מאמר שיטה

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

DOI:

10.3791/58542

⸱

18 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאינוריה נובעת שיבוש המסנן glomerular המורכבת אנדותל fenestrated גלומרולרי במרתף, podocytes עם דיאפרגמות חריץ שלהם. המבנה העדין של המסנן glomerular, במיוחד הסרעפת שסע, מסתמכת על יחסי הגומלין של חלבונים פני שטח התא מגוונות. לומדים אלה חלבונים פני שטח התא כה הוגבלה במבחנה בלימודים או ניתוח היסטולוגית. כאן, אנו מציגים biotinylation מאתר ויוו תיוג שיטה, אשר מאפשר חקר חלבונים פני שטח התא glomerular בתנאים הפיזיולוגיות, pathophysiologic. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של חלבון עניין. כימות למחצה של שפע פני שטח התא glomerular ונותרות עם שיטה חדשנית זו, נגיש זלוף ביוטין כל החלבונים, ניתן יהיה ללמוד immunoprecipitation. בנוסף, בידוד של glomeruli עם או בלי biotinylation מאפשר עוד ניתוח של glomerular RNA, חלבון, כמו גם תרבית תאים glomerular הראשית (קרי, תרבית תאים של podocyte הראשית).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאינוריה מהווה סימן היכר של פציעה glomerular ומלווה בדרך כלל שיבוש מסנן glomerular1. המסנן glomerular מורכב של אנדותל fenestrated, גלומרולרי במרתף, podocytes. המבנה המולקולרי העדין של המסנן glomerular היא דינמית מאוד על תאי הדם בבני אדם בשתי הכליות בריאים וחולים2,3,4,5,6 . אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא הוכח חיונית להישרדותו של podocytes7. Nephrin podocalyxin transmembrane חלבונים לידי ביטוי podocytes בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. Nephrin הוא עמוד השדרה של הסרעפת שסע glomerular, בעוד podocalyxin הוא sialoglycoprotein ציפוי תהליכי רגל משני podocytes8,9,10. סחר endocytic שהוצג בעבר עבור nephrin ו- podocalyxin3,11,12,13,14.

לפי מיטב ידיעתנו, אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא לא עוד תואר בתאי האנדותל glomerular בספרות. עם זאת, תאי אנדותל לבטא באופן כללי כל החלבונים הדרושים עבור סוגים שונים של אנדוציטוזה (קרי, אנדוציטוזה clathrin תלוית, תלויי-רפסודה)15,16. לכן, תאי אנדותל משטח סחר עשויים להילמד בשיטה זו משתמשים, לדוגמה, אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, מולקולה אדהזיה תאיים (ICAM-2) כמו תא משטח סמן חלבון תאי אנדותל glomerular17 .

למרבה הצער, יש אין מודל מדויק במבחנה למסנן עדין שלוש שכבות glomerular בתא שבו הדם סחר יכול להילמד. המטרה של שיטה זו היא ובכך ללמוד חלבון glomerular סחר ויוו. בנוסף, פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד לבודד glomeruli, המאפשר ניתוח של glomerular RNA, חלבונים, או תאים. דומה בידוד glomerular טכניקות תוארו על ידי שונים קבוצות18,19.

בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו שמחוץ תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular מאת biotinylation2,3,4,20,21. עם זאת, בשיטה זו שמחוץ , מבודד glomeruli נחשפו ללחץ מכני, העלולים להשפיע על סחר endocytic. לחלופין, immunofluorescence תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular בהרחבה שימש בספרות2,20,22. בשיטה זו, עם זאת, ניתן לנתח כמות קטנה של חלבונים בתוך שקופית אחת, כימות של immunofluorescence תמונות קשה לעיתים קרובות.

השיטה הרומן ויוו מציעה כלי אמין ללמוד glomerular תא הדם שפע וסחר במדויק בתוך בריאים וחולים הכליות, זה יכול לשמש כתוספת בדיקות immunofluorescence.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים התקבלו כמו גזע ללא צורך במיקור חוץ מתקן טיפול בבעלי חיים מקומיים או מעבדות Janvier בצרפת. החקירות נערכו על פי ההנחיות המפורטות במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה (ארה ב נבחרת מוסדות של בריאות פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). כל הניסויים בוצעו על פי האישורים מוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת LANUV להפנות מספר AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. הכנת כלי נגינה, פתרונות וציוד

  1. להכנת 1 ליטר של תמיסת מלח פוספט באגירה מלאה בתוספת 1 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2) ו- 0.1 מ מ סידן כלורי (2CaCl) (PBSCM) ולסנן אותו דרך מסנן סטרילי.
  2. להתכונן 5 מ של PBSCM סטרילי לכל העכבר זלוף ומניחים אותו על קרח.
  3. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילית בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין.
  4. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילי, להוסיף 0.8 x 108 beads מגנטי (למשל., 200 µL של8 4 x 10 חרוזים/mL פתרון, ללא רעלני) עבור אמבוליזציה של glomeruli. להכין פתרון זה תחת הספסל התרבות התא כדי לשמור את החרוזים מגנטי סטרילי הצינור המקורי. במקום פתרון זה על קרח.
  5. להכין פתרון quenching על-ידי הוספת 100 מ מ גליצין PBSCM (5 מ"ל לכל עכבר) ולשמור אותו בקרח.
  6. להפוך את פתרון collagenase (0.378 U/mL collagenase א ב PBSCM סטרילי). לכל עכבר, פיפטה 1 מ"ל של הפתרון collagenase לתוך צינור 2 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
  7. עבור כביסה, להכין PBSCM סטרילי (ראה שלב 1.1) ב- 50 מל צינור ומניחים אותו על קרח.
  8. זלוף, להשתמש משאבת מזרק עם זרם של 2.0 mL/min.
  9. להכין מזרק 10 מ"ל עם מחט 21G. מניחים את קצה המחט צנתר ארוכה 20-30 ס מ (הקוטר הפנימי, ID = 0.58 מ מ). לחבר את הקטטר (מזהה 0.58 מ"מ) עם צנתר קצר 10 ס מ (מזהה 0.28 מ מ) חותכים את קצה הקטטר קטנים עקיפה עבור ההכנסה בקלות לתוך העורקים העכבר.
  10. להליכי קשירה במהלך הניתוח, חותכים שלושה 5-7 ס מ חוטי משי (4-0 ל- 6-0) לכל העכבר.
  11. . לניתוח, להכין 3 מלחציים כירורגי, מספריים כירורגיים 2, פינצטה 2, 2 פינצטה בסדר, מספריים בסדר 1, מטליות. הכינו את ההרדמה (למשל, בקרום הבטן הרדמה קטמין 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  12. עבור בידוד של glomeruli של שתי כליות, השתמש מסננת תא 100 מיקרומטר, שני צינורות 50 מ ל, תופס מגנט.
  13. תתכוננו בחורים פירוק מאגר: 20 מ מ 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (בחורים); 20 מ מ טריס (hydroxymethyl)-aminomethan (טריס) pH 7.5; sodiumchorlide 50 מ מ (NaCl); sodiumfluoride 50 מ מ (NaF); 15 מ מ נה4P2O7; 0.1 מ מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0; sodiumorthovanadate 2 מ מ; adenosinetriphosphat 2 מ מ (ATP).
  14. צנטריפוגות מגניב עד 4 ° C.

2. ניתוח מתחת למיקרוסקופ

  1. עזים ומתנגד העכבר (למשל, עם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים intraperitoneally, ראה שלב 1.11). לבצע את הבדיקה הבוהן-קמצוץ לאשר הרדמה. ראויה.
  2. לחטא הצד הבטני של העכבר עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
  3. לבצע חתך החציוני דרך העור מן האגן לעצם החזה ולהסיר את העור fascia בטן באמצעות פינצטה. לחתוך את העור משני הצדדים באמצע הבטן עם מספריים כירורגיים.
  4. שינוי כלי ניתוח. להחיל חתך החציוני של מצאתי שלפוחית השתן דרך השכבה שריר הבטן, לחלק את אותם ארבעת הרבעים באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי. לצרף את העליונות בצד שני עם התפסים כלפי הצוואר של העכבר עם שני תופסנים כירורגי.
    הערה: הבטן עכשיו נפתח.
  5. לשים איברים הקרביים הצידה עם מקלון סטרילי, לחתוך רצועה ולשננו-הסרעפת עם מספריים משובחים.
  6. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים צינתור עורקי כליות על הגובה של בלוטת יותרת הכליה עם פינצטה בסדר שני. להדק את מצדו של אבי העורקים proximal לבטל זרימת הדם עם פינצטה.
  7. חינם העורקים דיסטלי fascia, שומן, רקמות אחרות והכן של מצדו סביב עורק מצע המעי/העליון ולשננו הגולגולת של העורקים הכליות באמצעות פינצטה כירורגית משובחים.
  8. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים דיסטלי של העורקים כליות, מלחציים הנבוב העליון של אבי העורקים בשיא ההסתעפות.
  9. לחתוך חור קטן לתוך העורקים דיסטלי העורקים כליות כך החור הוא מחצית מהקוטר של אבי העורקים. מכניסים את הצנתר העורקים ותקן אותה באמצעות הקשירה מוכנה.
    זהירות: יש להימנע בועות במערכת זלוף כדי למנוע. תסחיף אוויר.
  10. נתחיל זלוף PBSCM קר כקרח בספיקה של 2 mL/min.
  11. לחתוך חור לווריד כליות ברמה של העורקים כליות עם מספריים כירורגיים בסדר והדק את מצדו סביב העורקים הכבד, מצע המעי העליון.
    הערה: הכליות צריך לפנות חיוור לאחר הפעלת את זלוף.

3. Biotinylation in Vivo

  1. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין עבור משטח labelling, והוא perfuse כליות 5 מ ל קצב הזרימה של 2 mL/min.
    הערה: לערבב את הפתרונות PBSCM (למשל, על-ידי הפעלת הצינורות 50 מ ל) בעדינות כדי למנוע יצירת בועות בתוך הפתרון. לאחר השאיפה של הפתרון בתוך המזרק, לפנות את כל בועות או אוויר מן המזרק. להשתמש בצינורית תוספת של (21 גרם) על המזרק כדי למלא את החלל ב הצינורית המחוברת למערכת קטטר. לבסוף, לתחוב את המזרק לתוך הצינורית עם הצנתר ללא בועות.
  2. לשנות את המזרק ללא בועות PBSCM קר כקרח בתוספת 100 מ מ גליצין להרוות glomeruli, perfuse עם 5 מ ל- זרם של 2 mL/min.
  3. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 200 μL מגנטי חרוזים/mL, perfuse כליות ב 2 mL/min.
    הערה: על פני השטח כליות, אמבוליזציה של glomeruli עם חום beads מגנטי יהיה גלוי.

4. בידוד של Glomeruli מ שתי כליות

  1. להסיר כליות ב hilum ולהסיר את הקפסולה. מניחים את הכליות על הקרח ב-15 מיליליטר PBSCM בצלחת תרבות תא 10 ס מ. המתת חסד את העכבר עם נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה לאחר לקצור את הכליות. ההליכים זלוף ובבית האחרון כ 20-22 דקות.
  2. לחתוך הכליות לחתיכות הקטן ביותר האפשרי עם להב כפול-קצה חדש. להזיז את הרקמה לתוך צינור 2 מ"ל עם 1 מ ל collagenase א (ראה שלב 1.6), תקציר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני ואחרי תהליך העיכול, מערבבים בעדינות עם μL 1000 לחתוך פיפטה.
  3. יש לשטוף את הרקמה מתעכל דרך מסננת 100 μm התא באמצעות PBSCM קר כקרח. להשתמש בעדינות את התא-במגרדת מינצ את השוקת הרקמה הנותרת מסננת התא, לשטוף אותו עם PBSCM קר כקרח לאחר מכן את הנפח הכולל של 50 מ.
  4. Centrifuge את המתלים ב 4 ° C g 500 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מעט פחות מ- 1.5 מ ל PBSCM קפואים בזמן vortexing בגדר. לאחר מכן, מכניסים את המתלים glomerular צינור 2 מ"ל.

5. כביסה

  1. השתמש הנדפק מגנט למשוך glomeruli לצד אחד. המתן 1 דקות לפני glomeruli עברו לכיוון המגנט.
  2. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה μL 1000 בעוד הצינור 2 מ"ל נשאר בהתפסן מגנט. במהלך השטיפה הראשונה והשניה צעדים (ראה שלב 5.3), 250 μL שרידי supernatant בצינור כדי להימנע מאובדן glomeruli. בצע הליך זה במהירות כדי להימנע לתת מבנים צינורי לשקוע לתחתית הצינור.
    הערה: ההליך כביסה מעמד אחרת.
  3. להסיר את הצינור 2 מ"ל מגנט התופס ולהוסיף 1 מ"ל של PBSCM, פיפטה למעלה ולמטה (חשוב מאוד), אז מערבולת.
  4. תחזיר את הצינור לתוך הנדפק מגנט ולהתחיל מחדש עם צעד 5.2.
  5. חזור על השלבים כביסה עד טוהר glomeruli הגיעה 90%. בשביל זה, לבחון aliquot הנציגה של תגובת שיקוע תחת מיקרוסקופ (40-100 X).
    הערה: Glomeruli יופיעו כמבני עגול המכיל beads מגנטי חום. מבנים מאורכים שברי צינורי הינם חינם beads מגנטי להופיע כנקודות סיבוב חום. שאריות תאים עשויים להופיע כמבני מגושם.
  6. אם טוהר הגיעה, הערכה הרוזן glomeruli על ידי המסת glomeruli ב 1 מ"ל של PBSCM. לאחר ערבוב, של aliquot של 10 μL ואין ספור glomeruli מתחת למיקרוסקופ. לחשב את מספר glomeruli עם המשוואה הבאה: המספר הסופי של glomeruli = מספר glomeruli ב 10 μL aliquot x 100.
  7. הבידוד מוצלח של glomeruli מוביל מגוון glomeruli 10,000-40,000.

6. חלבון חילוץ ו- Immunoprecipitation (IP)

  1. Glomeruli לאסוף על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 6800 עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע תוך שימוש תופס מגנט, resuspend בגדר במאגר פירוק כקרח (למשל., 30,000 glomeruli ב- 300 μL; חברים, ראה שלב 1.11). Homogenize את הדגימות עם רקמות מהמגן במהירות הגבוהה ביותר ב-30 s ואת lyse אותם על קרח למשך 30 דקות.
  2. מסירים חומרים לא מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 15,000 g x במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Pipette את תגובת שיקוע הכולל את התא lysate לתוך צינור 1.5 mL החדש. להתעלם בגדר.
  3. למדוד את ריכוז חלבון תגובת שיקוע על-ידי שימוש של bicinchoninic (BCA)-המבוסס על שיטת ההוראות של היצרן. פירוק מוצלחת של 30,000 glomeruli התשואות על כמות חלבון glomerular של 700-1, 000 µg/mL. להתאים כמויות חלבון שווה עם פירוק מאגר.
  4. . קח את aliquot של 10% מהנפח הכולל עבור glomerular lysate ולהוסיף 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) לפני הדגירה למשך 5 דקות ב 95 ° C.
  5. עבור ה-IP, דגירה שאר lysate עם חרוזים agarose streptavidin בין לילה-4 מעלות צלזיוס על שייקר תקורה.
  6. צנטריפוגה agarose חרוזים ב 1000 x g למשך 3 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע והוסף μL 800 פירוק מאגר לשטוף את החרוזים עבור איגוד חלבון לא ספציפי.
  7. חזור על לשטוף את 3 פעמים, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין.
  8. להוסיף 30 μL של 2 x Laemmli + DTT, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  9. טען את lysate ואת ה-IP הגששים-מרחביות 10% ג'ל ולהפעיל את הג'ל מרחביות 70 V למשך 30 דקות, ואז בגיל 20 אמא לכל ג'ל ה 1.5 לאחר מכן, למחוק את הג'ל על 2 h ב- 200 mA על קרום ניטרוצלולוזה.
  10. לחסום את הקרום ניטרוצלולוזה בן לילה ב 4 ° C עם 5% אלבומין שור (BSA) ב שטיפת מאגר.
  11. דגירה הקרום עם הנוגדן עניין בן לילה ב 4 º C. לשטוף עם שטיפה מאגר 3 פעמים במשך 5 דקות על מטרף, דגירה הקרום עם הנוגדן משני מתויג HRP לשעה בטמפרטורת החדר. חזור על השלב כביסה.
  12. דמיינו את lysate, immunoprecipitation רגשים על הקרום באמצעות סוכן chemiluminescent סופר רזולוציה עם מצלמת CCD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבודד glomeruli באופן מדויק, יש צורך perfuse מאתר הכליות עם PBSCM קודם. זלוף עם PBSCM פונה הכליות חיוור (איור 1א'). אמבוליזציה של glomeruli עם חרוזים מגנטי יהיה גלוי כנקודות חום על פני כליות (איור 1B). בידוד של glomeruli עם התפסן מגנט עשוי להראות זיהום עם כליות tubuli (איור 1C). לפני ניתוח נוסף של glomeruli, > 95% טוהר של glomeruli צריך להיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה הציג מאפשר בידוד מוצלחת של glomeruli לחקור glomerular RNA או החלבון. בנוסף, ניתן לבצע תרביות תאים glomerular הראשית glomeruli מבודד. אם ביוטין מוחל לפני glomerular בידוד, תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular יכולה להתבצע. בשיטה זו, אין ויוו glomerular תא הדם סחר יכול להילמד, כימות למחצה של חלבון שפע אפשרית. השלבים הקריטיים ביותר בהצלחה בדיקה שפע חלבונים פני שטח התא glomerular הם 1) פיתוח ידני מומחיות בניתוח העכבר במיוחד תעלות של אבי העורקים, 2) בועה ללא חיבור של מזרקים כדי למנוע אוויר אמבוליזציה של glome...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים Duvnjak בלנקה על סיוע טכני יוצא דופן שלה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח (www.dfg.de) WO1811/2-1 כדי M.W. ו- QU280/3-1 על מנת משכל Funder היה לא תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, ההחלטה לפרסם ולאחר ההכנה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מוטיק SMZ168 BLSMZ168BL מוטילניתוח עכברים
KL1500LCDמיקרוסקופיה פולץ' ולורנץ150500אור לניתוח עכברים
רומפון (קסילזין) 2%באיירPZN:01320422הרדמה
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rמספריים עדינים, לחיתוך אבי העורקים
Durotip Feine Scherenבראון, AesculapBC210Rלחתך בטן
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rלניתוח עד לפתיחת הבטן
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rלניתוח 
SeraflexSerag Wiessnerחוט משיIC108000
קטמין 10%Medistarהרדמה
Rompun (Xylazin) 2%Bayerהרדמה
עדינה נשא פוליאתן ID 0.28 מ"מ OD 0.61 מ"מPortex800/100/100קטטר
קדח עדין צינור פוליאתן ID 0.58 מ"מ OD 0.96 מ"מPortex800/100/200קטטר
מכשיר הרווארד 11 פלוסהרווארד מכשיר70-2209משאבת מזרק
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinThermo Scientific21335ביוטין
Dynabeads תאי T של עכבר לא נגעוInvitrogen11413Dלהטמעת גלומרולי
קולגנאז ARoche10103578001לעיכול רקמת כליה
DynaMag-2Invitrogen123.21Dלוכד מגנטים
100&מיקרו; מכתים תאיםm Greiner-bio542000לבידוד גלומרולרי
Axiovert 40 CFLZeissלא זמיןלאישור טוהר גלומרולרי
TissueRuptorQuiagen9002755הומוגנייזר רקמות
CHAPSSigma-AldrichC3023עבור מאגר ליזה
Tris-HCLSigma-AldrichT5941עבור מאגר
NaClVWRכימיקלים 27810295עבור מאגר ליזה
NaFSigma-Aldrich201154עבור מאגר ליזה
EDTASigma-AldrichE5134עבור מאגר ליזה
ATPSigma-Aldrich34369-07-8עבור מאגר ליזה
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Scientific23225עקוב אחר הוראות היצרן
נוגדן נפריןProgenGP-N2עבור Westernblot
Polyclonal עז נוגדן נגד פודוקליקסיןR& D SystemsAF15556-SPעבור Westernblot
Streptavidin Agarose ResinThermo Scientific20347עבור אימונו-משקעים
חלבון A sepharose CL-4BGE Healthcare17096303עבור חיסון משקעים
ארנב פוליקלונלי נוגדן נגד p57SCBTsc-8298עבור נוגדן אימונוהיסטוכימיה
עכבר חד-שבטי אנטי בטא אקטין, שיבוט AC-74Sigma-AldrichA2228בקרת טעינת כתמים מערביים
אנטי-p44/42איתות תאים4695עבור westernblot
Pierce רגישות גבוהה סטרפטווידין-HRPThermo Scientific21130
לעכבר פוליקלונלי מערבי ICAM-2 נוגדן R& D SystemsAF774עבור
עכבר פוליקלונלי מערבי נגד VE-cadherinR& D SystemsAF1002עבור Westernblot
מיקרוסקופ ליזה ארנב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

מאמרים קשורים