן במקביל היוועצות ההגנה החיסונית נגד פתוגנים. היא מבוססת היטב כי התיקונים של פייה (PPs) יש תפקיד חיוני הרירית ברשת מערכת החיסון על ידי אירוח מספר אפקטור T ו B cell קבוצות משנה. חלק מסוים של אפקטור תאים אלה, הזקיקים T helper (TFH) ותאי B מרכז נבטי (GC) הם professionalized בוויסות humoral חסינות. לפיכך, אפיון אלה קבוצות משנה תא בתוך PPs במונחים של בידול התוכנית ומאפייני פונקציונלי שלהם יכול לספק מידע חשוב על חסינות הרירית. לשם כך, שיטה ישימה בקלות, יעיל ו לשחזור של לימפוציטים בידוד מ- PPs יהיה ערך לחוקרים. במחקר זה, כיוונו כדי ליצור שיטה יעילה כדי לבודד לימפוציטים מן העכבר PPs עם תשואה גבוהה התא. הגישה שלנו חשף את הרקמה הראשונית הזאת עיבוד בהן: ריאגנטים העיכול ועצבנות רקמות, כמו גם תא מכתימים תנאים ומבחר של נוגדן פאנלים, יש השפעה רבה על איכות ועל זהות של לימפוציטים מבודד תוצאות הניסוי.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר לחוקרים ביעילות לבודד לימפוציט אוכלוסיות מ- PPs ומאפשר זרימה לשחזור מבוססי cytometry הערכה של קבוצות משנה T ו- B cell, התמקדות בעיקר TFH ו- GC B תא קבוצות משנה.

מבוא

מערכת העיכול כולה מההתחלה עד הסוף הוא עדיין עם מערך הלימפה המכילה תאים חיסוניים יותר מכל איבר-אנוש אחרים, העכבר1. Peyer של טלאים (PPs) מהווים מרכיב מרכזי של הענף מעיים של הארגון מערכת החיסון התאית, כביכול הקשורים הבטן רקמת הלימפה (גולט)2,3. בתוך PPs, אלפי מיליוני אנטיגנים נגזר חומרים תזונתיים, commensal microbiota, פתוגנים הם להיות שנדגמו ברציפות, כאשר הצורך תגובות מערכת החיסון המתאים כלפיהם הם הנטען החיסון במעי ובכך שמירה הומאוסטזיס. במובן הזה, PPs יכול להיקרא בשם כמו "השקדים של המעי הדק". PPs מורכב תאי משנה עיקריים: כיפת subepithelial (SED), אזורים גדולים תא B זקיק; אפיתל זקיק-הקשורים שמעליה (מיסטי) ואזור interfollicular (למעלה) איפה ממוקם4תאי T. מידור ייחודית זו של PPs מאפשר אפקטור שונים תא קבוצות משנה לשתף פעולה, לפיכך, מקנה immunocompetence בבטן.

PPs חסרה lymphatics מביא, בשל סיבה זו, אנטיגנים מועבר PPs מן המעי הדק שלא מתנהלים דרך כלי הלימפה בניגוד למרבית איברי הלימפה אחרים. במקום זאת, תאים אפיתל מיוחדים ממוקם מיסטי, תאי M כביכול, אחראים העברת אנטיגנים luminal לתוך PPs5. לאחר מכן, אנטיגנים מועבר הן נאספות על ידי התאים הדנדריטים (Dc) ו phagocytes הממוקמים באזור כיפת subepithelial (SED) מתחת מיסטי6,7. תהליך המיון זה אנטיגן על-ידי בקרי ב PP חיוני ליזום תגובה חיסונית אדפטיבית8 ו דור עוקבות של תאים מפרישים איגה9.

בשל העומס antigenic כבד של פלורה commensal והחומרים התזונתיים, המארח PPs endogenously מופעל אפקטור T ו- B cell קבוצות משנה ב- abundances גדול כגון TFH ו- B GC איגה+ תאים10, רומז כי PPs מייצגים אתר של החיסון הפעיל תגובה11. זיהוי של עד 20 – 25% TFH תאים בתוך CD4 הכולל+ T תא תא ו למעלה עד 10 – 15% GC B תאים בתוך תאי B הכולל אפשרית ב- PPs שנאסף unimmunized צעיר C57BL/6 עכברים12. לעומת סוגים אחרים של תא מסייע T (כלומר., Th1, Th2, תאים Th17), תאים TFH להראות tropism ייחודי אל תוך זקיקי תא B בעיקר בשל ביטוי CXCR5, המקדם TFH יונת תא לאורך מעבר הצבע CXCL1313. באזורי זקיק תא B של PPs, תאים TFH זירוז איגה הכיתה לעבור רקומבינציה, היפרמוטציה בתאי B מופעל שממנו גבוהה-זיקה איגה לייצר תאים להבדיל14. לאחר מכן, אלו תאים פלזמה מפריש נוגדן להגר פרופריה. מוסקולריס (LP), לווסת את המערכת החיסונית הומאוסטזיס בטן10.

זיהוי ואפיון של אוכלוסיות תאים TFH ו- GC B בתוך PPs עשויה לאפשר לחוקרים לחקור את הדינמיקה של תגובות חיסוניות ההורמונאלית בתנאים מצב יציב ללא הצורך של מודלים התחסנות זמן רב משמשת גם TFH-GC B תא מחקרים15,16,17,18. ניתוח TFH תאים בתוך PPs אינה ברורים ככל קבוצות משנה אחרים בתא. האתגרים הטכניים כוללים זיהוי הרקמה אידיאלי הכנה תנאים, שילוב השטח נוגדן-marker, וכן בחירת הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים. תחומי מחקר TFH ו- PP התערוכה שונות רבה במועדי מבחינת נהלים ניסיוני, רחוקים היוועצות קונצנזוס להקים פרוטוקולים סטנדרטיים בשל מספר סיבות. ראשית, משנה תא בתוך PPs נוטה להיות מושפעים באופן שונה על ידי רקמת הכנה מצבים הדורשים שינויים נוספים באופן ספציפי משנה תא. שנית, קיים פער משמעותי בין השיטות המדווחת לגבי הפרטים של הכנה תא מ השלישי ול-pps , המספר של מחקרים השוואתיים מבוססי פרוטוקול חוקרת טכניקות להכנת רקמות האידיאלית והתנאים ניסיוני עבור עמודים ו- TFH מחקר מוגבל למדי.

מחקרים נוכחיים מבוססי פרוטוקול, הציע PP תא הכנה19,20,21,22 לא היו TFH - או GC מונחה תא B. יתר על כן, כמה תנאים רקמות הכנה מומלצת PPs19,,20 , כגון עיכול מבוססי collagenase נמצאו משפיעים על התוצאות של זיהוי TFH מאת cytometry זרימה שלילית18. על בסיס זה, אנחנו הסיק כי פרוטוקול ממוטבת, סטנדרטית ו לשחזור שיכול לשמש בחקר דינמיקה תא TFH ו- GC B בתוך PPs יהיה יקר בפני החוקרים עובדים על נושא זה. הצורך הזה נתן לנו את הדחף ליצור פרוטוקול ועדכני של שיפור עבור בידוד ואפיון של לימפוציטים PP דק הממוטב עבור שחזור הסלולר, הכדאיות ויעילות זרימת cytometric פלואורסנציה מספר T ו- B תא קבוצות משנה. גם כיוונו כדי לא לכלול מספר צעדים הכנה מפרך המוצעת פרוטוקולים הקודמים, ובכך, להפחית את המניפולציות נדרש והשעה עבור הכנת הרקמה והתא מ- PPs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים, הניסויים המתוארים פרוטוקול זה נערכו תחת הנחיות לפי אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל מסדר הדיאקוניסות.

1. עיצוב ניסיוני הקמה וקבוצות העכבר

  1. (אופציונלי) בשיתוף בית העכברים ניסיוני כדי להקל על העברה אופקית של הבטן microbiota בין עכברים ניסיוני וכדי להקטין את השתנות שאינם ספציפיים בתוך PP לימפוציטים. בנוסף, השתמש בפקדי littermate ממין זהה כדי למזער את השתנות.

2. כריתה כירורגית ושלבי ההכנה רקמות:

  1. הסרה כירורגית של המעי הדק (SI)
    1. המתת חסד עכברים באמצעות CO2 חנק או כל שיטה מקבילה אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים מוסדיים.
    2. העבר את העכבר על אזור ייעודי עבור כריתה כירורגית. למקם את הישבן למטה, לחטא את הבטן עם 70% אתנול. לבצע פתיחה של הבטן על ידי חיתוך בעור בטן של הצפק לאורך הקו האמצעי מהמפשעה, לכלוב הצלעות, ובכך לפתוח חלל הצפק.
      הערה: לבצע את החתך הראשון על שטח קטן יחסית של העור כדי למנוע חדירה חלל הצפק ופגיעה רקמת המעי. המשך הכריתה עד גבול אנטומי הרצוי.
    3. לזהות את caecum, המהווה נקודת ציון אידיאלי עבור הגילוי של ileum מסוף, המהווה את החלק הדיסטלי של המעי הדק.
      הערה: Caecum ממוקמת בדרך כלל בצד השמאלי התחתון של הבטן העכבר.
    4. לאתר ileocaecal בצומת ולעשות חתך ברמה זו כמו דיסטלי ככל האפשר להפריד את caecum המעי הדק. לאורך כל השלבים הבאים, למנוע את מגע פיזי מופרז עם הדקיקים שבדופן כי PPs שביר לכווץ בקלות על מגע.
    5. הסר בעדינות המעי הדק כולו עד הטבעת מולדת על ידי גזירה את מצע המעי באמצעות מספריים. לזהות את הצומת בין השוער התריסריון, לגזור התריסריון ברמה זו, אשר יוביל להשלמת התנתקות של המעי הדק של חלל הבטן.
      הערה: (i) להימנע hyperextension כמו זו עלולה לגרום שבר דופן המעי. (ii) אם LP לימפוציט בידוד רצוי בנוסף PP לימפוציטים, הסרה מלאה של השומן מצע המעי העליון נחוץ. עם זאת, בידוד PP בלבד, שנותרו שומן מצע המעי העליון יכול לספק כמה יתרונות במהלך השלבים בידוד נוסף; לכן, זה צריך להישמר.
    6. מקום מנותק המעי הדק בצלחת 6-ובכן מלא עם RPMI קר + 10% סרום שור עוברית (FBS), בעדינות להתסיס את הרקמות באופן ידני עד כל שכבות המעי טובע בתקשורת קר. לשמור על הרקמות על קרח לאורך כל השלבים הבאים.
    7. לאחר לנתח את המספר הרצוי של המעי הדק העכבר, המשך PP כריתה של המעי הדק שנאספו.
  2. כריתה כירורגית של PPs והכנה של תא בודד ההשעיה:
    1. בעדינות העבר המעי הדק על מגבת נייר מאת כשתפסת השומן מצע המעי העליון באמצעות מלקחיים ומניחים על מצע המעי העליון בצד הפונה מגבת הנייר. להרטיב את כל הקטע מעיים עם קר RPMI + 10% FBS כדי למנוע התייבשות רקמות הדביקות.
      הערה: שנותרו שומן מצע המעי העליון יכולה להועיל בשלב זה כי מקטעי רקמת שומן באתר מצע המעי העליון של SI ידבק מגבת הנייר מחזיק אתר אנטי-מצע המעי העליון פונה כלפי מעלה.
    2. לזהות את PPs, אשר מופיעים אגרגטים רב lobulated לבן בצורת "כמו כרובית" בצד אנטי-מצע המעי העליון של הקיר מעיים.
      הערה: פלאשינג החוצה התוכן luminal לא מומלץ עד PPs כל הדליות. ריקון תוכן luminal עלול לגרום להתמוטטות של PPs, תמנע את חדות הצבעים בין PPs מהקיר מעיים, אשר הוא מאוד מועיל עבור זיהוי חזותי של PPs.
    3. לאחר זיהוי PPs בצד אנטי-מצע המעי העליון, במקום את המספריים מעוקל-end כירורגי על PPs (עקומת צריך פנים למעלה) הרחקה PP מגבול שלה הדיסטלי, צינתור.
      אופציונלי: לדחוף PP בעדינות לכיוון הלהבים של מספריים משתמש קצה האצבע. תמרון זה יוביל הכללת יותר עמודים שאינם הרקמה שמסביב. לסלק את PPs בעדינות, למעט מעיים הרקמה שמסביב.
      הערה: (i) השלב זה קריטי להשגת תשואה תא PP מקסימלי תוך הקטנת הזיהום תא מגבולות תאי המעי כגון LP ואפיתל המעי, אשר הם גם עשירים בתאי T. (ii) מ סי אחד טוחנות מכל עכבר C57BL/6, ניתן לאסוף 5-10 PPs (גודל ממוצע, רב lobulated). על-ידי כיוון אפילו קטנה יותר PPs (לא רב lobulated), אוסף של עד 12-13 PPs לכל עכבר (C57BL/6) זה אפשרי באמצעות פרוטוקול זה.
    4. העברת PPs נכרת צלחת תרביות רקמה 12-ובכן מלא קפואים RPMI + 10% FBS וקרח מתוחזק על באמצעות מלקחיים או מספריים כירורגיים מעוקל.
      הערה: (i) מיד לאחר כריתה של PPs, ריר ותוכן המעי על פני עמודים ניתן לנקות על ידי שפשוף רקמת בעדינות על מגבת נייר. שלב זה יעזור לשפר את הכדאיות של לימפוציטים PP. (ii) במקום של העברת PPs על צלחת, העברת מופרדים צינורות יכול להיות גם נחשב בהתאם למספר המדגם.
    5. אופציונלי: לאחר השלמת כריתה PP והמיקום עוקבות המשקולת היטב, המספר והגודל של PPs שנאספו מקבוצות שונות ניסויית/עכבר יכול להיות מתועד על ידי לקיחת תמונה של צלחת תרביות רקמה המכיל PPs.
    6. הכנת סט של 50 מ ל צינורות חרוט ממולא 25 מ של RPMI + 10% FBS (להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס). בעזרת זוג מספריים, לחתוך את הקצה של טיפ µL 1,000 ממרחק זה יאפשר את השאיפה של PPs עם פיפטה 1 מ"ל. וארוקן את PPs עם פיפטה 1 מ"ל ומעבירים אותם מהצלחת תרביות רקמה 12-ובכן אל הצינורות חרוט מוכן 50 מ.
      הערה: השתמש טיפ חדש עבור כל דגימה העכבר כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות.
    7. לאבטח את המכסה ומניחים הצינורות אנכית שייקר מסלולית-37 מעלות צלזיוס, עם עצבנות רציפה ב- 125-150 סל ד למשך 10 דקות. בינתיים, הכנת סט חדש של 50 מ ל צינורות ומניחים על מסננת תא 40 µm בראש כל שפופרת, שדרכו תהיה מוכנה התליה תא בודד.
      הערה: (i) השלב עצבנות יסיר את הנותרים מעיים תוכן, ריר ופסולת תאים, אשר להקטין את הכדאיות תא ושחזור של לימפוציטים PP אם לא הוסר. (ii) אינן חלות כל סוג של אנזימי עיכול על רקמות PP כי תהליך עיכול גורם ההפסד הדרמטי של הביטוי CXCR5 מפני השטח התא.
    8. לאחר התסיסה, להעביר את PPs מסננת תא 40 µm הניח על ראש הצינורות החדש מוכן חרוט 50 מ. בעדינות בעזרת הצד מעוגל של פומפה מזרק 10 מ"ל, לשבש את PPs דרך מסננת התא כדי ליצור תא בודד ההשעיה. לשטוף את מסננת 15 – 20 מ של קר RPMI + 10% FBS.
      הערה: (i) לפני הסינון, ללחוץ את הצינורות המכילים את PPs אופקית. לנער קצר זה יקל על העברת PPs לתוך התא strainers. (ii) באמצעות מסננת תא מיקרומטר 70 הבידוד של תאים חיסוניים-הלימפה (למשל., ומונוציטים, מקרופאגים, בקרי קבוצת מחשבים) מומלץ.
    9. Centrifuge את המתלים תא בודד ב 350 – 400 g x 10 דקות ב 4 º C.
    10. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים-ריכוז של 10 x 106 תאים/מ ל.... לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
      הערה: (i) לפני לספור תאים, המספר בתא סכום עבור כל קבוצה העכבר PP יכול להיות כ מוערך באמצעות הנוסחה הבאה: "0.5-1 x 106 תאים x (מספר PPs) = ספירת התאים הכולל". דילולים נוספת עם trypan blue לספירת תא ייתכן שיהיה צורך. (ii) כחלופה לספור ידנית, אוטומטית תא מונים יכול לשמש.
    11. העברת 2-2.5 x6 10, בתאי האחסון המתאים (למשל., 200 µL) לתוך צלחת 96-ובכן סיבוב למטה.
      הערה: עבור צבע אחד ודוגמאות שליטה שלילי, 0.5-1 x 106 תאים עשוי להספיק.
    12. Centrifuge את הצלחת ב g x 350 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. קפיצי את הצלחת.
    13. לשטוף את התאים µL 200 מאגר מכתים.

3. משטח נוגדן מכתים

  1. צביעת הכדאיות:
    1. לאחר השטיפה הסופית resuspend תאי μL 100 של הכדאיות ניתן לתיקון צבע מדולל ב- PBS (1:1, 000). תקופת דגירה של 30 דקות על קרח או ב 4 ° C בחושך.
      הערה: צביעת תאיים (i) איתור של שעתוק מפתח גורמים כגון Foxp3 או Bcl-6 מחייב קיבעון של התאים. במקרה הזה, שאינו ניתן לתיקון הכדאיות צבענים (למשל-, 7-מ, דאפי) אינו יכול לשמש. (ii) כדי לדלל הכדאיות בר תיקון צבע, אין להשתמש בכל מאגר מכתימים המכילה חלבון. התקשורת בשימוש בשלב זה חייב להיות ללא חלבון. (iii) אי-הכללה של תאים מתים באמצעות צביעת הכדאיות חיוני כי תאים מתים יכול לגרום קשיים טכניים רציני ניתוח cytometry זרימה על ידי פליטת autofluorescence על ידי איגוד נוגדנים משטח nonspecifically, אשר עלול להוביל שווא תוצאות חיוביות.
    2. לשטוף את התאים פעמיים עם צביעת מאגר. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב 4 º C. קפיצי את הצלחת.
  2. בלוק fc משטח - שכבה i:
    1. הכן את הפתרון Fc-בלוק על ידי דילול נוגדן anti-CD16/32 (1:200) בצביעת מאגר.
    2. Resuspend תאי μL 20 בפתרון Fc-בלוק מוכן. תקופת דגירה של 15 דקות על קרח.
    3. בלי כביסה, להוסיף μL 80 של קוקטייל משטח נוגדנים (ראה טבלה 1 נוגדן סיכום) מוכן במלון דילולים המתאים. דגירה על קרח במשך לפחות 30 דקות.
    4. לשטוף פעמיים על-ידי הוספת יתר מאגר מוכתמים. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב 4 º C. קפיצי את הצלחת.
  3. משטח - שכבה II:
    1. הכן פתרון מוכתמים Streptavidin על ידי דילול מצומדת fluorochrome Streptavidin במאגר מוכתמים.
    2. לאחר השטיפה הסופית resuspend התאים עם 100 μL של Streptavidin מראש מדולל (1: 100) צביעת פתרון. תקופת דגירה של פחות 15 דקות על קרח בחושך.
    3. לשטוף פעמיים עם צביעת מאגר. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב 4 º C. קפיצי את הצלחת.
      אופציונלי: אם תאיים מכתים לגילוי הזקיקים תא T רגולטורי אינו רצוי, לאחר השטיפה האחרונה resuspend תאי μL 200 של צביעת מאגר והעברת לתוך צינורות המתאים לרכוש נתונים בזרימה cytometer. כאשר הדגימות אינם קבועים, רכישת נתונים על-ידי cytometry זרימה צריכה להתבצע בתוך 3-4 h כדי לקבל תוצאות מדויקות.

4. תא קיבוע

  1. להכין את הקיבעון/permeabilization (תיקון/פרם) הפתרון עובד באמצעות של ריאגנטים מ Foxp3/תמלול גורם מכתים המאגר להגדיר. מערבבים אחד-חלק פיקסציה/permeabilization להתרכז עם שלושת החלקים של קיבעון/permeabilization diluent לאמצעי האחסון הסופי הרצוי.
  2. לאחר השטיפה הסופית resuspend תאי μL 200 של הפתרון עובד תיקון/פרם.
  3. דגירה את הצלחת על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לא יעלה על 20 דקות בשלב זה. זמן הדגירה יותר קשות עלול להקטין את ההתאוששות התא.
  4. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב 4 º C. קפיצי את הצלחת. (אופציונלי) לאחר שלב זה, תאים קבוע ניתן לאחסן במשך מספר ימים ב 4 ° C בצביעת מאגר המכיל אלבומין שור (BSA) או FBS עד עוקבות תאיים להכתים או לזרום cytometry רכישה.
  5. Resuspend תאי μL 200 של permeabilization מאגר (x1) טרי מראש מדולל במים מטוהרים יונים.
  6. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  7. לשטוף פעם עם μL 200 של מאגר permeabilization, צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב- RT.

5. תאיים מכתים

  1. הכן את הפתרון Fc-בלוק על ידי דילול נוגדן anti-CD16/32 (1:200) במאגר permeabilization.
    הערה: לאחר השלב קיבעון, התאים חייב להישמר במאגר permeabilization עד תום תהליך צביעת תאיים
  2. לאחר השטיפה הסופית resuspend תאי μL 20 של Fc-בלוק פתרון. תקופת דגירה של 10 – 15 דקות ב RT בחושך.
  3. בלי כביסה, להוסיף μL 80 של תאיים נוגדן קוקטייל (100 μL נפח סופי) מדולל מראש במאגר permeabilization. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
  4. להוסיף 100 μL של המאגר פרם, צנטריפוגה-350 גרם x עבור 5 דקות ב- RT.
  5. לשטוף פעם עם μL 200 מאגר permeabilization, צנטריפוגה ב g 350 x דקות 5-RT.
  6. לאחר השטיפה הסופית resuspend תאי μL 200 של צביעת מאגר להעביר את התאים לתוך צינורות המתאים (סופי נפח של μL 400 במאגר מכתימים), לרכוש נתונים על ידי cytometry זרימה. דוגמאות צבעונית בצלחת 96-ובכן ניתן להפעיל גם מבלי להעביר לתוך צינורות אם cytometer זרימה עם צלחת קורא אפשרות זמינה. שלב זה ממזערת אובדן התא במהלך העברת תאים.
  7. לרכוש מינימום של 5 x 105 הכולל תאים cytometer זרימה כדי להיות מסוגל לבצע ניתוח לשחזור של TFH, TFR וכן תאי GC B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בניגוד הקודם פרוטוקול20, הבחנו כי PPs אינם מופצים בצורה שווה לאורך סי אך מותאמים יותר בצפיפות לכיוון קצות דיסטלי הפרוקסימלית SI כפי שמוצג איור 1A. ניתוח תזרים cytometric הראה, כי אם בעקבות נכונה, פרוטוקול שלנו נותן אוכלוסיית לימפוציטים PP מדגים לפנים לצד פיזור והפצה דומה splenocytes (איור 2 אE, ו- 2D, H) עם > 95% תא הכדאיות (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אופטימיזציה עבור זרימת cytometric אפיון TFH ותאי GC B. אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול שלנו הוא שהם מאפשרים את ניתוקה של עד 107 (ממוצע 5-4 x 106 תאים) הכולל PP תאים מן עכבר אחת (זן C57BL/6) ללא כל תהליך העיכול. הבחנו כי התשואה cell סך הכל היה בקורלציה עם המספר של PPs, יכול להיות מוערך מן המשוואה פשוטה הבאה, אפשרות שימושית לתכנון הניסוי: "הכולל PP תא ספירת לכל העכבר = 0.5-1 x (מספר עמודים נכרת לכל בעכבר) x 106". זו תשואה גבוהה התא היה השלים עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

ברצוננו תודה לורה שטראוס ומרווה פיטר לדיונים מועיל ולתמוך עם ניתוחים cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן CD4 נגד עכבריםeBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן CD19 נגד עכברeBioscienceMA5-16536למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן PD-1 נגד עכברeBioscience61-9985-82למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן ICOS נגד עכברeBioscience12-9942-82למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן נגד עכבר GL7Biolegend144610למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן CXCR5 נגד עכברBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960למידע מפורט ראה טבלה 1
נוגדן BCL-6 נגד עכברBiolegend358512למידע מפורט ראה טבלה 1
נגד עכבר Foxp3 נוגדניםeBioscience17-5773-82למידע מפורט ראה טבלה 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259למידע מפורט ראה טבלה 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957למידע מפורט ראה טבלה 1
7AADBiolegend420404למידע מפורט ראה טבלה 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141למידע מפורט ראה טבלה 1
קולגנאז IIוורת'ינגטוןLS004176
קולגנאז IVוורת'ינגטוןLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6 בארות, 12 בארות ו-96 בארותפלקון/קורנינג353046,353043/3596
צינורות חרוטיים 50 מ"לFalcon3520
40 ומיקרו; מסננת תאים mFalcon352340
בוכנה מזרק 10 מ"לExel INT26265
RPMIקורנינג15-040-CV
PBSקורנינג21-040-CM
FBSאטלנטה ביולוגיתS11150
שייקר אורביטליVWRדגם 200
מספריים
משוננים עדינים
מספריים
מעוקליםמלקחיים מעוקלים קטנים

מקורות

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ציטומטריה של זרימהתאי TFHתאי B של מרכז הנבטהצביעת תאיםפאנל נוגדניםעיכול רקמותחיוניות תאיםביטוי CXCR5
שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.