הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

38.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58565

⸱

15 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, 2No.2 Middle School of Shijiazhuang, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 4Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.

תקציר

הזרקת במחלה (IT) של adeno-הקשורים וירוס (AAV) יש עניין רב ב- CNS ריפוי גנטי מכוח את הבטיחות, noninvasiveness, והיעילות התמרה חושית מעולה שלופה מערכת העצבים. מחקרים קודמים הדגימו העוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל. עם זאת, שיעור גבוה של כשל לא צפוי עקב המגבלה הטכנית של הממשל זה חיות קטנות דווחו. . הנה, הקמנו מערכת הניקוד כדי לציין את מידת ההצלחה מותני אצל בעלי חיים קטנים על-ידי הוספת 1% לידוקאין הידרוכלוריד בתוך תמיסת הזרקה. בהמשך נראה כי מידת החולשה ארעית לאחר ההזרקה ניתן לחזות את יעילות התמרה חושית AAV. לכן, בשיטה זו זריקה זה יכול לשמש כדי למטב טיפולית ניסויים במודלים של העכבר של מחלות מערכת העצבים המרכזית מעשן יותר אזורים רחב של מערכת העצבים.

מבוא

AAV יכולים לתווך גנים בהעברת CNS עם מעט תופעות לוואי לטווח ארוך ונפוץ, ולכן הפך לאחד הרכבים המבטיחים ביותר עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות CNS כולל נוירודגנרטיביות (ALS), הנטינגטון (HD), מחלת אלצהיימר (AD), באנזימים מחלות (LSD), מחלת Gaucher (GD) מחלות ceroid עצביים lipofuscinosis (NCL)1. כיום, יותר מ-100 AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם היה מבודד של בני האדם ובעלי החיים. בין אלה, לפחות 12 השתמשו בפרה, ניסויים קליניים, כולל הנפוץ ביותר בשימוש ג'ין וקטורים כגון AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ו- rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.

מחלות מערכת העצבים המרכזית שונות דורשות אסטרטגיות שונות משלוח AAV עקב אזורים המושפעים CNS סוגי תאים שונים. CNS אזורים של התא סוגי AAV יכול מגלי משתנה בהתאם serotype כמו גם שיטת מסירה. לדוגמה, rAAVrh10 הוכח מגלי בעיקר האסטרוציטים כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידי סיסטמי (IV), ואילו זה transduced נוירונים וגם עכשיו, דונלד כאשר נמסר על ידי במחלה הזרקה4,7. בנוסף, הביאו parenchyma הזרקת התמרה חושית מקומיים כדי באזור ההזרקה, ואילו זריקה לתוך הנוזל מוחי שדרתי (CSF) דרך ע או הזרקת במחלה, גרמו CNS נפוצה של התמרה חושית8 . מחקרים גם הראו עוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל9,10,11. מחלות המשפיעות על אזורים רחבים של מערכת העצבים כגון ALS, במחלה הזרקה לתוך CSF הוכח כדי לכסות את רוב אזורים נגועים על ידי המחלה במינון נמוך, בהשוואה למשלוח מערכתית שיטה4,10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם שאת המותני ניתן להזריק AAV במודלים של העכבר על ALS, אשר מונע פציעות פוטנציאליות המשויך צנתור laminectomy ולא במחלה4.

ניסיוני מותני ישירה שימש תחילה למסור סוכנים, בייחוד הרדמה, חוט השדרה שיכוך כאבים, הרדמה 188512,13. בדו ח זה, אנו ממחישים הניקוב המותני זה בשיטת הזרקת בעכברים בוגרים בסיועם של 1% לידוקאין הידרוכלוריד, מקומיים אמיד-derived הרדמה, בפתרון הזרקת להעריך, לפקח על איכות הזרקה. זריקות מוצלחות סומנו על ידי לידוקאין-induced שיתוק חולף, בעוד זריקות כושלות לא הראה התנהגות זו. אנו מסווגים את הרמה של חולשה ארעי כאחת חמישה ציונים כדי לעזור לחזות את יעילות הזרקת. לבסוף, אנו מראים כי רמת התמרה חושית rAAVrh10 עשוי להיות שמנבאת את הציון של שיתוק. לכן, שיטת העברה זו במחלה AAV יכול לשמש כדי לשפר את המסירה הגן בתיווך AAV לטיפול ניסיוני של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

FVB/NJ עכברים התרבית במתקן בעלי חיים של מעבדה מפתח לנוירולוגיה של חביי. כל עכבר ניסויים היו שאושרו על-ידי השנייה בבית החולים של חביי רפואי אוניברסיטת ועדת האתיקה, עפ י התקנון של ניהול חיות מעבדה שיפורסמו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין.

1. הכנת 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות

  1. שוקל 2 גר' לידוקאין הידרוכלוריד. להוסיף 5-6 מ"ל של מים סטריליים, מערבולת בעדינות. להגדיל את נפח כולל של 10 מ"ל מים סטריליים.
  2. 1.2 לסנן את הפתרון מניות דרך מסננים 0.2-מיקרון. Aliquot הפתרון מניות, 1 מ"ל לכל microcentrifuge 1.5 mL צינור, לאטום אותו עם סרט איטום. חנות ב 4 º C.

2. לכוון את משלוח במחלה AAV בעכברים ער

  1. לנגב אזור העבודה באמצעות גזה סטרילית עם 70% אתנול ולהכין את הציוד הנדרש כאמור בטבלה1.
  2. להכין µL 100 של AAVrh.10/1% הידרוכלוריד לידוקאין מורכבים על-ידי הוספת µL 95 של rAAVrh10 מניות פתרון (5 x 1012 הגנום עותקים/mL) לתוך צינור microcentrifuge µL 200 סטרילי, ולהוסיף 5 µL של 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר מכן, אחסן את הפתרון וירוס על קרח (4 ° C).
    הערה: µL 8 לכל העכבר4 ישמש.
  3. הכנת את המזרק עם פתרון AAV להזרקה
    1. להרכיב µL 25 המילטון מזרק עם מחט 27 G, יישר את קצה המחט עם המשקל הנפחי. משופע על המזרק.
    2. צייר µL 8 עם 4 x 1010 עותקים הגנום של הפתרון וירוס לתוך המזרק בעדינות. הקפד להסיר בועות אוויר.
  4. הכנת העכבר
    הערה:     עכברים FVB/NJ זכר או נקבה (בן 30-70 ימים) השתמשו במחקר זה. הזרקת זה הופעל בשכונה.
    1. לעקר את אזור העבודה בשכונה עם 70% אתנול. לשים את העכבר ער (זכר או נקבה, 30-70 ימים בת 13 – 20 גרם משקל) bedpiece במצב של שכיבה בשכונה. מכסים את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר להימנע ננשך.
    2. לתקן את החיה על-ידי כשתפסת כראוי, בחוזקה על המחוך באגן הירכיים שלה עם אגודל על האצבע בצד ובאמצע/לאצבע אחת בצד השני. לשמור על העור בין מחוכים האגן דו צדדיים מתוח כאשר האגודל לאצבע. החזק בעדינות על הגוף העליון של החיה עם כף היד.
    3. לגלח את הפרווה על גבו בין מחוכים האגן דו צדדיים, ולאחר מכן לחטא לפני השטח של העור עם יודיד סקראב ו- 70% אתנול מבוסס.
  5. במחלה הזרקת12
    1. להרגיש את השטח בין-חולייתי לאורך הקו האמצעי בין מחוכים האגן הדו-צדדיים עם האגודל או לאצבע של היד השנייה והקש ההזחה עם ציפורן כדי לציין את החלל בין-חולייתי L5-L6 (אתר ההזרקה).
    2. לסובב את בסיס הזנב מעט ובעדינות כדי לציין האמצע של עמוד השדרה. להתאים את המסגרת המשופעת המחט אל הראש של החיה לפני ההזרקה (שהוזכר בשלב 2.3.1).
    3. ודא כי החיות הן קבועות בחוזקה, ליישר את המחט לאורך הקו האמצעי של עמוד השדרה.
    4. את המחט בעדינות ואנכית (או להטות מעט 70 – 80°) בצומת של כניסה ולשמור המזרק במטוס sagittal המרכזית. להקטין את הזווית כ 30° באיטיות כאשר הוא מחובר לעצם, ואז להחליק את המחט לתוך המרחב בין-חולייתי.
      הערה: סרט ניכר הזנב פתאומי הוא סימן כניסה מוצלחת לחלל intradural. ברגע שהמחט נכנסת לשטח בין-חולייתי, ירגיש קצה המחט בחוזקה בחוזקה. המחט 27 G השתמשו במחקר זה מתאים למשלוח זה עכברים אך לא חולדות.
    5. להזריק את הפתרון וקטור (שהוזכר בשלב 2.2). להתחיל את הטיימר ולהזריק 8 µL של הפתרון וקטור במהירות של µL/4 1 ס שמור המחט כ 1 דקות לאחר סיום הלידה. לשלוף את המחט עם סיבוב עדין כדי להימנע דולף.
    6. ציון חולשה ארעית של העכבר הגפיים מיד לאחר הלידה כדי להעריך את איכות הזרקה4.
      הערה: התקן הוא כדלקמן4. ציון 0: חולשה; ציון 1: מינור חולשה של הגפיים האחוריות בלי הילוך חריגות; ציון 2: בינוני חולשה של הגפיים האחוריות עם ההליכה ברור חריגות; ציון 3: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות; ציון 4: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות, קוצר נשימה, חולשה מתונה של הגפיים פור; ציון 5: להשלים שיתוק של כל ארבעת הגפיים, ניכר קוצר נשימה.
    7. להזיז את העכבר בחזרה לכלוב. שחזור משיתוק.
  6. ניקיון
    1. לרוקן את המזרק עם 1 מ"ל מים סטריליים. ציוד מעבדה למיין ולאסוף את כל החומרים שאינם חד פעמיות עבור עיקור בלוק. לנקות את הספסל עם 70% אתנול.

3. רקמות הכנה נוגדן

  1. אוסף רקמה
    1. עזים ומתנגד עכברים ב 21 ימים שלאחר ההזרקה עם 3% כלורין (0.1 מ"ל של 10 גרם) עמוקות על ידי זריקה בקרום הבטן.
    2. Perfuse transcardially עם 20 מ של 0.01 M קר כקרח PBS (NaCl 147 מ"מ; 2PO NaH4 1.9 מ מ; K2HPO4 מ"מ 8.1, pH 7.4) ראשית, ואז 4% קר כקרח paraformaldehyde (ב- PBS 0.01 M) עם משאבה (10 מ ל/דקה עבור 1 דקות, ואז 5 mL/min במשך 9 דקות).
      התראה: Paraformaldehyde הוא מסרטנים רעילים. . להתמודד עם זה רק בשכונה fume בעת לבישת כפפות
  2. דיסקציה של חוט השדרה, המוח
    1. לתקן את הגפיים, ראש כל בעל חיים במצב של שכיבה על קופסת קצף לכסות עם מחטי מזרקים, להתפשט ואז מסירים את העור מהראש כדי סקרום עם מספריים.
    2. קליפ הגולגולת בין העיניים, לחתוך לצד המסלול האמצעי של הגולגולת, קו אופקי על המוח הקטן, ואז לפתוח את הגולגולת לשני הצדדים.
    3. הרם את עצם העורף עם פינצטה, לפתוח את תעלת השדרה באופן דו-צדדי עם מספריים אופטלמולוגיות. לחתוך את הצלעות משני הצדדים ולהסיר את החצי העליון של חוליות בקפידה.
    4. תרים את המוח עם פינצטה מעוקל, לנתק את העצבים של בסיס הגולגולת, לאחר מכן לנתח בזהירות החוצה כל המוח ואת חוט השדרה. פוסט-לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות ביממה.
  3. הכנת הרקמה פרוסות
    1. Cryoprotect המוח ואת חוט השדרה הצווארי, המותני בפתרון 30% סוכרוז למשך הלילה ב 4 º C. להטביע את הרקמה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ומקפיאים מהר עם חנקן נוזלי.
    2. חותכים את הרקמה מיקרומטר 25 באמצעות cryostat ולאחסן הסעיפים קפוא ב- 0.01 M PBS ב 4 ° C לשימוש.

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. Pretreat לתרשים ובסעיף 1% H2O2 למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף ב- PBS במשך 10 דקות Incubate בפתרון חסימה המכילה 5% סרום, דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS לשעה.
  2. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים העיקרי המקביל בן לילה ב 4 º C. לשטוף בסעיפים PBST (0.2% 20 Tween ב- PBS) במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).
  3. דגירה את הפרוסות עם נוגדן המתאים ביוטין-משני בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לרחוץ PBST במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).
  4. דגירה הסעיפים עם זיקה ביוטין peroxidase מורכבים למשך 40 דקות, כתם עם סוכן achromogenic. הר הסעיפים על גבי שקופיות ויבש כראוי.
  5. להשרות את השקופיות אתנול נטול מים במשך 5 דקות, קסילן למשך 10 דקות, ואז לאטום את השקופיות עם מדיום הרכבה. לבסוף, תמונה השקופיות עם מיקרוסקופ מצויד עם תשלום מצמידים מכשיר (CCD)-100 x, 200 x ו- 400 x הגדלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עכברים הראה דרגות שונות של חולשה חולף מיד אחרי זה הזרקה של פתרון AAV הידרוכלוריד לידוקאין 1% בשל איכות שונות של הזרקת במחלה. על פי כמותיים חצי כיתה 5 מערכת התוצאות הקמנו, בדקנו את הדפוסים התמרה חושית של AAV בעכברים עם דרגות שונות של האיבר לידוקאין-induced חולשה (ציון 0, n = 2; ציון 1, n = 1; ציון 4, n = 4; ציון 5, n = 3). EGFP immunostaining של שידרה הראה אין או קטן התמרה חושית בחוט השדרה המותני של עכברים ניקוד 0, התמרה חושית משופרת במקצת בעכברים ניקוד 1 ו transductions חזקה ונפוץ בעכברים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכנית, ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך הזריקה זה בעכברים ער. ראשית, ראוי המחווה ושליטה המשרד של העכברים לאורך כל המבצע הוא תנאי מוקדם מסירה מוצלחת. שנית, הנקודה הכי קשה הוא מרגיש את החלל בין-חולייתי עם קצה המחט, כפי שנדרש לא להוסיף יותר מדי עמוק ללא התנגדות או להוסיף בכפייה תחת התנגדות חריפה במקרה של החיות או כיפוף קצה המחט. שלישית, למרות השיתוק ארעי עקב לידוקאין מספק מדד אובייקטיבי על זה הזרקת איכות, להתאמן יותר יש צורך להשיג תוצאות עקביות ומצליח.

בדו ח זה, פיתחנו שיטה הזרקה ישירה במחלה בעכברים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו מומן על ידי מענק של חביי המחוז המחלקה של משאבי אנוש, ביטוח לאומי (CY201605), מענק של מדעי הטבע קרן של מחוז הביי (H2017206101), ואנחנו מאוד אסיר תודה ד ר על גאו Guangping, שסיפק את AAV עבור מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי FVB/NJמעבדות צ'ארלס ריבר סין
לידוקאין הידרוכלוריד מונוהידראטHEOWNS73-78-9
AAVליבת וקטור ויראלי של המרכז לטיפול גנטי בבית הספר
25 ומיקרו; L  מזרק המילטון/מחט 27-30 גרםGASTIGHT1702
O.C.T compondSAKURA4583
H 2O 2SHUI HUAN PAI
סרום עיזיםSolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
ארנב אנטי-GFPLife techG103621:333 דילול
הנוגדן השני (עז-אנטי ארנב)Jackson Immuno Research111-005-1441:1,000 דילול
VECTASTAIN ABC REAGENTVector LabPK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase ערכת מצעוקטור מעבדהSK-4105
מדיום הרכבה לפלואורסצנטיות עם DAPIVectorshieldH-1200
NaClYong Da Chemical
NaH2PO4· 2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4· 12H2Oיונג דה כימי
פרפורמלדהידיונג דה כימי307699
הדבקה מיקרוסקופ שקופיותCITOGLAS1708325 מ"מ x 75 מ"מ
סופר-להחליק מיקרו-זכוכיתאלקטרו מיקרוסקופיה Siences72236-6024 מ"מ x 60 מ"מ
15 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430790
96 באר אשכול תרביות תאיםCoster3599
24 באר אשכול תרביות תאיםCoster3524
70% אתנולWEN ZHI
גזהWei AN05171112 8 ס"מ x 10 ס"מ x 12 ס"מ
מזרק 1 מ"ל HongDa
Microtubesפלזמה
מיקרופיפט eppendorf
פפט טיפיםRainin
Centirifugeeppendorf5427R
RegeratorHaierBCD-539WT
מסנןMILLEX GPR4PA42342
משאבתLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
מיקרוסקופאולימפוסBX53
מיקרוטום קפואLeicaCM1520
לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס 170401

מקורות

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAV
במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.