מאמר שיטה

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הכרחי לכמת במדויק את מבנים אנטומיים של חומרים תירס מבוסס על טכניקות ניתוח התמונה תפוקה גבוהה. כאן, אנו מספקים "פרוטוקול הכנה מדגם" תירס חומרים (כלומר, גזע, עלים, שורש) מתאים microcomputed רגילים טומוגרפיה (מיקרו-CT) סריקה. על סמך תמונות CT ברזולוציה גבוהה של תירס גזע, עלים, שורש, אנו מתארים שני פרוטוקולים לניתוח פנוטיפי של חבילות עילאיים: (1) על סמך התמונה CT של תירס גזע, עלים, פיתחנו צינור ניתוח תמונה ספציפית באופן אוטומטי לחלץ 31 33 תכונות פנוטיפי של חבילות עילאיים; (2) מבוסס על סדרת תמונות של CT של שורש תירס, אנחנו להגדיר ערכת עיבוד תמונה עבור תלת-ממדי (3-D) חלוקת metaxylem כלי חילוץ דו-ממדית (2-D) ותכונות פנוטיפי תלת-ממדיים, כגון עוצמת, פני שטח של כלי metaxylem, וכו לעומת מדידה ידנית מסורתית של וסקולריים צרורות של חומרים תירס, הפרוטוקולים המוצע באופן משמעותי לשפר את היעילות והדיוק של כימות פנוטיפי בקנה מידה מיקרון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת כלי הדם תירס עובר את הצמח כולו, מן השורש גזע עלים, המהווה את נתיבי תחבורה מרכזיים עבור אספקת מים, חומרים מזינים מינרלים, חומרים אורגניים1. תפקיד חשוב נוסף של מערכת כלי הדם היא לספק תמיכה מכנית של הצמח תירס. לדוגמה, מורפולוגיה, מספר, והפצה של חבילות וסקולריים השורשים, הגבעולים קשורה קשר הדוק ההתנגדות לינה של צמחי תירס2,3. בזמן הנוכחי, מחקרים על המבנה האנטומי של חבילות וסקולריים בעיקר לנצל מיקרוסקופיים וטכניקות ultramicroscopic כדי להציג את מבנה אנטומי של חלק מסויים של גזע, עלים, או שורש, ואז למדוד ואת לספור את המבנים הללו של ריבית על ידי חקירה ידנית. אין ספק, מדידה ידנית של מבנים מיקרוסקופיים שונים ב- microimages בקנה מידה גדול היא עבודה מאוד מייגע ולא יעיל, שמגביל מאד את מידת הדיוק של תכונות microphenotypic, בשל הסובייקטיביות שלה, חוסר עקביות4, 5.

תירס יש אין התפתחות משנית, וכן התוכן מורכב בעיקרו במים meristem הראשי. ללא כל רעלני, טריים דגימות של רקמות תירס ניתן ישירות לסרוק באמצעות מכשיר מיקרו-CT; עם זאת, תוצאות הסריקה הם כנראה עני ומחוספס. הסיבות העיקריות מסוכמים כדלקמן: (1) הנחתה נמוך צפיפות של רקמות הצמח, וכתוצאה מכך ניגוד נמוכה של המספר האטומי ורעש גבוה בתמונות; (2) צמח טרי חומרי נוטים הביתי של הפסיכולוג במהלך הסריקה הסביבה הרגילה, כפי שדווח על ידי Du6. הבעיות הנ ל הפכו האילוצים העיקריים עבור פיתוח, יישום של טכנולוגיה microphenotyping תירס, חיטה, אורז, monocotyledons אחרים. . כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול הכנה דגימה' כדי pretreat את הדגימות של תירס גזע, עלים, שורש. פרוטוקול זה מונע התייבשות של דפורמציה של הצמח חומרים במהלך ה-CT סריקה; לכן, זה מועיל להגדיל את זמן השימור דוגמאות צמחים עם nondeformation. יתר על כן, הצעד צובעת המבוסס על יוד מוצק גם משפר את החדות של הצמח חומרים; לכן, זה גורם שיפורים משמעותיים באיכות הדמיה של מיקרו-טי יתר על כן, פיתחנו תוכנות עיבוד תמונה, בשם VesselParser, כדי לעבד את התמונות CT של תירס גבעולים ועלים. תוכנה זו משלבת סט צינורות עיבוד תמונה לבצע ניתוח phenotyping תפוקה גבוהה, אוטומטי לתמונות CT דו-ממדי של רקמות שונות. חבילות עילאיים, כל חתך הרוחב של גזע תירס, עלה מזוהים, חילוץ, מזוהה באמצעות שיטת עיבוד תמונה אוטומטי. כתוצאה מכך, אנו משיגים 31 פנוטיפים מיקרוסקופיים של הגזע תירס ו ה33 פנוטיפים מיקרוסקופיים של העלה תירס. עבור הסדרה תמונת CT של השורש תירס, פיתחנו ערכת עיבוד תמונה לרכוש תכונות פנוטיפי תלת-ממדי של כלי metaxylem. ערכה זו עדיפה על היעילות של ייבוא תמונות ושיחזור לעומת שיטות מסורתיות.

תוצאות אלה מציינים כי התמונה עיבוד צינורות בהתחשב שמאפייני מיקרו רנטגן רגילים-CT הדמיה מספקות שיטה יעילה עבור phenotyping מיקרוסקופית של חבילות עילאיים; זה מאוד ומצרה את היישומים של CT טכניקות במדעי הצמח ומשפר את phenotyping אוטומטי של צמח חומרי-רזולוציה הסלולר6,7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מדגם הכנת פרוטוקול

  1. עבור הדגימה, לאסוף את הגזע, עלים, שורש מצמחים תירס טריים, לחלק אותם לשלושה סוגים של קבוצות המדגם (כל קבוצה עם שכפולי ארבע). לאחר מכן, לחתוך אותם לחלקים קטנים באמצעות סכין כירורגית באופן הבא: (1) לחתוך קטע באמצע גזע internode 1-1.5 ס מ אורך; (2) לחתוך קטע הרוחב המרבי של העלה 0.5 - 3 ס מ אורך לאורך הכיוון האנכי עם הווריד הראשי; (3) לחתוך קטע של השורש הכתר 0.5 ס מ אורך.
  2. עבור הקיבעון FAA, לטבול את מקטעי הדוגמה פתרון FAA (90:5:5 v/v/v, 70% אתנול: 100% פורמלדהיד: 100% חומצה אצטית) לפחות 3 d.
  3. בצע את ההליך התייבשות שישה רציפים אתנול במעברי צבע (כלומר, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% ל- 100%) ולהגדיר את זמן העיבוד של כל צבע אתנול כ 30 דקות.
  4. מניחים את החומרים צמח הסלים הדגימה המתאימה מיוצרים באמצעות מדפסת תלת-ממדית; לאחר מכן, במהירות העברה הסלים מדגם לתא מדגם של2 CO נקודה קריטית מערכת ייבוש. הגדר את פרמטרי ייבוש כדלקמן:
    (1) CO2 ב: מהיר מהירות. בעל מילוי: 100%.
    (2) תשלום: CO2 תשלום עיכוב 120 s לתוך המחזור. להחליף מהירות: 5. מחזור מספר: 12.
    (3) גז החוצה: חום, מהר. מהירות: איטי, 50%.
    1. על פי ההבדלים מורפולוגי של שורש תירס, גזע, עלים, סלים מדגם עיצוב, הדפסה באמצעות מדפסת תלת-ממדי (למשל, איור 1).
  5. מקם את החומרים צמחים מיובשים (שורש תירס, גזע או עלה) שפופרת צנטרפוגה 50-mL עם דור 2 של יוד מוצק כדי לצבוע את החומרים צמח עם אדים נדיפים יוד, אז, במקום הצינורות בחדר lightproof 4-5 שעות.

2. מיקרו-CT פרוטוקול סריקה

  1. כדי לסרוק לתוך הנתונים הגולמיים CT, הגדרת ה-CT סריקה פרמטרים כדלקמן: µA 40 kV/250 (עבור גזע, עלים) או 34 µA kV/210 (של הבסיס). הגדר המתאימה סריקה טווחים בגדלים שונים, אמצעי האחסון של החומרים צמח בהם ולאחר להתאים את גודל פיקסל הדמיה כדלקמן: 2.0 מיקרומטר (עבור בסיס תירס) מיקרומטר 6.77 (עבור הגזע תירס), 10.0 מיקרומטר (עבור עלה תירס).
  2. כדי לשחזר תמונות פרוסה, להמיר CT הנתונים הגולמיים לתוך CT פרוסה תמונות ברזולוציה 2K (2,000 x 2,000 פיקסלים) באמצעות תוכנה שחזור התמונה. פרטים נוספים ניתנים במדריך למשתמש NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. התמונה פרוטוקול ניתוח עבור תמונת CT יחיד של גזע תירס או עלה

הערה: השתמש אוטומטית תוכנות הדמיה וסקולריים חבילות לערוך ניתוח phenotyping של חבילות וסקולריים בתוך הדימויים פרוסה CT של תירס הגבעול, העלים (איור 2). השלבים השימוש בתוכנה מתוארים כדלקמן.

  1. למנות את סוג האיבר לאתחל את צינורות אלגוריתם שונה. לחץ על לחצן פרמטרים של פעולות שירות ובחר גזע תירס או עלה תירס בתיבה הנפתחת הראשונה.
  2. כדי לייבא את התמונות, לחץ על לחצן ניהול נתונים , הגדר את ספריית עבודה וייבוא אוטומטית כל פרוסה תמונות בספריה זו. בחר תמונות בודדות או פרוסה רב לתוך הצינורות התמונה.
  3. לקבוע את גודל פיקסל בפועל של התמונה. לחץ על לחצן פרמטרים של פעולות שירות והזן את גודל פיקסל בפועל של התמונה בתוך הפריט ערוך של גודל פיקסל.
  4. עבור חישוב phenotyping, לחץ על לחצן Phenotyping חישוב אוטומטי לחלץ תכונות פנוטיפי של חבילות וסקולריים לכל התמונות פרוסה שנבחרו.
  5. לחץ על לחצן ניתוחים סטטיסטיים פלט התוצאות כתבנית קובץ TXT או CSV.

4. התמונה פרוטוקול ניתוח עבור CT סדרת תמונות של ספריית בסיס תירס

הערה: הסדרה תמונת CT של שורשים תירס מנוצלים כדי לחלץ את מבנה תלת-ממדי של אוניות metaxylem באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. השלבים העיקריים הם כדלהלן.

  1. לייבא את התמונות המשוחזרת של שורשים תירס (בתבנית קובץ BMP), לקבוע את הפרמטרים מרווח מדויק (גודל voxel [קרי, x, y, z]). השתמש בכלי גאוסיאנית רקורסיבית להחליק את התמונות האלה. כדי לשפר את איכות התמונה.
  2. התנהלות פילוח תלת-ממדי של כלי metaxylem על-ידי התאמת הפרמטרים הסף; זה יוצר תווית צבע אחיד עבור כל כלי metaxylem מחוברים.
  3. לשפר ולזהות את כלי metaxylem באופן אינטראקטיבי באמצעות מורפולוגיה, bitwise, ופעולות מבול מילוי.
  4. לבצע שחזור ויזואליזציה, משטח האחסון של כלי. השתמש בכלי הסטטיסטיקה מסיכה כדי לספור ולמדוד את התכונות פנוטיפי של קיבול של רמות דו-ממדיים ותלת -ממדיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הכנה מדגם מתאים סריקה מיקרו-CT רגיל לא רק מונעת את דפורמציה של רקמות הצמח אך גם משפר את הניגוד ספיגת קרני רנטגן. צמח pretreated חומרים נסרקים באמצעות מערכת מיקרו-CT לתמונות באיכות גבוהה פרוסה, הרזולוציה הגבוהה ביותר יכול להגיע 2 מיקרומטר לפיקסל. איור 4 מציג את התמונות הסרוקות מיקרו-CT של גזע, עלים, שורש, הניגוד בתמונה יש שיפור משמעותי לעומת התוצאות שנסרקו מחומרים טריים צמח. הדימויים פרוסה CT, הבדלים משמעותיים ברמת אפור ערכים הם מקהים בין חבילות וסקול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם יישום מוצלח של CT טכנולוגיה בתחומים של וההתערבות, הנדסת חומרים, טכנולוגיה זו בהדרגה נכנס בתחומי בוטניקה וחקלאות, קידום מחקרים בתחום מדעי החיים צמח ככלי טכני מבטיח . בשנות ה-90 המאוחרות, טכנולוגיית CT שימש קודם ללמוד את מבנה מורפולוגי והפיתוח של מערכות השורשים של הצמח. בעשור האחרון, סינכרוטרון HRCT הפך להיות כלי רב עוצמה לא הורסות לביולוגים צמח, שימש בהצלחה כדי לזהות את רקמת מבנים של מערכת כלי הדם ענבים8, מבנה רקמות של תודרנית עלה9 , ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי את הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין (No.31671577), המדע, הטכנולוגיה חדשנות מיוחד בניה במימון תוכנית בייג'ינג האקדמיה של החקלאות Sciences(KJCX20180423) יערנות, המחקר תוכנית פיתוח של סין (2016YFD0300605-01), קרן מדעי הטבע בייג'ינג (5174033), בייג'ינג פוסט-דוקטורט מחקר קרן (2016 ZZ-66), ואת האקדמיה החקלאית בייג'ינג יערנות מדעי גרנט (KJCX20170404) ( JNKYT201604).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Skyscan 1172 מערכת טומוגרפיה ממוחשבת רנטגןBruker Corporation, בלגיהNAלסריקת
CT CO2 מערכת ייבוש נקודה קריטית (Leica CPD300)Leica Corporation, גרמניהNAלייבוש מדגם
אתנולכלNAלקיבוע FAA
פורמלדהידכלNAלקיבוע FAA
אצטי חומצהכלNAלקיבוע FAA
להב כירורגיכלNAלחיתוך המדגם
מדפסת תלת מימדמשכפל Makerbot 2, MakerBot Industries, ארה"בNAלהדפסת סלי הדגימה של שורש תירס, גבעול
ועלים צינור צנטריפוגהקורנינג, ארה"בNAהנח את חומרי השורש, הגבעול או העלים
יוד מוצקכלNAלדוגמא צביעה
של תוכנת SkyScan NreconSkyScan NRecon, גרסה: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiumNAלשחזור תמונה
תוכנת VesselParserVesselParser, גרסה: 3.0, המרכז הלאומי למחקר הנדסי לטכנולוגיית מידע בחקלאות (NERCITA), בייג'ינג, סיןNA פרוטוקול ניתוח תמונה לתמונת CT בודדת של גזע תירס או עלה
ScanIPScanIP, גרסה: 7.0; Simpleware, אקסטר, בריטניהNAתוכנת עיבוד תמונה תלת מימד
כפפות לטקסכלפינצטה NA
כלNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CT

מאמרים קשורים