מאמר שיטה

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

DOI:

10.3791/58523

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא מהווה גורם מרכזי בכישלון biomaterials/רפואי התקנים. Staphylococcus aureus הוא אחד פתוגנים העיקריים בבאי. הנוכחי ניסיוני באי חיה בתרבית של מודלים כגון עכבר הדוגמניות יקר זמן רב, ולכן לא מתאים לניתוח תפוקה גבוהה. לפיכך, מודלים חדשניים כמערכות משלימים עבור חוקרים באי ויוו הם הרצויה. בהווה לומדים, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital של זיהום חיידקי בנוכחות biomaterials מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בנוסף, התגובה מקרופאג שעורר נחקר. למטרה זו, אנו להביע חלבון פלואורסצנטי S. aureus ו דג זברה מהונדס עוברי המבטאים חלבונים פלורסנט ב מקרופאגים שלהם ופיתח הליך להחדיר חיידקים לבד או יחד עם microspheres לתוך השריר רקמות העובר. כדי לפקח על התקדמות זיהום חיידקי העוברים לחיות לאורך זמן, אנחנו המציאו שיטה פשוטה אך אמין של הניקוד מיקרוסקופיים של חיידקים פלורסנט. התוצאות ניקוד מיקרוסקופיים הראו כי כל העוברים עם יותר מ-20 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הניב אות ניאון חיובית של חיידקים. במחקר השפעת פוטנציאל biomaterials על זיהום, קבענו המספרים CFU של S. aureus עם ובלי microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials ב העוברים. יתר על כן, השתמשנו קובץ פרוייקט ObjectJ "דג זברה-Immunotest" הפועלים ImageJ לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית זיהום S. aureus עם ובלי PS10 לאורך זמן. תוצאות של שתי השיטות הראו מספר גבוה יותר של S. aureus עוברי נגועים עם microspheres מאשר בעוברי ללא microspheres, המציין את הרגישות של זיהום מוגבר בנוכחות biomaterial. לפיכך, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של המודל העובר דג זברה ללמוד באי עם השיטות התפתחו כאן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון רחב של מכשירים רפואיים (המכונה "biomaterials") משמשים יותר ויותר ברפואה המודרנית לשחזר או להחליף את גוף האדם חלקים1. עם זאת, ההשתלה של biomaterials predisposes מטופל זיהום, בשם הקשורים biomaterial זיהום (באי), אשר אחד הסיבוכים העיקריים של שתלים בניתוח. Staphylococcus aureus סטפילוקוקוס epidermidis שתי הנפוצות ביותר מיני החיידקים אחראי באי2,3,4,5,6בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מושתלים biomaterials טופס משטח ביופילמים חיידקים רגישים. יתר על כן, תגובה חיסונית מקומית עשויה להיות מופרע על ידי biomaterials מושתל, גורם היעילות מופחתת של חיסול חיידקים סיווג ראשוני של הדבקה חיידקים מתבצע בעיקר על ידי הסתננות נויטרופילים, אשר בתוקף מופחתת קיבולת אחרים בנוכחות שנוסף או מושתל biomaterial7. יתר על כן, מקרופאגים שחדר הרקמה אחרי זרם הראשונית של נויטרופילים phagocytose את החיידקים הנותרים אבל לא יעיל להרוג אותם intracellularly, עקב מטורף החיסונית איתות כי הוא תוצאה של המצאות משולב biomaterial וחיידקים8. לכן, הנוכחות של biomaterials יכול להקל על תאיים הישרדות של חיידקים9,10,11,12,13 biofilm היווצרות על מושתל 4,biomaterials14. כתוצאה מכך, באי עשוי להוביל לכשל, זקוק להחלפה של מושתל biomaterials, גורם תחלואה מוגברת ואת התמותה, אשפוז ממושך עם עלויות נוספות2,15.

מספר גדל והולך של אנטי-באי אסטרטגיות מתבצעת מפותחת2,16,17. In vivo הערכת יעילות של אסטרטגיות אלו הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים היא חיונית. אולם, מסורתי באי בעלי חיים ניסיוניות (למשל, העכבר דגמים) הם בדרך כלל יקרים, זמן רב, ולכן לא מתאים לבדיקה תפוקה גבוהה של אסטרטגיות מרובות18. התפתחות של ביו-אופטיים טכניקות הדמיה המבוססת על זוהרים/פלורסנט תיוג של התאים המארחים וחיידקים עשוי לאפשר לניטור רציף של האינטראקציות התקדמות, המארח-פתוגן/מארח-חומר באי בודד חיות קטנות כגון עכברים18,19,20,21. עם זאת, טכניקה זו מורכבות יחסית עדיין בחיתוליו, ויש מספר בעיות שמחייבות לניתוח כמותי של באי18. למשל, מנה האתגר גבוהה נדרשת כדי להמחיש מושבת חיידקים. בנוסף, אור פיזור, ספיחה של אותות ביולומינסנציה/זריחה ברקמות של מבחן בתרבית של בעלי חיים צריך להיות גם התייחס18,19,21. לכן, חדשנית, חסכונית מודלים בעלי חיים המאפשר ויזואליזציה intravital וניתוח כמותי לאורך זמן הן מערכות משלימות יקר ללמוד באי ויוו.

דג זברה (עוברי) שימשו ככלי ויוו רב-תכליתי ניקוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, זיהום בפתוגנזה של מספר מינים חיידקי mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli26,24, Enterococcus faecalis25ו- staphylococci27. דג זברה עוברי יש יתרונות רבים כגון שקיפות אופטית, עלות תחזוקה נמוכה יחסית וכן אחזקת מערכת חיסונית דומה מאוד לזו יונקים28,29. זה הופך את העוברים דג זברה אורגניזם מודל כלכלי מאוד, חי ויזואליזציה intravital וניתוח של התקדמות הזיהום, המארח המשויך תגובות28,29. כדי לאפשר ויזואליזציה של התנהגות התא דג זברה ויוו, הטרנסגניים קווים עם סוגים שונים של תאים חיסוניים (למשל, מקרופאגים, נויטרופילים), אפילו עם מבנים subcellular fluorescently מתויג היה פותח28 ,29. בנוסף, שיעור גבוה רבייה של דג זברה מספק את האפשרות לפתח מערכות בחינה תפוקה גבוהה הכוללת הזרקה אוטומטית רובוטית, כימות פלורסצנטיות אוטומטיות ולאחר ניתוח רצף הרנ א27, 30.

במחקר הנוכחי, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה biomaterial-הקשורים בזיהום באמצעות טכניקות הדמיה זריחה. לשם כך, פיתחנו הליך להזריק חיידקים (S. aureus) בנוכחות biomaterial microspheres לתוך רקמות שריר של דג זברה העוברים. השתמשנו S. aureus RN4220 לביטוי mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus- mCherry), אשר נבנה כמתואר עבור S. aureus עוד זן10,31. הקו דג זברה מהונדס (mpeg1: קאךה/UAS) המבטאת קאךה חלבון פלואורסצנטי ירוק, המקרופאגים32 ו כחול ניאון פוליסטירן microspheres שימשו. במחקר הקודם, אנחנו הראו כי זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך דג זברה עוברי לחקות biomaterial ההשתלה הוא ריאלי33. לנתח באופן כמותי את ההתקדמות של באי וחדירה תא המשויך של אחד העוברים לאורך זמן, היינו את קובץ הפרוייקט "דג זברה-Immunotest" המופעל בתוך "ObjectJ" (יישום plug-in עבור ImageJ) לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים השוכנים ומקרופגים שחדר באזור ההזרקה של microspheres33. בנוסף, קבענו את המספרים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הנוכחות ואת היעדר microspheres של העוברים ללמוד ההשפעות האפשריות של biomaterials על זיהום. המחקר הנוכחי שלנו מדגים השיטות התפתחו כאן, העובר דג זברה הוא מודל בעלי חוליות מבטיח, הרומן לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוטוקול זה, תחזוקה של דג זברה בוגרת עומדת בדרישות תקנות רווחת בעלי חיים מקומיים כפי שאושר על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מקומיים. ניסויים עם עוברי בוצעו על פי הדירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי.

1. הכנת "חיידקים בלבד", תרחיפי החיידקים-microspheres

הערה: המתח RN4220 S. aureus לבטא mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus- mCherry) משמש. המתח RN4220 S. aureus הוא מוטציה של התקפה אלימה מווסת הגן אגרה (ג'ין אביזר הרגולטור א)34, לכן ייתכן שיהיה נמוך יחסית התקפה אלימה במודל העובר דג זברה. זנים אחרים aureus ס או מיני חיידקים אחרים עבור באי יכול לשמש.

  1. לקחת 4 עד 5 מושבות של חיידקים RN4220 S. aureus מן tryptic סויה אגר תרבות צלחות בתוספת 10 µg/mL כלורמפניקול, התרבות החיידקים לשלב צמיחה אמצע-לוגריתמי ב 10 מ ל מרק tryptic סויה בתוספת 10 µg/mL כלורמפניקול ב 37 ° C תחת רועדת.
    1. במהלך תרבות, לדלל µL 100 של ההשעיה חיידקי ב µL 900 תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) ב cuvette (רוחב של 1 ס מ) למדידה צפיפות אופטית (OD)-620 nm (OD620). התרבות החיידק עד יתר620 מגיע 0.4 – 0.8.
      הערה: את יתר620 של 0.1 בדרך כלל מתייחס 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. יתר620 של inoculum של חיידקים בשלב הצמיחה לוגריתמי באמצע הוא בין 0.4-0.8. ייתכן שיהיה צורך ובתקופות זמן שונות culturing עבור מינים אחרים של זנים של חיידקים.
  2. צנטריפוגה חיידקים ב x 3,500 g למשך 10 דקות, מחדש להשעות את החיידקים pelleted ב 1 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר מכן לשטוף את החיידקים עם פי PBS 2 סטרילי, סוף סוף מחדש להשעות את החיידקים ב 1.1 מ של 4% (w/v) פוליוינילפירולידון40 (PVP40) פתרון PBS.
  3. מערבולת ההשעייה חיידקי, שתדללו 100 µL של ההשעיה ב µL 900 ל- PBS סטרילי ב cuvette עבור המידה620 OD. התאם את הריכוז של המתלה חיידקי עם פתרון40 PVP. זהו ההשעיה "חיידקים בלבד".
  4. Biomaterials ניתן לבחור באופן חופשי לערבב עם חיידקי ההשעיה. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש מסחרי פוליסטירן (PS) microspheres (פלורסנט כחול, 10 מיקרומטר). כדי להפיק השעיה חיידקים-Microspheres, centrifuge את microspheres עבור 1 דקות ב- 1,000 x g, בטמפרטורת החדר, למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את microspheres ההשעיה "חיידקים בלבד" (בפתרון40 PVP).
  5. כדי להזריק מינון שווים בקירוב של חיידקים הנוכחות, בהיעדרו של microspheres, הריכוז של חיידקים-Microspheres הבולם צריכה להיות שני שלישים של הריכוז של המתלה "חיידקים בלבד" (ללא microspheres). זו מושגת על ידי דילול ההשעיה חיידקים-Microspheres עם נפח 0.5 בפתרון40 PVP. מערבבים את המתלים על-ידי vortexing. ראוי לציין, היחס הזה (שני שלישים) יש כבר שקובעת S. aureus. זה גם מתאים epidermidis ס, אך מומלץ לבדוק אם יחס זה חל גם על מיני חיידקים אחרים, אחרים (מ- 10 מיקרומטר) או צורות biomaterials (מ- microspheres) כדי להיות מוזרק.
  6. בדוק את הריכוז של המתלה "חיידקים בלבד" של חיידקים-Microspheres על-ידי תרבות כמותית של דילולים טורי 10-fold להלן: העברת 100 µL של המתלים היה טוב-plate ורכים באופן סדרתי על ידי העברת aliquots 10 µL של ההשעיה לתוך µL 90 ל- PBS סטרילי. צלחת aliquots µL 10 כפולים של המתלים מדולל, מדולל על צלחות agarose, דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, לספור את המושבות ולחשב את המספרים של חיידקים (המושבה יוצרי יחידות. CFU).

2. גידול, קציר, ותחזוקה של עוברי דג זברה

  1. בצע את שגרות כלליות שתואר קודמות35,36 רבייה, קציר, ותחזוקה של דג זברה עוברי, עם השינויים המתוארים להלן. לחצות משפחה של פראי סוג Tupfel פין ארוך (TL) דג זברה או דג זברה של הקו הטרנסגניים שנבחר (כאן, Mpeg1: קאךה) במיכל עם רשת הוסיף לזירוז הנקבות מבוגרים כדי ליצר ביצים לאחר נדלקת, ואז להפריד מבוגרים מן הביצים המיוצר.
  2. לאסוף את העוברים למחרת ולמחוק את אלה שאינם שקופים אשר אינם קיימא. להוציא כ 60 העוברים לכל צלחת פטרי (100 מ מ קוטר) E3 בינוני37 : דגירה ב 28 º C. להסיר עוברי מת ולא תקינה, ולרענן את המדיום E3 מדי יום.

3. הכנת מחטים הזרקת

  1. הכינו את המחטים microcapillary זכוכית להזרקה שימוש בכלי פולר micropipette. השתמש בהגדרות הבאות: חום: 772, משיכה: 100, ול: 200, זמן: 40, גז: 75.
  2. לשבור את מחט עם מלקחיים במיקום שבו יש המחט של הקוטר החיצוני של 20 מיקרומטר (עבור 10 מיקרומטר microspheres), באמצעות מיקרוסקופ אור עם בר בקנה מידה העינים. הימנע מחטים עם גודל הפתיחה גדולים מאוד, כמו שהם תסכן את ההישרדות של העוברים.
    הערה: הפתח עשוי להיבחר להיות קטן או גדול יותר, בהתאם לגודל ולצורה של biomaterials כדי להיות מוזרק. בספרות, זריקות באמצעות מחטים עם פתיחה של-50 מיקרומטר דווחו לגרום ירידה משמעותית העובר הישרדות38.

4. הזרקה של "חיידקים בלבד" או השעיה של חיידקים-microspheres לתוך עוברי דג זברה

  1. מחממים agarose פתרון (1-1.5% (wt) במים-דמי) באמצעות תנור מיקרוגל ויוצקים לתוך צלחת פטרי 100-מ מ. מניחים תבנית כייר פלסטיק על הפתרון agarose בצלוחית הפטרי ליצור כניסות agarose להנחה עוברי בעמדות נאות, דבר המקל על זריקות. דגירה בטמפרטורת החדר ולהסיר את התבנית כאשר הפתרון agarose התחזק.
  2. ב 3 d שלאחר ההפריה, מקם את העוברים בצלוחית 100 מ מ המכיל חומצה 0.02% (w/v) 3-aminobenzoic (Tricaine) כדי להרדים אותם. לאחר 5 דקות, להעביר את העוברים הצלחת agarose ועליהן E3 בינוני המכיל 0.02% (w/v) Tricaine וליישר אותן באותו כיוון להזרקה. עבור Mpeg1: קאךה הטרנסגניים קו ראשון להרדים עוברי ב- E3 בינוני המכיל tricaine 0.02% (w/v). לאחר מכן בחר עוברי המבטאים חלבונים ניאון ירוק באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו.
  3. לטעון את המחט עם µL כ 10 של ההשעיה "חיידקים בלבד" או חיידקים-Microspheres באמצעות טיפ פיפטה microloader. לטעון את המחט אל micromanipulator מחובר המיקרו-מזרק. עבור מזרק משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), השתמש בהגדרות הבאות זריקות של 2-3 nL: לחץ: 300-350, לחץ אחורי: 0, זמן: 2 מילי-שניות.
    הערה: ההגדרות עבור המיקרו-מזרק תלויות מזרק בשימוש. מזרק הגדרות ייתכן שתצטרך לכוונן את זריקות של חיידקים מעורבב עם biomaterials עם צורות או גדלים אחרים.
    1. השתמש מחטים עם פתיחת זהה עבור ההזרקה של המתלה "חיידקים בלבד" ואף מאששות חיידקים-Microspheres. אם המחט שבורה או סתומות, תמיד לשנות עבור מחט חדשה לזריקות עוד יותר.
  4. הכנס את המחט לתוך רקמות שריר של העוברים תחת מיקרוסקופ אור (איור 1), בזווית של 45 – 60 מעלות בין המחט לגוף העובר. להתאים את המיקום של המחט בתוך רקמת בעדינות להזיז את זה אחורה וקדימה. להזריק את העוברים באמצעות דוושת מחובר המיקרו-מזרק.
  5. לאחר ההזרקה של חיידקים פלורסנט, להבקיע את העוברים זיהום מוצלח תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו. למחוק את השלילי עוברי הבקיע (אין בקטריות פלורסנט גלוי או לא microspheres פלורסנט גלוי). לשמור על עוברי בנפרד ב- E3 במדיום. ובכן 48 לוחות. רענן המדיום מדי יום.

5. ריסוק של העוברים, הבקיע מיקרוסקופיים והתרבות כמותית של חיידקים

  1. ציון כל העוברים ברמה המיקרוסקופית, נוכחות של חיידקים פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלורסצנטיות, החל מיד לאחר הזריקות, ועל כל יום לאחר מכן עד העוברים נבחרו באופן אקראי לתרבות כמותית.
  2. באופן אקראי בחר מספר העוברים נגוע בשידור חי (5 עד 6 במחקר הנוכחי) זמן קצר לאחר ההזרקה, להעביר אותם בנפרד microtubes mL 2 נפרדים באמצעות טיפים סטרילי. להסיר את המדיום, לשטוף את העוברים בעדינות עם PBS סטרילי פעם ולהוסיף µL 100 ל- PBS סטרילי.
  3. להוסיף 2-3 סטרילי זרקוניה חרוזים (2 מ מ קוטר) כל בקבוקון ולרסק את העוברים באמצעות את מהמגן (ראה טבלה של חומרים) ב 3500 סל ד ל 30 ס' תרבות homogenate באופן כמותי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: לטקס אחרים עשויים לדרוש הגדרות שונות.
  4. לבחור באקראי העוברים בימים הבאים לאחר ההזרקה לתרבות כמותי לפי שלב 5.3.

6. זריחה מיקרוסקופיה של התקדמות הזיהום, שעורר תא בחדירת עוברי דג זברה

  1. להרדים את העוברים כפי שמתואר בשלב 4.2. פיפטה µL 500 של PBS - 2% (wt) מתיל תאית פתרון לתוך צלחת פטרי המכילות בינוני E3 עם 0.02% (w/v) Tricaine. הכנס את העוברים הפתרון מתיל תאית ולשמור אותם ישר ואופקי.
    הערה: מתיל תאית פתרון משמש "דבק", אשר עקב שלו צמיגות, יכול לשתק זמנית עוברי בכיוון הטוב ביותר עבור הדמיה.
  2. שימוש במיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו מצויד עם שדה בהיר, mCherry, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו- UV מסננים העוברים הבודדים תמונה תחת הגדרות ממוטבת זהה (למשל, עוצמת הגברה, חשיפה זמן) בהגדלה 160 x . להגדיר את מטוס מוקד כך הנזק לרקמות שנגרם על ידי ההזרקה נמצא בפוקוס, באמצעות מסנן שדה בהיר. הגדר את עומק Z-מחסנית בגודל מיקרומטר, שלב 10-5 מיקרומטר, המאפשר הקלטה של 3 תמונות רצופות.
  3. התמונה עוברי בודדים מדי יום מ- 5 שעות לאחר הזרקת עד 2 ימים שלאחר הזרקת. הכללת עוברי המת (אין דופק או העובר בחלקו מושפל) עבור הדמיה נוספות וניתוח. לשמור על עוברי בנפרד ב- E3 במדיום. ובכן 48 לוחות. רענן המדיום מדי יום.

7. ניתוח כמותי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית התקדמות הזיהום, שעורר תא חדירה באמצעות קובץ הפרוייקט אובייקט J "דג זברה-Immunotest"

  1. הורד "דג זברה-Immunotest", המדריך מפורט מהקישור: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, כפי שמתואר במחקר הקודם33. בקצרה, לפתוח תמונות עבור ניתוח עם "דג זברה-Immunotest", שפעלו תחת התוכנית freeware תמונה ג' לכל תמונה שנטענה, סימון ידני של ההזרקה בהתבסס על הנזק נצפתה רקמה של העוברים.
    הערה: האתר מסומן משמש "דג זברה-Immunotest" בתור נקודת המרכז לזהות קרינה פלואורסצנטית השיא למרחק של 50 מיקרומטר. הפסגה פלורסצנטיות שזוהו ואז משמש כמרכז אזור מתוקנן (קוטר של 100 מיקרומטר) פלורסצנטיות מדידה.
  2. לחץ על "חישוב" בתפריט ' אובייקט J ' כדי להפעיל את המידה פלורסנט עבור ערוצים מרובים, אם רלוונטי, באופן אוטומטי עבור כל התמונות. לייצא את הנתונים ולנתח על ידי שיטות המבחן הסטטיסטי המתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי העריכו את הישימות של דג זברה עוברי כמודל הרומן חוליות בבעלי חיים עבור חוקרים הקשורים biomaterial זיהום. טכניקת microinjection כבר בשימוש נפוץ להחדיר מינים שונים של חיידקים לתוך דג זברה עוברי לגרום זיהום22,26,27,30,36. שימוש בהליך המתואר באיור1, S. aureus לבד או יחד עם 10 מיקרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא סיבוך רפואי חמור. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של באי ויוו תספק תובנות חדשות על מנת לשפר את מניעה וטיפול של באי. עם זאת, הנוכחי ניסיוני באי מודלים בעלי חיים כגון מודלים מאתר יקר, עתירי עבודה, והן דורשות אנשי סגל מומחים ברפואת טכניקות ניתוחיות מורכבות. לכן, מודלים אלה אינם מתאימים לניתוח תפוקה גבוהה. כיוון דרישות עבור דג זברה העובר מודלים מורכבים פחות עלויות באופן כללי נמוכים לדגמים מאתר, המחקר הנוכחי העריך אם דג זברה עוברי יכול לשמש כמודל בעלי חוליות חדשניים עבור חוקרים באי ויוו, משלים ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה כלכלית, מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט איביזה של התוכנית חומר ביו-רפואי (BMM), והיתה שותפה במימון הולנדית משרד חקירות כלכליות. המחברים רוצה להודות פרופ ' ד ר גרהם Lieschke מאוסטרליה, אוניברסיטת מונש למתן הקו דג זברה מהונדס (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגר סויה טריפטיBD Difco236950יחידת הכנת מדיה ב-AMC
מרק סויה טריפטיBD Difco211825
פוליוויניל פירולידון40ApplichemA2259.0250
10 ומיקרו; מיקרוספירות פוליסטירן בקוטר m (פלואורסצנט כחול)טכנולוגיית חיים/ThemoFisherF8829
מיקרו-קפילרי זכוכית (1 מ"מ OD x 0.78 מ"מ ID)הרווארד מנגנון30-0038
מכשיר מושך מיקרופיפטהSutter Instrument Incבוער p-97
מיקרוסקופ אור LM 20LeicaMDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
סטריאו פלואורסצנטי מיקרוסקופ LM80LeicaMDG3610450126
קצות פיפטה מיקרו-מעמיסEppendorf5242956.003
מיקרומניפולטור M3301 עם מעמד M10World Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet אקספרס מיקרו-מזרקEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 מ"ל ppSarstedt72.693.005
חרוזי זירקוניהBio-connect11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
MSA-2 צלחות (מניטול מלח אגר-2)Biomerieux43671Chapmon 2
בינוני מתיל צלולוז 4000cpסיגמא-אולדריץ'MO512-250G
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C0378
שייקר ג'ירוטרי (לגידול חיידקים)ניו ברונסוויק סיינטיפיקG10
חממת דג זברהVWRIncu-line
קובטותמותג759015
צנטריפוגהHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
ספקטרומטרPharmacia ביוטקUltrospec® 2000
מלקחייםסיגמא-אולדריץ'F6521-1EA
48 צלחות בארגריינר ביו-וואן677180
96 צלחותבאר גריינר ביו-וואן655161
צלחת פטריפלקון353003
צלחתפטרי BiomerieuxNL-132
ImageJלא ישיםישיםקישור: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0פריזמהלא ישים
לא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63(2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584(2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697(2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255(2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781(2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779(2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59(2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ObjectJ ImageJ

מאמרים קשורים