הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58582

⸱

1 בדצמבר 2018

 , 
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

תקציר

מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כרוך תא-תא אינטראקציות, מתווך בדרך כלל על ידי חלבונים המקיימים אינטראקציה בין תאים שכנים. עניין, רק כמה מבחני מסוגלים במיוחד חיטוט כזה אינטראקציות ישירות בתאים חיים. כאן, אנו מציגים assay כדי למדוד את הכריכה של חלבונים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הסמוכים, תא-תא באנשי קשר. Assay זו מורכבת משני שלבים: ערבוב של תאים המבטאים את החלבונים עניין התמזגו חלבונים שונה פלורסנט, ואחריו קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה מדידות-תא-תא אנשי קשר באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. נדגים את הכדאיות של זה וזמינותו בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי מודד את האינטראקציה של החלבון קודמן דמוי עמילואיד 1 (APLP1) על פני תאים תאים צמתי. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט על רכישת נתונים באמצעות טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה, קרוס-קורלציה למספר וניתוח בהירות) את הכיול כלי הנדרש. יתר על כן, נדון שלבים קריטיים ניתוח הנתונים וכיצד לזהות ולפתור וריאציות אות חיצוני, כדין, כגון אלה עקב photobleaching או תא תנועה.

באופן כללי, וזמינותו הציג ישימה לכל הומו - או אינטראקציית חלבון heterotypic תא-תא באנשי קשר, בין תאים סוגים זהים או שונים, יכול להיות מיושם על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. דרישה חשובה היא היציבות של המערכת, אשר צריך להיות מספיק לחקור דינמיקה דיפוזיה של החלבונים עניין במשך מספר דקות.

מבוא

תהליכים ביולוגיים רבים להתרחש בכל האתרים של תא-תא אינטראקציות, למשל, תא-תא אדהזיה1,2,3, תא-cell fusion4 וזיהוי הסלולר5. אירועים כאלה חשובים במיוחד במהלך הפיתוח של אורגניזמים רב תאיים, תקשורת, למשל, במהלך תגובות מערכת החיסון. תהליכים אלה הם בדרך כלל בתיווך חלבונים אשר מותאמים על פני השטח, קרי, ב קרום פלזמה (PM) של תאים שכנים ומבצעת אינטראקציות ספציפיות-הקשר תא-תא כי הם בדיוק הזמן והמרחב מוסדר. במקרים רבים, אינטראקציות אלה ישירה הומו - או אינטראקציות חלבון heterotypic טרנס , אך עשוי גם לכלול יונים או ליגנדים מתנהג כמו linkers חוץ-תאי1. למרות חשיבות היסוד, יש מחסור של מבחני הבדיקה אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפי אלה ישירות בסביבה הטבעית של תאים חיים. שיטות רבות דורשות גם לשבירת תאים (למשל, הביוכימי מבחני כגון co-immunoprecipitation6), קיבעון (למשל, כמה טכניקות במיקרוסקופ אופטי סופר רזולוציה ו מיקרוסקופ אלקטרונים של תא-תא קשר7), או שאינם ספציפיים, כגון: צבירת / מבחני אדהזיה8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, טכניקות קרינה פלואורסצנטית יושמו מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג)10 או קרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה11. עם זאת, כדי להשיג מספיק קטן המרחקים בין fluorophores, שיטות אלה דורשים תוויות פלורסנט בצד חוץ-תאי של חלבונים10, פוטנציאל מתנגש עם טרנס אינטראקציות.

כאן, אנו מציגים חלופי המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור אינטראקציות חלבון-חלבון תא-תא באנשי קשר. גישה זו משלבת גישות קרוס-המתאם קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה (sFCCS), מספר קרוס-המתאם ואת הבהירות (ccN & B)), ערבוב של תאים המבטאים בונה פיוז'ן של החלבון של . עניין, למשל, קולטן אדהזיה. קולטני ובדוקים בתאים שמעצבת שני מסומנות עם שני חלבונים פלורסנט spectrally מופרדים (FPs), מתאיים הצד (ראה איור 1 א').

השיטות מועסקים מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות המושרה על ידי התנועה דיפוזיה של פיוז'ן פלורסנט חלבונים דרך נפח מוקד של לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. יותר בפירוט, וזמינותו רגשים פעפוע שיתוף של החלבונים עניין במחזור שני שכנים תא-תא באנשי קשר. אם החלבונים עוברים אינטראקציות טרנס , אלה מתחמי טרנס ויישא חלבונים פלורוסנט פולטות בשני ערוצים ספקטרלי, גורם תנודות פלורסצנטיות מתואם של שנינו פולטים. מצד שני, אם הכריכה לא מתרחשת, מספר תנודות של חלבונים מול PMs תהיה עצמאית, גורם תנודות לא מתואם. הרכישה יכול להתבצע בשתי דרכים: 1) sFCCS מבוסס על סריקה בצורת קו לאורך הקשר תא-תא, רגשים ביעילות את האינטראקציות במקום הממוקמים באזור הקשר. דרך ניתוח הטמפורלי של תנודות פלורסצנטיות, sFCCS מספקת גם מידע dynamics, קרי, מקדמי דיפוזיה של מתחמי חלבון; 2) ccN & B מבוססת על ניתוח pixel-wise של רצף של תמונות רכשה את האזורים קשר תא-תא. יש יכולת בדיקה של אינטראקציות מפה לאורך כל קשר עם איזור (ב מישור מוקד אחד), אך אינו מספק מידע על דינמיקה. שתי השיטות יכול להיות משולב עם ניתוח של הבהירות מולקולרית, קרי, האות הממוצע פלורסצנטיות הנפלטת ביחידת זמן אחת מתחמי חלבון באמצעי ולספק, לפיכך, הערכות של סטויכיומטריה של מתחמי חלבון- תא-תא אנשי קשר.

במאמר זה, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכנת הדוגמא, כיול המכשיר, רכישת נתונים וניתוח לבצע את הבדיקה הציג על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. ניתן לבצע את הניסויים על כל כלי מצויד פוטון לספור או גלאי אנלוגי ולא אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה. אנו עוד יותר לדבר על שלבים קריטיים של הפרוטוקול, לספק ערכות תיקון עבור מספר תהליכי גורם תנודות אות artefactual, למשל, גלאי רעש, תנועה photobleaching או תא. פותח במקור כדי לחקור את האינטראקציות בין תאים חסיד, וזמינותו עשוי להיות שונה עבור השעיה תאים, או הותאם מודל ממברנה מערכות, למשל, unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) או פלזמה ענקית קרום שלפוחית (GPMVs), המאפשר כימות של אינטראקציות בסביבות השומנים שונה או בהיעדר שלד התא מאורגן12,13.

סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה גירסה שונה של קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה14 , תוכננה במיוחד כדי לחקור דינמיקה דיפוזיה איטית השומנים ממברנות15. הוא מבוסס על רכישה סריקה קו בניצב רה מ המכיל את החלבונים פלואורסצנט עניין. כדי לחקור אינטראקציות של שני המינים חלבון שונה שכותרתו, הרכישה מתבצעת בשני ערוצים ספקטרלי באמצעות שני קווי לייזר, שני חלונות איתור עבור fluorophores spectrally מופרדים. בשל הדינמיקה דיפוזיה איטית של חלבונים ברה מ (D≤ ~ 1 /s2מיקרומטר), מידה קרוס-לדבר נטול יכול להתבצע על ידי לסירוגין את ערכת עירור משורת בשורה15. הניתוח מתחיל עם: 1) תיקון אלגוריתם יישור לתנועה לרוחב התא מבוסס על block-wise בממוצע של ~ 1000 שורות, 2) קביעת המיקום עם פלורסצנטיות המרביכלומר הממשלה מיקום האות, בכל בלוק, 3) הסטה של כל הבלוקים על נפוצות מקור12,15, בנפרד בכל אחד מהערוצים. לאחר מכן, מבחר אוטומטית של פיקסלים רה מ מתבצע על-ידי בחירה באזור המרכז התאמה לפי עקומת גאוס הסיכום של כל הקווים מיושר (קרי, מרכז ± 2.5σ). שילוב של האותות בכל שורה התשואות ממברנה פלורסצנטיות סדרת הזמן F(t) בכל אחד מהערוצים (g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). שים לב כי גודל פיקסל חייב להיות קטן מספיק, למשל, < 200 ננומטר, לשחזר את צורת הנקודה להפיץ את הפונקציה ולמצוא את המרכז שלו, המתאים למיקום של ראש הממשלה. בנוכחות photobleaching משמעותית, סדרת הזמן פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים ייתכן המודל עם פונקציה מעריכית-כפול ויש לאחר מכן תוקן עם הנוסחה הבאה:16

figure-introduction-1.    (1)

חשוב לציין כי נוסחה זו מתקנת ביעילות amplitudes והן דיפוזיה פעמים המתקבל ניתוח המתאם של F(t)c, לעומת הערכות פרמטר זה ניתן להשיג את שלא תוקנו F(t). ואז, הפונקציות אוטומטי - ואת הצלב-קורלציה (ACFs / CCFs) של קרינה פלואורסצנטית החישוב של אותות:

figure-introduction-2, (2).

figure-introduction-3, (3).

איפה אלפאFאני = Fאני(t) - figure-introduction-4 Fאני(t)figure-introduction-5 , ואני = g, r.

מודל דו מימדי דיפוזיה מצויד ואז המתאם לכל הפונקציות (CFs):

figure-introduction-6.   (4)

כאן, N מציין את מספר חלבונים פלורסנט אמצעי תצפית, τd הזמן דיפוזיה לכל ערוץ. מודל זה לוקח בחשבון כי בהגדרה ניסיוני המתואר, דיפוזיה של חלבונים ברה מ מתרחשת בתוך המטוס x-z, בניגוד נפוץ התצורה של המתאם פלורסצנטיות ספקטרוסקופיה (FCS) ניסויים ממברנות חיטוט דיפוזיה במישור x-y של נפח קונאפוקלית17. המותניים w0 והגורם מבנה S, המתארת את התארכות wz של אמצעי האחסון נקודתית ב- z, S = wz/w0, מתקבלים מ כיול נקודת FCS מדידה המבוצעת עם spectrally דומים צבעי והגדרות באותו האופטי באמצעות הערכים הזמינים כבר מקדם דיפוזיה Dצבע:

figure-introduction-7, (5).

איפה τd, צבע זה הזמן נמדד פיזור ממוצע של מולקולות צבען, המתקבל מתאים למודל תלת מימדי דיפוזיה בנתונים, לוקח לתוך חשבון מעברים של השבר T של כל המולקולות N שלישיה המדינה עם קבוע הזמן ττ:

figure-introduction-8.   (6)

לבסוף, דיפוזיה (D), ערכי הבהירות מולקולרית (חדוה) והקבוע יחסית קרוס-הקורלציה של נתונים sFCCS (rel.cc.) מחושבים כדלהלן:

figure-introduction-9, (7).

figure-introduction-10, (8).

figure-introduction-11, (9).

Gקרוס(0) איפה משרעת הפונקציה קרוס-קורלציה, figure-introduction-12 הוא משרעת הפונקציה autocorrelation בערוץ אני-th.

הגדרה זו של יחסי קרוס-המתאם, קרי שימוש מרבי במקום כלומר המשוואה 9, לוקח בחשבון את המספר המרבי של קומפלקסים של חלבונים שני מינים נוכח בריכוזים שונים הוא מוגבל על ידי מינים נוכח מספר נמוך יותר.

בהירות ומספר צלב-המתאם מבוסס על ניתוח רגע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל פיקסל של אוסף תמונות רכשה במשך הזמן במיקום קבוע במדגם, המורכב בדרך כלל ~ 100-200 מסגרות, עם שני ספקטרלי ערוצי ( g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). מהממוצע טמפורלית figure-introduction-13 אניfigure-introduction-14, ואני השונות figure-introduction-15 , הבהירות מולקולרית חדוהi ואת מספר nאני מחושבים ב כל פיקסל וערוץ ספקטרלי (אני = g, r)18:

figure-introduction-16, (10).

figure-introduction-17. (11)

חשוב לציין כי המשוואות נתון חלים במקרה האידיאלי של גלאי ספירת פוטון אמיתי. עבור מערכות זיהוי אנלוגי, המשוואות הבאות חלות19,20:

figure-introduction-18, (12).

figure-introduction-19.   (13)

כאן, S הוא הגורם המרה בין פוטונים שזוהו הסעיפים דיגיטלי מוקלטות, figure-introduction-20 הוא רעש readout ואת היסט מתייחס ההיסט בעוצמה גלאי. באופן כללי, כמויות אלה צריכים להיות מכויל, עבור כל סוג הגלאי, המבוססת על מדידת השונות גלאי כפונקציה של עוצמת תאורה קבועה19, למשל, משטח מתכת רעיוני או פתרון דיי יבשים. היסט יכול להיקבע על ידי מדידת שיעור ספירה עבור דגימה ללא עירור אור. על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית של השונות הקשורות גלאי figure-introduction-21 לעומת העוצמה (אני) העלילה, S ו figure-introduction-22 יכול להיות נחוש19:

figure-introduction-23.   (14)

בסופו של דבר, הבהירות קרוס-המתאם מחושב בתוך כל פיקסל ולא מוגדר באופן כללי כמו21

figure-introduction-24, (15).

איפה figure-introduction-25 הוא קרוס-השונות figure-introduction-26 .

על מנת לסנן תנודות חיים ארוכים, כל ccN & B החישובים מבוצעים בעקבות קרון מטען סינון, באופן עצמאי עבור כל פיקסל22. בקצרה, ni, חדוהאני (אני = g, r) ו- Bcc מחושבים בהזזה מקטעים של למשל, 8-15 מסגרות. הערכים שהושג ובכך להיות בממוצע אז כדי להשיג הפיקסל האחרון מספר וערכי בהירות.

ניתוח סטויכיומטריה
כדי לאמוד את סטויכיומטריה של חלבון מתחמי תא-תא באנשי קשר, הבהירות מולקולרית ניתן בנפרד לנתח בכל אחד מהערוצים ספקטרליות עבור sFCCS או ccN & B נתונים. ב- sFCCS, מתקבל ערך הבהירות אחד לכל מדידה בכל ערוץ. ב ccN & B, היסטוגרמה הבהירות של פיקסלים כל הקשר תא-תא מתקבל, הערך הממוצע (או החציוני) יכול לשמש נציג בהירות למדידה. על ידי ביצוע הניתוח אותו על הפניה monomeric, כל ערכי הבהירות יכול להיות מנורמל להשיג ישירות מדינת oligomeric הממוצע מתחמי חלבון שזוהו. בנקודה זו, חשוב לתקן לנוכחות של FPs שאינו-פלורסנט שעלולים לגרום underestimation המדינה oligomeric. זה מתבצע בדרך כלל על ידי מודדים את הבהירות הפניה ההומו-dimeric חלבון23,24 באמצעות sFCS צבע אחד או מספר והבהירות (N & B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה לדוגמה: תא-תא ערבוב Assay

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את תהליך ערבוב עבור תאים חסיד. זה עשוי להיות שונה עבור תאים תרבותי ההשעיה.

  1. זרע מספר מתאים של תאים על צלחת 6-ובכן, למשל, 800,000 HEK 293T תאים (החשבת נויבאואר ספירת קאמרית), יום לפני תרביות תאים. המספר שניתן לשנות בהתאם הזמן בין seeding, תרביות תאים ולעקוב להתאמה עבור סוגי תאים אחרים. כדי לבצע ניסוי בסיסי (קרי, חלבונים של עניין שליטה שלילי), להכין לפחות 4 בארות. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני בינוני נשר שונה (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום שור עוברית (10%) ו- L-גלוטמין (1%).
  2. Transfect תאים על פי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).
    1. כדי לבצע ניסוי בסיסי, transfect, בבארות נפרדים, פלסמידים של החלבון עניין התמזגו 'ירוק' (למשל, monomeric משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (mEGFP), או חלבון פלואורסצנטי צהוב (mEYFP)) או 'אדום' (למשל, mCherry, או mCardinal) חלבון פלואורסצנטי.
      הערה: ב פרוטוקול זה, אנו מתמקדים APLP1-mEYFP ו- APLP1-mCardinal12, בקרה שלילית המתאימים, למשל, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-דקל-mEYFP) ואת - mCardinal (myr-דקל-mCardinal)12. באופן כללי, 200 ng - 1 µg של פלסמיד DNA מספיקים. יעילות גבוהה תרביות תאים מגדילה את הסיכוי למצוא תאים 'אדום' ו- 'ירוק' במגע. לשנות את הכמות של ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים כדי למטב את יעילות תרביות תאים. קריטי: תא confluency צריך להיות סביב 70% כאשר transfecting את התאים. אם תאים confluent יתר, היעילות תרביות תאים יקטן. אם התאים אינם מספיק confluent, תרביות תאים ולערבב עלול לגרום מתח ולמנוע הרבה תאים משעמו נכונה לאחר ערבוב.
  3. בצע תא ערבוב ~4 ± 2 h לאחר תרביות תאים.
    1. להסיר את מדיום הגידול ולשטוף היטב בעדינות עם 1 מ"ל PBS בתוספת מ ג2 + ו- Ca2 +. לאחר מכן, הסר את PBS. (קריטי) ירידה PBS קצה היטב כדי למנוע ניתוק של תאים במהלך הכביסה.
    2. להוסיף ~ 50 µL טריפסין ethylenediaminetetraacetic (EDTA) תמיסה חומצית drop-wise בכל טוב כדי להקל על ניתוק של תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות לאחר מכן, לאט ללחוץ את הצלחת 6-ובכן רוחבית כדי לנתק את התאים.
      הערה: דגירה ממושכת פעמים עשוי להיות צורך כמה סוגי תאים.
    3. להוסיף µL 950 של מדיום הגידול מכל קידוח, resuspend תאים על-ידי pipetting כמה פעמים הלוך ושוב, ובכך ניתוק כל התאים מהחלק התחתון טוב. (קריטי) ודא כי התאים הם resuspended כראוי ולא מנותקים אחד מהשני על-ידי בדיקה חזותית של העדר של אגרגטים תא גדול לאחר resuspension. אחרת ניתן להשיג 'אדום'-'אדום' או 'ירוק'-'ירוק' אנשי קשר רבים לאחר ערבוב.
    4. להעביר את הפתרון הסלולרי של באר אחת (חלבון מעניינים או שליטה שלילי) המתאים, קרי, 'אדום' (למשל, APLP1-mCardinal transfected) 'ירוק' (למשל, APLP1-mEYFP transfected) תאים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting כמה פעמים למעלה ולמטה. לאחר מכן, הזרע התאים המעורבים על 35 מ מ זכוכית מנות התחתון (1 מ"ל של מעורבות לתאים פתרון לכל מנה), בתוספת 1 מ"ל של מדיום הגידול ועל התרבות נזרע תאים לעוד יום ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

figure-protocol-1
איור 1 . זרימת עבודה ניסויית וייצוג סכמטי של סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה ו מספר קרוס-המתאם וניתוח בהירות באנשי קשר תא-תא. (א) ערכה של הכנת הדוגמא: שתי אוכלוסיות תאים transfected עם החלבון עניין (לדוגמה, APLP1) התמזגו שני חלבונים פלורסנט spectrally נפרדות (למשל, mEYFP ו- mCardinal) מעורבבים לאחר תרביות תאים. אנשי קשר שונה transfected תאים נבחרים בניסויים מיקרוסקופ. כדי למנוע הפרעה עם תחומים איגוד חוץ-תאית, החלבון הניאון צריך להיות דבוקה הסופית תאיים של החלבון עניין. (B) מדידות סריקה FCCS (sFCCS) הם בניצב שבוצעו לאיש הקשר תא-תא בשני ערוצים ספקטרלי (ערוץ 1, ירוק, ערוץ 2, אדום). שורות הסריקה (המיוצגת בתור kymographs) מיושרים, ממברנה פיקסלים לסכם. לאחר מכן, הערכה ACFs ו CCFs מחושבים מתוך העקבות בעוצמה Fאני(t). הערכה ACFs מיוצגים, אדום וירוק. CCF מיוצג בצבע כחול. (ג) צלב-המתאם N & B (ccN & B) רכישת תוצאות בערימה תלת ממדי התמונה (x-y-time). רועי נבחרה סביב הקשר תא-תא. אז ערוץ ובהירות קרוס-קורלציה (חדוה1, חדוה2ו- Bcc) ערכים מחושבים בכל פיקסל קשר תא-תא. התוצאות הם דמיינו ואז כמו היסטוגרמות, צירוף כל הפיקסלים שנבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

2. הכנת הדוגמא: לשלוט על הצלב-מתאם ניסויים ובבניית הומו-דיימר לניתוח בהירות

  1. זרע 600,000 תאים HEK 293T, החשבת תא ספירת קאמרית, על 35 מ מ זכוכית התחתון מנות יום אחד לפני תרביות תאים. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני DMEM מלאה (ראה שלב 1.1) ליום אחר.
  2. Transfect תאים עם ~ 250 ננוגרם של פלסמיד הדנ א על פי הוראות יצרן. עבור הפקד צלב-קורלציה חיובית, להשתמש פלסמיד קידוד המעוגנת ממברנה חלבון פלואורסצנטי הטרו-דיימר, למשל, myr-דקל-mCherry-mEGFP או myr-דקל-mCardinal-mEYFP12 המתאים FPs של החלבון עניין. לצורך כיול בהירות, להשתמש פלסמידים קידוד המעוגנת ממברנה FP מונומר והן הומו-דיימר המתאים FPs דבוקה החלבון של עניין, למשל, myr-דקל-mEYFP myr-דקל-mEYFP-mEYFP כדי לכייל את ניתוח הבהירות של APLP1-mEYFP12.
  3. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני DMEM מלאה (ראה שלב 1.1) ליום אחר.

3. מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי: התקנה וכיול נפח מוקד

הערה: פרוטוקול הבאה נכתבה ניסויים המבוצעת עם mEGFP/mEYFP, mCherry/mCardinal על מיקרוסקופ קונפוקלי השתמשו במחקר זה סורק הלייזר. ניתן לשנות את ההגדרה אופטי, הגדרות תוכנה (קווי לייזר, מראות ודיקרואיק זוהר, מסננים), ומבחר של כיול צבעי עבור אחרים setups FPs, מיקרוסקופ.

  1. הפעל המיקרוסקופ ואת לייזרים לפחות שעה לפני הניסוי כדי להבטיח יציבות לייזר ו- equilibration של הטמפרטורה.
  2. להכין µL 100-200 של פתרונות המתאימים הפלורסנט מסיסים במים (ראה את הטבלה של חומרים לדוגמאות) במים או PBS לכיול אמצעי האחסון מוקד, עם ריכוזים בטווח 10-50 ננומטר.
  3. מקם את הפתרונות לצבוע בצלחת זכוכית נקי 35 מ מ התחתון #1.5, קרי, יש עובי של 0.16-0.19 מ מ.
    הערה: השתמש באופן אידיאלי, מנות עם ביצועים גבוהים כיסוי זכוכית בעל עמידות נמוכה עובי, למשל, 0.170 ± 0.005 mm, ומאפשר תיקון הטבעת צווארון אופטימלית (שלב 3.6). חשוב להשתמש מאותו סוג של מאכל משמש אחר כך על הניסויים הבאים.
  4. מקם את הכלי המכיל את הפתרון לצבוע ישירות על המטרה (רצוי, טבילה במי, עם NA 1.2) כדי להבטיח התמקדות בתוך תמיסת. לחלופין, למקם את המנה על בעל מדגם ועל מיקוד המדגם (למשל, 10-20 מיקרומטר מעל החלק התחתון של המנה).
    הערה: אנו לא ממליצים להשתמש שמן מטרות בשל האות עניים המתקבל כאשר מיקוד עמוק לתוך דגימות מימית.
  5. להגדיר את הנתיב עירור, פליטה, למשל, לבחור את 488 ננומטר לייזר, 488/561 nm מראה ודיקרואיק זוהר, זיהוי חלון 499-552 ננומטר, גודל נקב של 1 יחידה אוורירי (AU). ודא כי הגודל חריר הוא זהה זה ישמש במדידות קרוס-המתאם.
  6. להתאים חריר עמדה (חריר התאמה) ואת הטבעת צווארון אובייקטיבית כדי למקסם את ספירת קצב. מטרה זו להפוך צווארון הטבעת עד שיעור מהספירה המרבית מזוהה.
    הערה: התיקון טבעת צווארון חשבונות עבור עובי הזכוכית המכסה משמש ספציפיים. למקסם את קצב הספירה, כלומר., איסוף פוטונים רבים לכל מולקולה ככל האפשר, הוא חיוני כדי למקסם את יחס אות לרעש (SNR) את המידות.
  7. לבצע סדרה של FCS נקודת מידות (למשל, 6 מידות במקומות שונים, שכל אחד מהם מורכב של 15 חזרות של 10 s, כלומר 2.5 דקות סה כ זמן, שנדגמו עם 1 µs להתעכב זמן או פחות) בכל אותו הכוח לייזר המשמשים קרוס-מתאם מדידות (בדרך כלל ~ 1%, קרי, ~ 1-2 µW).
  8. מתאים מודל תלת מימדי דיפוזיה כולל תרומה שלישיה (משוואת 6) הנתונים.
    הערה: בדרך כלל, הזמנים דיפוזיה שהושג µs כ-30 הינם הגורם מבנה הוא סביב 4-8.
  9. לחשב את המותניים w0 מ פיזור ממוצע נמדד הזמן והערכים שפורסמו עבור ערך מקדם דיפוזיה לצבוע משומש-בטמפרטורת החדר25 על פי משוואת 5. ערכים אופייניים הם 200-250 ננומטר.
  10. חזור על התרגיל כיול (שלבים 3.4-3.9) עם צבע שונה פלורסנט עבור ערוץ איתור השני במידת הצורך (למשל, 561 nm עירור וזיהוי בין 570 nm ו 695 ננומטר). שמרו חריר מיקום וגודל זה הוגדר עבור הערוץ זיהוי הראשון.
  11. לחשב את הבהירות מולקולרית (משוואת 8) מ כיול המידות ואחסן את הערכים שהושג.
    הערה: ערכים אופייניים עבור הגדרת בשימוש הם ~8-10 קילו-הרץ/מולקולה (MOL) 1.8 µW 488 ננומטר עירור כוח. שנמוך מ ערכי הרגיל עשוי להצביע על עפר על המטרה, אי-התאמות של ההתקנה או פלט של לייזר מופחת. בדוק ולאחסן לייזר כוחות פלט בנקודת היעד באופן קבוע באמצעות מד הכוח. לשם השוואה של כיוונונים שונים, בהירות מולקולרית מנורמל מאת עוצמת הלייזר עירור היא הפרמטר המשמעותי ביותר כדי להעריך את ביצועי מיקרוסקופ.

4. סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה: רכישה

הערה: פרוטוקול הבאה נכתבה ניסויים שבוצעו עם mEGFP/mEYFP ("ירוק") ו- mCherry/mCardinal ("red") במיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר השתמשו במחקר זה. הגדרת אופטי ואת הגדרות תוכנה (קווי לייזר, מראות ודיקרואיק זוהר, מסננים) עשויות להיות שונות עבור אחרים setups FPs או מיקרוסקופ.

  1. להגדיר את הנתיב אופטי, למשל, 488 ננומטר, עירור nm 561 ואת מראה ודיקרואיק זוהר 488/561 ננומטר, נקב 1 AU עבור עירור 488 ננומטר. כדי להימנע ספקטרלי צולבות לדבר, בחר בשני מסלולים נפרדים לעורר ולגלות mEGFP/mEYFP (488 ננומטר עירור, הערוץ הירוק) ו- mCherry / mCardinal (561 עירור ננומטר, הערוץ האדום) ברצף ובחר מתג מסלולים בכל שורה. איתור, השתמש המסננים המתאימים עבור שני ערוצים, למשל, 499-552 nm, לערוץ הצבע הירוק, 570-695 nm, ערוץ הצבע האדום.
  2. אם עירור לסירוגין אינו אפשרי, השתמש בהגדרות הסינון המתאימה עבור הערוץ האדום כדי למזער ספקטרלי צולבות לדבר (כלומר לזהות קרינה פלואורסצנטית mCherry/mCardinal לא מתחת 600 ננומטר). זה עשוי להפחית את כמות הפוטונים זוהה ערוץ הצבע האדום, ובכך להפחית את SNR.
  3. מקם את המנה המכילות את התאים המעורבים את המחזיק לדוגמה. המתן לפחות 10 דקות כדי להבטיח equilibration טמפרטורה וכדי להפחית את המוקד להיסחף.
  4. מתמקדים התאים באמצעות שידור אור בתפריט אתר .
  5. חיפוש זוג 'אדום' תא 'ירוק' קשר איש עם רעהו. קרוס-מתאם חיובי או הומו-דיימר בקרת הבהירות (ראה סעיף 2), לחפש תא מבודד פולטות קרינה פלואורסצנטית הן ערוצי או האות הומו בהתאמה-דיימר-ראש הממשלה.
    הערה: (קריטי) מזער מדגם חשיפה תוך חיפוש עבור תאים להימנע מראש הלבנה, אשר עשוי להפחית את הצלב-המתאם26. לכן, סריקה מהירות הסריקה המהירה, כוחות לייזר נמוך. כדי להימנע גלאי הרוויה, תוך הדמיה חזק לבטא תאים, חפש במצב אינטגרציה. עם זאת, כדי למזער את החשיפה, סריקה ברזולוציה נמוכה יותר כוחות לייזר אפשרי במצב סופר פוטון .
  6. בחר סריקת הנתיב בניצב תא-תא קשר (או PM של תא בודד עבור הפקד בהירות חיובית, קרוס-מתאם או הומו-דימר) באמצעות לחצן חתוך , כפי שהיא מתוארת דמויות 1B ו- 2A.
    הערה: מיקרוסקופים ישנים מסוימים אינם מאפשרים סריקה שרירותי כיוונים. במקרה זה, תא-תא קשרים עם אוריינטציה בניצב לכיוון הסריקה צריך להיות ממוקם.
  7. זום כדי להשיג גודל פיקסל של 50-200 ננומטר, בחר קו במצב סריקה. הגדר גודל המסגרת 128 × 1 פיקסלים.
    הערה: גודל הפיקסל טיפוסי הוא 160 nm, המקביל אורך הסריקה של בערך 20 מיקרומטר.
  8. להגדיר מהירות הסריקה לערך המרבי המותר, למשל, 472.73 µs בכל שורה.
    הערה: עבור ערכת עירור חלופי, זה תואם את זמן הסריקה 954.45 µs, קרי ~ 1000 סריקות לשנייה לכיוונון המשמש. מהירות סריקה עשוי להיות מותאם בהתאם מקדם דיפוזיה של החלבון עניין. המעוגנת קרום חלבונים, דיפוזיה טיפוסי הזמנים הם סביב 10-20 גב בזמן הסריקה צריך להיות לפחות עשר פעמים קטנים יותר מבפעמים דיפוזיה. נמוכה הסריקה מהירויות עשוי לגרום photobleaching חזק יותר ודורשים כוחות תאורה נמוכה יותר. לחלופין, אחד יכול להטיל הפסקה, למשל, 5 מילי-שניות, בין כל סריקה עבור מתחמי לאט מאוד באמצעי באמצעות מרווח המשנה סדרות זמן .
  9. לבחור את הכוחות לייזר מתאים, למשל, ~ 1-2 µW עבור 488 ננומטר ו ~ 5-10 µW עבור 561 עירור ננומטר.
    הערה: הכוחות לייזר לשפר SNR, אך להגביר photobleaching. לכן, לייזר כוחות צריך להיבחר כך photobleaching הוא פחות מ 50% של קצב הספירה ההתחלתית.
  10. הגדר מחזורים 100,000-500, 000.
    הערה: המספר של סריקות, קרי, המשך של המדידה, עשוי להשתנות: פעמים מדידה עוד ישתפרו SNR, עשוי להיות מתאים יותר עבור אט לשדר מולקולות, עם זאת, תנועה של תאים photobleaching להגביל את המידה המקסימלית הגיע הזמן. הנתונים המובאים כאן נרכשו באופן שגרתי עבור ~ 3-6 דקות, קרי, קו 200,000-400,000 סורק.
  11. הגדר גלאי מצב הפוטון לספור . הקש להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה. חזור על שלבים 4.5-4.11 למדוד תא אחר.
    הערה: מומלץ למדוד 10-15 תאים עבור דגימה ברמות ביטוי שונה. (קריטי) הימנע גלאי רוויה ברמות ביטוי גבוהה. הקצב מהספירה המרבית לא יעלה ~ 1 מגה-הרץ.
  12. אם ניתוח בהירות מתבצעת כדי לקבוע oligomeric הברית, לבצע מדידות כיול בהירות הומו-דימר על פי פעולות ששונתה 4.1-4.11: למדוד כל חלבון פלואורסצנטי הומו-דיימר בנפרד (ב תאים מבודדים, המוכנים פרוטוקול בסעיף 2) ולבצע מדידות רק בערוץ אחד ספקטרלי.

5. ספקטרוסקופיה סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם: ניתוח נתונים

הערה: פרוטוקול הבאים בעקבות יישום של ההליך ניתוח תיאר בפירוט מאמרים קודמים12,15. קוד תוכנה זמין על פי בקשה ליוצרים.

  1. לייצא את קבצי הנתונים הגולמיים (למשל, CZI) לתמונה RGB TIFF בתבנית הנתונים הגולמיים. קובץ זה יכיל את kymograph עם הירוק, נתוני הערוץ האדום, בערוץ כינה G ו- R של התמונה, בהתאמה.
  2. ייבא את קובץ TIFF עם התוכנה המתאימה ניתוח והמשך לביצוע הניתוח.
    הערה: השלבים הבאים (שלבים 5.3-5.7) מוחלים בנפרד על כל אחד מערוצי:
  3. יישר את השורות על-ידי ביצוע ממוצע זמן segment-wise או לנוע עם בלוקים של קווי 500-1000. לקבוע את מיקום ממברנה, קרי, מיקום הפיקסלים עם הקצב מהספירה המרבית בכל בלוק. משמרת כל הבלוקים לאותו מיקום לרוחב. הליך זה מתקן עבור תזוזה לרוחב של הקשר תא-תא, למשל, עקב תנועת התא.
  4. לסכם כל הקווים מסודרים לאורך ציר הזמן, מתאים לפרופיל בעוצמה ממוצעת באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס. בנוכחות משמעותית רקע תאיים, השתמש Gaussian בתוספת פונקציה סיגמואיד. הגדר את הפיקסלים המייצגים הקרום כמו כל הפיקסלים בתוך ±2.5σ של הממברנה עמדה, סכום את האינטנסיביות של הפיקסלים האלה בכל שורה, קבלת ערך האות פלורסצנטיות יחיד עבור כל נקודת זמן (כלומר, עבור כל סריקה קו).
  5. אם יש צורך (למשל, רקע > 10% של האות קרום), להחיל תיקון רקע על-ידי הפחתת עוצמת הפיקסלים הממוצע בציטופלסמה מוכפל 2.5σ (ביחידות של פיקסלים) של קרינה פלואורסצנטית הממברנה, בבלוקים של 1000 שורות. הימנע שלפוחית תאיים בהירים בעת בחירת רקע פיקסלים.
  6. אם photobleaching הוא ציין, להחיל תיקון הלבנה. לכן, מתאים סדרת הזמן ממברנה זריחה עם פונקציה מעריכית-כפול, להחיל את התיקון המתאים הנוסחה, משוואה 116.
    הערה: לחלופין, ערכות תיקון ספקטרום מבוסס פורייה ייתכן יישומית27. (קריטי) אם photobleaching זה קיים אבל לא תוקן עבור, עשוי להיות מעוות קשות CFs, פרמטר הערכות עשויים להיות מוטים חריפה (למשל, ראה איור 5E).
  7. לחשב את הערכה ACFs CCFs לפי משוואות 2 ו- 3 באמצעות, למשל, אלגוריתם מרובות-טאו28. כדי לשפר את המהימנות של הניתוח להימנע חפצים, לבצע את החישובים עבור חלקי המדד הכולל שווה 10-20. לבחון את זריחה זמן סדרה ו CFs כל קטע ולהסיר מקטעי בבירור מעוותת (ראה דוגמאות ב איור 4A- 4 D). ממוצע כל מקטעי שאינה מעוותת.
    הערה: הליך זה יכול להיות אוטומטי כדי להימנע דעה קדומה הסובייקטיבית הנתונים29. עבור מדידות מאוד לא יציב יש קטעים קצרים רבים עשוי להיות שימושי. עם זאת, האורך של קטע עדיין צריך להיות לפחות שלושה סדרי גודל מעל הזמן דיפוזיה להימנע סטטיסטי undersampling שגיאות29,30,17.
  8. מתאים מודל דיפוזיה דו מימדי, משוואת 4 CFs שהושג. לכן, לתקן את הגורם מבנה הערך שהתקבל במדידה כיול (פרוטוקול בסעיף 3). ניתן לשפר את הדיוק של התאים על ידי ביצוע התאמה משוקלל באמצעות המשקולות סטטיסטי של כל נקודת נתונים המתקבלים האלגוריתם טאו מרובים.
  9. חשב את מקדם דיפוזיה באמצעות המותניים מכוילת על פי המשוואה 7.
  10. לחשב את הבהירות מולקולרית על-ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע בכל אחד מהערוצים לפי מספר חלקיקים, 8 משוואת המתאימים. לנרמל את ערך הבהירות נחושה בכל אחד מהערוצים על ידי בהירות ממוצעת של ההפניה monomeric המתאים כדי לקבל את המדינה oligomeric, לתוך חשבון שאינו-פלורסנט FPs23. כדי מטרה זו לקבוע ערכי הבהירות ההומו הממוצע-דיימר מניתוח צבע אחד כדי לחשב את השבר של הלא-פלורסנט FPs23.
  11. חישוב המתאם בין יחסי לפי משוואת 9.

6. קרוס-קורלציה למספר והבהירות: גלאי כיול

הערה: פרוטוקול הבאים מספק קו מנחה כללי לגבי איך לכייל את מערכת איתור. הליך זה חובה עבור מערכות זיהוי אנלוגי, אבל בהחלט נחוצה כאשר גלאי הספירה האמיתית פוטונים נמצאים בשימוש.

  1. נגב פתרונות צבע מסיס במים המתאימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמאות) על צלחת תחתית זכוכית 35 מ מ. להגדיר את נתיב אופטי בהתאם, קרי, 488 או 561 nm עירור וזיהוי 499-552 ננומטר או 570-695 nm, בהתאמה.
    הערה: לחלופין, משטח מתכת רפלקטיביים יכול לשמש במקום צבע יבשים פתרונות על-ידי הצבת את פיסת מתכת ישירות מעל המטרה.
  2. לבצע מדידות N & B צבע אחד באזורים עם ריכוזי צבעים שונים או כוחות לייזר שונים. לכן, להשתמש זום כדי להשיג גודל בפיקסלים של 300 ננומטר, מהירות הסריקה כדי להגדיר 25 µs פיקסלים שמתאימה להתעכב זמן, למשל, ולהגדיר מחזורים למסגרות 100-200.
  3. הגדר גלאי ספירת פוטון (או במצב אנלוגי אם מדידות מבוצעות באמצעות זיהוי אנלוגי) ולחץ להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה. ביצוע המדידה בעוצמה אפס עירור ' כדי לקבוע את ההיסט בעוצמה.
  4. מגרש פיקסל השונות כפונקציה של עוצמת פיקסל לכל הפיקסלים נמדד ולבצע התאמה לינארית של נתונים אלה. לקבוע S כמו המדרון של התאים ליניארי. לחשב את הרעש readout מהחיתוך-y, באמצעות S וההיסט בעוצמה נקבע על פי משוואת 14.

7. מספר קרוס-קורלציה, בהירות: רכישה

  1. בצע את שלבים 4.1-4.4 של פרוטוקול רכישת sFCCS.
  2. השתמש בחתוך כדי לבחור מסגרת של 512 × 128 פיקסלים מסביב קשר תא-תא (או מבודד PM עבור בקרת הבהירות הומו-דימר) זום כדי להשיג גודל פיקסל של 50-100 ננומטר.
  3. כדי להגדיר פיקסלים שמתאימה להתעכב זמן, למשל, 6.3 µs לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט מהירות הסריקה .
    הערה: N & B, הזמן להתעכב פיקסל צריכה להיות הרבה יותר קטן מאשר הזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אם ערכת עירור חלופי נבחר, למשל, החלפת רצועות בכל שורה, הזמן בין שתי הרצועות אמור להיות קטן יותר מהזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אחרת קרוס-המתאם לזיהוי מצטמצם.
  4. הגדר מחזורים 100-200 מסגרות.
    הערה: מספר מסגרת גבוה יותר תשפר את SNR, עם זאת, תנועת התא יכול להגביל את משך הזמן סך מדידה. זמן סריקה לכל מסגרת צריך להיות הרבה יותר גבוה מאשר הזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אחרת בהירות נראית לעין מצטמצם, קרי, חלקיקים מופיעים להיות משותק. על מתחמי באמצעי לאט מאוד, להטיל על שתיקה, למשל, 2 s, בין מסגרות באמצעות מרווח המשנה סדרות זמן .
  5. להגדיר כוחות לייזר לערכים המתאימים (ערכים אופייניים הם ~ 1-2 µW עבור 488 ננומטר ו ~ 5-10 µW עבור עירור nm 561).
    הערה: לייזר הפיכחות, מה שמוביל בהירות גבוהה יותר ו SNR משופר, אלא גם photobleaching משופר. לייזר כוחות צריך להיות גבוה מספיק כדי להשיג בהירות שזוהו לפחות ~ 1 kHz/MOL אך השאירו מספיק נמוך כדי למנוע יותר מ 10-20% photobleaching. עבור photobleaching mEGFP/mEYFP או mCherry/mCardinal, פחות מ- 10% מתקבלים בדרך כלל.
  6. הגדר גלאי ספירת פוטון (או במצב אנלוגי אם מדידות מבוצעות באמצעות זיהוי אנלוגיות). הקש להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה.
  7. להעריך את קצב הספירה פוטון. אם ספירת המחירים בפיקסלים קשר תא-תא חורגים 1 מגה-הרץ, להפחית את עוצמת הלייזר או בחר תאים עם רמות נמוכות יותר של ביטוי. חזור על השלבים 7.2-7.7. כדי למדוד את הזוג הבא של תאים. מומלץ למדוד 10-15 תאים לכל ניסוי ברמות ביטוי שונה.
  8. אם הבהירות ניתוח מבוצע לכמת oligomerization, לבצע מדידות כיול בהירות הומו-דימר על פי פעולות ששונתה 7.1-7.7: למדוד כל חלבון פלואורסצנטי הומו-דיימר בנפרד (ב תאים מבודדים, המוכנים פרוטוקול בסעיף 2) ולבצע מדידות רק בערוץ אחד ספקטרלי.

8. המספר קרוס-קורלציה, בהירות: ניתוח נתונים

הערה: להלן כללי התנהגות עוקב אחר12,הליך ניתוח שתואר לעיל31. קוד תוכנה זמין מן המחברים על פי בקשה.

  1. לייבא את הנתונים הגולמיים (למשל, CZI הקבצים ניתנים לייבוא באמצעות החבילה32 Bioformats). ממוצע של כל המסגרות, בחר אזור בעל עניין (ROI) סביב הקשר תא-תא.
  2. ביצוע של התמונה יישור אלגוריתם33, למשל, על-ידי הגדלת המתאם המרחבי בין ROIs במסגרות עוקבות עבור תרגומים לרוחב שרירותי, בממוצע בשני ערוצים. הליך זה יתקן לתנועה לרוחב של התאים.
  3. להחיל מסנן שהקרון22 כדי להפחית תנודות מאריכים חיצוניים, שמקורם, למשל, תנועת התא שיורית או רקע הלבנה. לחלופין, ניתן להחיל שיטה detrending לתיקון photobleaching34.
    הערה: אם אין ניתוח segment-wise או detrending חלה, הבהירות לכאורה עשויים להיות במידה רבה overestimated.
    1. להגדיר הזזה חלקי, למשל, 8 עד 15 מסגרות (למשל, מסגרות 1 עד 8, 2 עד 9 ו הלאה), לחשב את ערכי הבהירות וערוץ קרוס-המתאם על פי משוואות 10, 11 ו- 15 pixel-wise בכל קטע. אם גלאי אינם פוטון נכון לספור גלאי, לוקחים את הפרמטרים גלאי מכוילת בחשבון בעת חישוב הבהירות, קרי, השתמש משוואות 12 ו 13 במקום.
      הערה: חישוב את ערכי הבהירות בקטעים של 8 עד 15 מסגרות מוביל underestimation של 10-20% של הבהירות המוחלטת של 10-20% מופרזת של חלקיקים מספרים. למרות זאת, יחס בהירות (למשל, דימר כדי מונומר בהירות) אינם מושפעים, כמה זמן אורך קטע נשמרת קבועה לאורך כל הניתוח (נתונים לא מוצג). יכול להיות נקבע באמצעות סימולציות, מתוקנות ובכך על השגיאה הסטטיסטית עבור אורך קטע נתון.
    2. ממוצע את ערכי הבהירות שהושג pixel-wise מעל כל שכבות. בשלב זה, אחד עשוי להסיר את % 5 הגבוהים והנמוכים ביותר של ערכי הבהירות קטע מן הממוצע או לא לכלול קטעים שמראים עיוות ברור בעוצמה, עקב, למשל, של שלפוחית תאיים או צבירה transiently נוכח אלה פיקסלים.
  4. להתוות את ערכי הבהירות של הפיקסלים כפונקציה של עוצמת פיקסל ובחר את האוכלוסייה של פיקסלים המתאים לאיש הקשר תא-תא. ברקע יהיו ערכי העוצמה נמוך מאוד. בשלב זה, להעריך מחדש את קצב מהספירה המרבית. הכללת פיקסלים עם ספירת המחירים מעל 1 מגה-הרץ כדי למנוע בכביש מספר אפקטים.
  5. ליצור היסטוגרמות בהירות וערוץ קרוס-המתאם של התא-התא שנבחר פיקסלים קשר ולקבל את ערכי הבהירות בממוצע-ROI. לנרמל את ערך הבהירות ערוץ הממוצע על ידי בהירות ממוצעת של ההפניה monomeric המתאים כדי לקבל את המדינה oligomeric, לתוך חשבון שאינו-פלורסנט FPs23. לכן, לקבוע ערכי הבהירות ההומו הממוצע-דיימר מניתוח צבע אחד כדי לחשב את השבר של הלא-פלורסנט FPs23.
  6. להמחשה, מגרש מפות בהירות וערוץ קרוס-המתאם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבחן ראשון עבור אינטראקציית חלבון-חלבון וזמינותו, קרי, ערבוב של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט ברורים spectrally, ואחריו sFCCS/ccN & B מדידות (איור 1), צריכה להתבצע על חלבונים אשר אינם אמורים אינטראקציה-הקשר תא-תא (קרי, פקד שלילי). לכן, HEK 293T תאים myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-דקל-mEYFP) או - mCardinal היו מעורבים, sFCCS בוצעה על-פני הקשר תא-תא (איור 2א). במקרה האידיאלי, האות פלורס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההליך ניסיוני המתוארים כאן מאפשר החקירה של חלבון טרנס אינטראקציות תא-תא באנשי קשר, העסקת פלורסצנטיות תנודות ספקטרוסקופיה טכניקות, כלומר sFCCS, ccN & B. שיטות אלה כוללות ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות הנפלטים על ידי שני FPs spectrally מופרדים דבוקה protein(s) עניין אצל איש קשר של שני תאים סמוכים, אחד אחד או את חלבון כימרי אחרים. הנוכחות של טרנס מתחמי לכמת על-ידי בודק את מידת שיתוף דיפוזיה של חלבונים ב- PMs שכנות. בנוסף פרוטוקולים מפורט על הכנת הדוגמא, רכישת נתונים וניתוח, מאמר זה מספק ראיות של יישום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו מומן בחלקו על ידי דויטשה פתוח (DFG) להעניק 254850309. המחברים מודים Luckner מכירה את מאדלן על קריאה ביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום גידול DMEMPAN-BiotechP04-01548
DPBS עם: Ca2+ ו- Mg2 + PAN-BiotechP04-36500
DPBS עם: Ca2+ ו- Mg2 + PAN-BiotechP04-35500
טריפסין EDTAPAN-BiotechP10-023100
TurboFect מגיב טרנספקציהתרמו פישר סיינטיפיקR0531
HEK 293T תאיםDSMZACC 635
Alexa Fluor 488 NHS EsterThermo Fisher ScientificA20000
Rhodamine BSigma-Alderich83689-1G
Plasmid DNAAddgeneNAראה הפניה 12 (Dunsing et al., MBoC 2017), לתיאור מפורט של כל הפלסמידים
צלחת 6 בארותStarlabCC7672-7506
35- כלי תחתית זכוכית מ"מCellVisD35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 קונפוקליCarl ZeissNA
MATLAB חבילת תוכנהMathWorks  2015ב 
תא ספירת תאים נויבאוארמרינפלד640110

מקורות

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273(2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634(2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494(2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073(2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487(2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412(2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545(2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

1
Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.