מאמר שיטה

שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58592

⸱

20 בנובמבר 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר את ניתוח immunofluorescence, biocytin השחזור של שחזורים באיכות גבוהה של interneurons CA2 בהיפוקמפוס בעקבות את הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תאיים במבחנה, ומאפשר עצביים אפיון, בסופו של דבר בסדר אנטומיה עצביים שילמדו.

תקציר

איך פעילות רשת בקליפת המוח מעבד מידע יש חשיבות למספר רב של שאלות מדעי בסיסי וקליני. הפרוטוקול המתואר כאן מזהה אבני הבניין הבסיסיות של המעגלים הזאת. המחקרים מעמיק של אזורים קורטיקליים יספק בסופו של דבר לצורך הבנה של איך המוח רוכשת מדענים אחרים עם הרכיבים במעגל, מעבדת ושומרת מידע, מה משתבש במחלה, ואילו אלקטרופיזיולוגיות נתונים מורפולוגיים נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח חישובית בבנייה של רשתות דגם לחקור עיבוד מידע. פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר כיצד תאים מלא biocytin הקליטה באזור CA2 ההיפוקמפוס הם לשחזר ולאחר מכן שיחזר ב- 3D. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ההפגנה של סידן מחייב חלבון או פפטיד תוכן interneurons המוקלט.

מבוא

קליפת ההיפוקמפוס הם מבנים של מורכבות כאלה כי הסיווג של עצביים תת1,2,3,4, מפות של הקשרים ביניהם5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 איך המעגלים הזה תומך תפקודים קוגניטיביים12,13,14,15 נמצאים עדיין בשלבי מחקר אינטנסיבי, הנושא של הדיון המתמשך. לדוגמה, כדי להבין את הפרטים ואת המורכבות של המעגלים וכדי לתאם והנתונים שהתקבלו ממחקרים שונים רבים, זה עוזר מאוד שתוכל להגדיר ולתאר את הרכיבים, אבל זה נשאר עניין לדיון כמה שונים סוגי נוירונים קיימים, או אפילו האם זה אפשרי להגדיר את כל הנוירונים כשייך מחלקה מסוימת. כלים חישוביים זה ניתן לבנות ולבדוק מעגלים עם דרגות שונות של מורכבות מתבצעת מפותחת16,17,18, אבל מרכזי במאמצים אלה הוא הצורך ללימודי מפורט הסוגים התא ואת המאפיינים של הקשרים ביניהם. כמות גדולה של מידע על המעגלים המקומיות של קליפת של עכברים בוגרים שכבר נאסף באמצעות הפרוטוקול המתוארים כאן10,19,20,21, 22. למרות "חיווט תרשים" רחוקה מלהיות מלאה, יש לנקות את דפוסי או כללים הופיעו. יתר על כן, למרות כמה פרטים משתנים, כללים אלה נפוצים שני מינים יונקים (חולדה וחתול) ועל -פני מכמה אזורים neocortical, המאפשר הפיתוח של אבני היסוד אשר צפויים להיות ישים באותה מידה וקליפת אנושי. בטכניקה המתוארת כאן משמש כדי להרחיב את ההבנה שלנו של המפה פונקציונלי של המעגלים בקליפת המוח על-ידי זיהוי הנוירונים presynaptic ו postsynaptic מעורב חיבורים באזורים אשר לא נחקרו בפירוט בעבר, באמצעות פרוטוקול המאפשר שימור רקמות מצוינת ושחזור מכתימים מדהים ברקמת המוח למבוגרים. נתונים על המעגלים המקומיות ב CA2 ומאפיינים עצביים ב הזה כתת-תחום שנאסף באמצעות שיטה זו על ידי שילוב הקלטות תאיים אלקטרופזיולוגים (מזווג הקלטות עם microelectrodes חדה) עם מילוי, biocytin immunofluorescence, נהלים היסטולוגית ושיחזור הפערים מפורט עצביים, המאפשר השוואה ישירה עם השכן CA אזורים23,24,25.

בטכניקה המתוארת במאמר זה פותחה במשך השנים כדי להשיג את האנטומיה עצביים מפורט המאפשר הסיווג הנכון של תאים באיכות גבוהה שחזורים מדויקים של שני שלהם דנדריטי ואת עצב ובשבילים, נתונים יכול להיות בקורלציה עם אלקטרופיזיולוגיות הנתונים שנאספו מן הקלטות לזווג באמצעות אלקטרודות חדה. פרוטוקול היסטולוגית מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. לדוגמה, העיקרון של הטכניקה קיבוע כפול על-ידי ראשית אנו ממליצים פתרון מקבע ותיקון שנית פוסט באוסמיום ארבע-חמצני נותן קונטרסט טוב מיקרוסקופ אור26. כמות קטנה של חומצה picric פתרון גלוטראלדהיד יתווספו הפתרון לשבועיים כדי לשפר את הנוגדן חדירה ולשמור על ultrastructure התאים כפי שהוצע המחקר הקודם27. Permeabilization הפרוסות המוח באמצעות שיטת ההקפאה-הפשרה בשילוב עם הקפאה-הגנה עם סוכרוז, יותר מאשר חומר ניקוי מסורתית, מספק גם אופטימלית שימור הרקמות עבור ניתוח מורפולוגי מפורט של התאים המוקלט. בנוסף, החזיית במיוחד ומבנים מאוד משופרת על-ידי הפחתת צביעת הרקע, עם incubations עם מי חמצן (H2O2), נתרן borohydride (NaBH4). הוספת ניקל כלורי (NiCl2) חזרת peroxidase (HRP) התגובה לשם השגת מוצר התגובה פיגמנט שחור גם מגביר את החדות.

הפרוטוקול הבא מתאר את ההליכים נהגו לברר שימור רקמות מעולה, מאוד מפורט שחזורים תלת-ממד עצביים בעקבות הקלטות תאיים במבחנה. התיאור של הכנת פרוסה, הקלטות לזווג תאיים באמצעות חדים אלקטרודות, הבאים הליכים היסטולוגית המשמשים במעבדה שלנו היה שדווחה בעבר28. למרות הפרוטוקול חל על התאים מלאים intracellularly biocytin לפרוסות עבות μm 450-500, באותו הפרוטוקול עשוי לשמש בעקבות הקלטות תאים שלמים. עם זאת, השימוש של פרוסות דק יותר תגרום פחות מלאה שחזורים של התאים.

פרוטוקול

כל ההליכים בשימוש בכל רחבי מחקר זה בוצעו על פי הוראות משרד הפנים הבריטי לגבי חיה מדעי הליכים Act 1986.

1. קביעת סידן מחייב חלבון או תכולת החלבון של Interneurons והדמיה Biocytin בעקבות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, מילוי Biocytin

הערה: בסוף ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות, פרוסות המכילות תאים מלא biocytin קבועים למשך הלילה לפני הליכים היסטולוגית. הפתרון מקבע יוחלפו עם שינוי יחיד של 0.1 M פוספט מאגר למחרת בבוקר, אם שאר ההליך מתבצע ביום אחר, על מנת למנוע נזק לרקמות. הפתרון קיבעון (4% paraformaldehyde, 0.2% רוויות חומצה picric פתרון, פתרון גלוטראלדהיד 0.025% 0.1 M פוספט מאגר (PB)) חייב להיעשות טרי ביום של ההקלטות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

  1. בסוף ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות, בזהירות להרים את הפרוסה המכיל את תא (ים) שהוקלט עם מברשת ולמקם אותו בסיר המכיל מלאכותי לנוזל חוט השדרה (כלנית חדד).
    הערה: פרטים של פרוטוקול המשמש פרוסה הכנה והקלטות תאיים באמצעות אלקטרודות חדה היה שתואר לעיל28.
  2. בשכונה fume, בזהירות להרים את הפרוסה המוח באמצעות מברשת צבע, לגלגל אותו על חתיכת נייר סינון איכותי קטן. מניחים עוד פיסת נייר סינון בטעימת על הפרוסה ומניחים שתי פיסות נייר סינון רטוב בסיר פלסטיק קטן המכיל 5-10 מ של פתרון מקבע וחנות במקרר למשך הלילה ב 4 º C.
  3. להכין פתרון של ג'לטין במים מזוקקים. מקום 20 מ ל מים מזוקקים גביע על פלטה חמה ומקרר עד 60 מעלות צלזיוס. להוסיף המים בהדרגה 2.4 גרם ג'לטין, לחכות עד התפרקה ולאפשר לו להתקרר עד 35-40 ° C לפני השימוש כדי למנוע נזק לרקמות.
  4. החלף את הפתרון מקבע 2 מ ל חמאת בוטנים 0.1 M. מניחים הפרוסה צלחת פטרי, משם כל עודף רקמות לחתוך עם סכין ומהדקים. במקום הרקמה החתוך בצלחת פטרי (בקוטר של 9 ס מ, גובה 1.4 ס מ), ולהבטיח כי היא שוכנת שטוח ללא קיפולים או קמטים, ולהסיר את המאגר עודף באמצעות מברשת יבשה.
  5. לכסות את הרקמה עם הפתרון ג'לטין חמים ומניחים הפטרי על גבי בלוק קפוא להתקרר במהירות את הפתרון.
  6. באמצעות מנורת זווית-שלווה לספק ניגוד, נראית דרך הצד של המנה ולשמור על הפרוסה שטוח באמצעות לחץ קל מ במכחול בסדר עד שהג'לטין לשקוע.
    הערה: הג'לטין יכול להיות מומס מחדש אם הרקמה לא לשכב על הגב. פגמים על פני השטח של הג'לטין הנגרמת על ידי הסרת במכחול כמו זה עפור יוסרו על ידי המסת שכבת פני השטח בעדינות על-ידי הזזת את הנורה של המנורה קרוב לפני השטח במשך כמה שניות.
  7. להעביר את המנה של הגדרת ג'לטין על המקרר ולהשאיר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  8. בשכונה fume, לגזור בלוק קטן (~ 1 x 1 ס מ) המכיל הרקמה ג'לטין-מוטבע של המנה באמצעות סכין אזמל, הרם את הבלוק בעזרת מרית קטנה, בזהירות מניחים אותה הפתרון מקבע אותו אך טרי נהגה להכין את הפרוסות במשך לפחות 30 דקות ב 4 ° C .
  9. לשטוף את הבלוק ג'לטין ב 5 מ של 0.1 M PB שלוש פעמים, לייבש אותו באמצעות פיסת נייר טישו ומקל הצד לחסום למעלה (כלומר, עם רקמת בחלק העליון) על גבי vibratome צ'אק בעזרת דבק מגע.
  10. להסיר עודפי דבק עם חתיכת נייר סינון ולהשתמש להב סכין לחתוך בפינות הרחוב, עוזב מעויין.
  11. סעיף הפרוסה ב 50 מיקרומטר עובי באמצעות vibratome ולמקם כל מקטע בקפידה בקבוקון זכוכית המכיל 10% סוכרוז.
  12. בזהירות לאסוף קטע מן המבחנה, מקום זה שטוח לתוך שקית פטרי. באמצעות מיקרוסקופ ויבתר ולהב האזמל טריים, להסיר את הג'לטין מ סביב הסעיף ולחזור המקטע בקבוקון המכיל 2 מיליליטר טריים 10% סוכרוז
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר ג'לטין ככל האפשר בשלב זה כדי לצמצם את רקמת הצטמקות במהלך השלב התייבשות (שלב 1.37).
  13. הקפאה-להגן על הסעיפים בפתרון מבוסס-M PB סוכרוז-גליצרול 0.1 בטמפרטורת החדר על ידי המקננת בהם 10 דקות בפתרון 10% סוכרוז, 20 דקות ב- 20% סוכרוז - 6% גליצרול פתרון פעמיים ולבסוף 30 דקות ב- 30%-12% - סוכרוז גליצרול פתרון פעמיים תחת עצבנות מתמדת.
  14. מקם את המקטעים בחוזקה מלבן קטן בנייר באמצעות מברשת. להסיר עודפי הנוזל מן הסעיפים ומקפלים בזהירות והאלומיניום לתוך חבילה.
  15. להחזיק את החבילה קרוב לפני השטח של חנקן נוזלי מבלי לגעת במשטח ב-30 s ולאפשר ואז הסעיפים להפשיר לחלוטין ' חזור ' ס' כ-30 ההפשרה ההקפאה עוד פעמיים.
  16. להסיר את כל המקטעים באמצעות מברשת צבע ומניחים בקבוקון זכוכית המכילה 2 מ של 0.1 M PB תחת עצבנות מתמדת לשטוף את עודף סוכרוז.
  17. הסר את חמאת בוטנים עם פיפטה פסטר, דגירה בסעיפים 2 מ"ל של 1%-2O H-מימית-2 במשך 30 דקות לשטוף בסעיפים 2 מ"ל של 0.1 M PB 3 x 5 דקות.
  18. להסיר את PB 0.1 M עם פיפטה פסטר ולהוסיף 1% נתרן borohydride (NaBH4) ב PB 0.1 M.
    הערה: לא קאפ המבחנה, כמו NaBH4 פתרון פולט גז מימן.
  19. להסיר את borohydride נתרן עם פיפטה פסטר ולשטוף את המקטעים ביסודיות בתוך 2 מ של 0.1 M PB 5 x 5 דקות.
  20. החלף את PB 0.1 M 10% עז נורמלית בסרום (הגדרות) ב 0.1 M PB למשך 30 דקות.
  21. הסר את הנסיוב עז, דגירה הסעיפים בן לילה ב 4 ° C בתערובת של העכבר monoclonal ארנב נוגדנים polyclonal המציאה בפתרון ABC.
    הערה: רשימה של נוגדנים העיקרי בשימוש במחקרים קודמים מוצגת בטבלה 1 ב. Botcher et al. (2014) 29.
  22. דגירה הסעיפים עבור 2 h בחושך בתערובת של נוגדנים משניים מתויג fluorescently (טבלה של חומרים).
  23. הר הסעיפים על השקופיות הרכבה בינונית ולכסות עם coverslip.
  24. קח תמונות של קרינה פלואורסצנטית labelling בהגדלה X 40 (איור 1Bb).
  25. לאחר קרינה פלואורסצנטית הדמיה, למקם את השקופית לתוך צלחת פטרי זכוכית המכיל PBS, הסר בזהירות את coverslip. ואז לשטוף את המקטעים מחוץ לשקופית באמצעות פולסים עדין של PBS מ פיפטה פסטר. מקם את המקטעים לתוך בקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS.
  26. לבצע את התגובה אבידין-HRP על ידי ראשית המקננת בסעיפים ABC כבר לפחות שעתיים כדי להגביר את המוצר התגובה HRP.
  27. הכינו את הפתרון diaminobenzidine 3.5 (DAB) על-ידי הוספת טבליה אחת 5 מ ל מים מזוקקים.
  28. לשטוף את הסעיפים עם PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות ולאחר מכן עם טריס מאגר פעמיים במשך 10 דקות להסיר את המאגר טריס לאחר לשטוף את האחרון.
  29. במהירות להוסיף טיפה אחת של 8% NiCl2 פתרון הפתרון DAB, pipette הפתרון פנימה והחוצה כדי לערבב, להוסיף במהירות 1 מ"ל של פתרון זה על הסעיפים. דגירה בסעיפים הפתרון2 DAB/NiCl למשך 15 דקות.
  30. להוסיף 10 µL של 1% H-2-O-2 הפתרון DAB. לאפשר את התגובה המשך בחושך תחת עצבנות מתמדת למשך כ- 1 עד 2 דקות ולפקח על תוויות של התאים מלא עם מיקרוסקופ ויבתר.
  31. לעצור את התגובה על ידי הסרת הפתרון2 DAB/NiCl2O /H2ולשטוף את המקטעים באמצעות מאגר טריס פעמיים במשך 5 דקות.
  32. בשכונה fume, למקם את מעגל קטן של מסנן נייר צלחת פטרי, לצנן אותו עם חמאת בוטנים 0.1 M. הרם את המקטעים אחד בכל פעם מהזכוכית בקבוקון שימוש במכחול ומניחים בזהירות שטוח על הנייר.
  33. לכסות את המקטעים עוד עיגול בטעימת נייר סינון ולהסיר מאגר עודף על-ידי נגיעה בעדינות ממחטת נייר אל פני השטח.
  34. החל 8 – 9 טיפות של 1% אוסמיום ארבע-חמצני ב PB 0.1 M על הנייר העליון, מכסים את הכלי, לשמר בשכונה fume לפחות 30 דקות, אך לא יותר מ 1 h.
  35. פתח את הפטרי והרם נייר הסינון העליון. הרם את המקטעים בזהירות אחד בכל פעם באמצעות מברשת צבע, מקם אותם בתוך בקבוקון זכוכית ולשטוף אותם במים מזוקקים פעמיים.
  36. השלך פסולת אוסמיום ארבע-חמצני כראוי. לשטוף את כל הציוד חד פעמיות ומניחים בסלי המתאים.
  37. מקם כל מקטע שטוח על גבי זכוכית בעלת coverslip הסעיפים. להעביר את השקופית לתוך צלחת פטרי, מקום של המבחנה כוס ריקה מעל coverslip כדי לשמור אותו במקום ואת כיסוי עם 50% אלכוהול. לאחר 15 דקות, להסיר את השקופית של הפתרון, להסיר את הסעיפים של השקופית. המקום הסעיפים בחזרה על השקופית ולאחר מכן מקם את השקופית באלכוהול 70% במשך 15 דקות חזור על התהליך אותו עם 95% ולבסוף תמיסת כוהל 100%.
  38. בעקבות הצעד התייבשות, להעביר את המקטעים בקבוקון זכוכית המכיל 100% אלכוהול על מטרף בשכונה fume. החלף את הפתרון אלכוהול פרופילן אוקסיד (ג3H6O) ולשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות. בעקבות בכביסה האחרונה, לשמור ~ 2 מ"ל באווירות בבקבוקון ולהוסיף שרף (יחס 1:1). להבטיח כי השרף התפרקה ולשמור על הסעיפים תחת עצבנות מתמדת במשך 30 דקות.
  39. מניחים כל מקטע התחתיות אלומיניום המכילים שרף אפוקסי באמצעות מקל עץ, דגירה בין לילה.
    הערה: אל תשאירו את המקטעים שרף יותר מ 24 שעות כדי למנוע את הסיכון של פגיעה הסעיפים.
  40. המקום התחתיות מעל צלחת חמה במשך כ 10 דקות לאסוף את כל סעיף במקל עץ ולמקם אותם בשקופית נקי. שמור את הכיוון של כל מקטע עקבי באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. המקום coverslip על הסעיפים. מקם את השקופית בתנור במשך 48 שעות ב 56 ° C לריפוי.

2. 3D שחזורים עצביים

הערה: התוכנה Neurolucida משמש. ההוראות המפורטות להלן חלות רק על מערכת שחזור עצבי התנועה ספציפי (טבלה של חומרים). הסעיפים המתקבל החיתוך מתאימים לפני המרתף באמצעות מיקרוסקופ.

  1. מקום שקופית על הבמה מאובטח עם קליפ הבמה, לפתוח את תוכנת שחזור של נוירון. לחץ על הכרטיסיה ידרשו ובחר תמונה בשידור חי.
  2. למדוד את העובי של כל מקטע באמצעות 100 X עדשה המטרה שמן. רשום הערך על z-מטר בחלק העליון והתחתון של כל אחד מהמקטעים ולחשב את עובי סעיף כהפרש של שני הערכים.
  3. השתמש מטרה ההגדלה נמוכה להתמקד הביתה המקטע המכיל לגוף התא. לאחר מכן השתמש מטרה 100 x, מתמקדים בגוף התא ולחץ במרכז כדי לסמן את נקודת ההתייחסות.
  4. בכרטיסיה ' מעקב ', בחר את מנהל המחלקה סדרתי. לאחר מכן בחר צור מקטע חדש (+ סמל) בחלון מנהל המחלקה סדרתי . הזן את מספר סעיפים. שם כל מקטע בסדר Z הנכון והזן את העובי לחתוך נמדדו 2.2 שלב.
  5. לאתר של סומא תלת-ממד באמצעות המטרה X 100, בחר מתאר בכרטיסיה מעקב ובחר את מתאר הגוף התא . השתמש מוט ההיגוי כדי להעביר את המוקד אל העליון של גוף התא. מקם את הנקודות על ידי לחיצה מסביב להיקף של החלק שנמצא כעת בפוקוס. לחץ לחיצה ימנית ובחר קונטור סגור כדי לסיים את החלוקה הראשונה. חזור על תהליך זה ומעמדות שונים z עד לתחתית של גוף התא (איור 2).
    הערה: בחר 3D להמחיש בכרטיסיה מעקב כדי להמחיש בגוף התא ב- 3D.
  6. לאתר בגוף התא בדו-ממד באמצעות המטרה X 100, בחר תא גוף מתפריט נוירון הכרטיסיה מעקב להתמקד האמצע של הגוף תאים. מקם את הנקודות על ידי לחיצה מסביב להיקף של גוף התא. כדי להשלים את הגופה בתא, לחץ לחיצה ימנית ובחר לסיים גוף התא.
  7. לאתר את סוכת דנדריטים, בחר דנדריט או דנדריט הפסגה בתפריט נוירון . תחילה להתחקות אחר קטע קצר, הראשוני עבור דנדריט כל שימוש בלחצן הגלילה של העכבר כדי להתאים את הקוטר של הסמן כדי להתאים את הקוטר של פיתוח. מעקב לאורך כל דנדריטים באמצעות הג'ויסטיק לזוז מעבר המקטע, בלחצן הגלילה של העכבר כדי להתאים את הקוטר של העקיבה.
  8. בדוק את היישור של העקיבה עם תמונת מיקרוסקופ בשידור חי ולהתאים במידת הצורך, במיוחד לאחר המעבר באמצעות ג ' ויסטיק. בכרטיסיה ' מעקב ', בחר ליישר העקיבה, לחצו על העקיבה ולאחר מכן לחץ על המיקום הנכון.
  9. כאשר צומת בעץ, לחץ לחיצה ימנית ובחר צומת Bifurcating או צומת Trifurcating מתוך התפריט הנפתח.
  10. כאשר הגיעה בסוף ענף, בחר סוף מהתפריט הנפתחת בתפריט נוירון . בחר את סוג הסיום הנכון, כלומר., גבוה סוף, סוף רגיל או lאו סיום כדי להקל על התאמה בין מקטעים.
  11. להפחית את ההגדלה על המיקרוסקופ, ברגע דנדריטים כל במקטע הנוכחי כבר לאתר, בחר את הכרטיסיה השמחה חינם , העבר לאזור המתאים מיד מעל או מתחת למקטע שהושלמו.
  12. כדי לזהות נקודות תואמות בין דנדריטים במקטע המתאים המקטע הושלמה, לחץ על הכרטיסיה להזיז ובחר נקודות משחק. בחר את מספר הנקודות הדרוש כדי להיות מתאימים (שלושה או יותר נקודות הוא מועדף) ולאחר מכן הקש על אישור. לחץ על הסוף של ענף הושלמה ולאחר מכן לחץ על הענף. חזור על הפעולה עבור כל נקודה במשחק. חזור על תהליך זה בהגדלה X 100 כדי להבטיח התאמה מדויקת.
  13. להוסיף סניפים תואמות בסעיף הקודם ישירות על-ידי לחיצה ימנית על הסוף. בחר הוסף סוף כאשר הענף מתייצב עם סניף עקיבה שהושלמו, מעקב כפי שתואר לעיל.
  14. פעם היה לאתר את כל דנדריטים של כל אחד מהמקטעים, לאתר את האקסון באמצעות אותו תהליך על-ידי בחירה אקסון של תא עצב בתפריט.
  15. למקטע הביתה , מחדש ליישר מחדש עם תמונת מיקרוסקופ בשידור חי, בחר קווי המתאר של הכרטיסיה מעקב בחר גבול באזור הגבול/קווי מתאר מוגדרים מראש/שכבה ולחץ לעקוב לאורך מתאר. בחר סוף מתאר פתוחה. לעקוב אחר כל השכבות הרצויה ובחלוקה באזור.
  16. השתמש 3D להמחיש בכרטיסיה מעקב כדי להמחיש את שחזורים תלת-ממד.
  17. כדי להקליט קטעי וידאו של שחזורים תלת-ממד (Video 1), לפתוח את שחזור תלת-ממד ופתח על יצירת סרטים. הגדרת יעד קובץ והרצוי במהירות סיבוב. מומלץ להגדיר את הסיבוב ל- 270 מעלות. בחר להתחיל בהקלטה, שיא למשך מספר שניות, ולאחר מכן לחץ על סיבוב אוטומטי. בחר לעצור את ההקלטה בעת הצורך. עריכת הוידאו עם וידאו עריכה תוכנה (טבלה של חומרים).
  18. כדי לייצא את הקבצים לתוך קבצי Tiff או JPEG, בחר קובץ | ייצוא | ייצוא עקיבה כתמונת. בחר יחס מיקרומטר לפיקסל ובחר מתאימים. בחר צבע רקע ובחר קובץ. שם לקובץ, בחר Tiff או JPEG, הקש על להציל. כדי לייצא את הקבצים לתוך קבצי וקטור, בחר קובץ | ייצוא | עקיבה ייצוא קבצי וקטור.
  19. השתמש תוכנת ניתוח שחזור נוירון כדי לבצע ניתוח morphometric.
    1. תנתח את הדנדריטים ולקבל dendrogram, פתח את הקובץ בסייר Neurolucida. בחר לנתח | מבנה , בחר Dendrogram מתוך התפריט הנפתח (איור 3).
    2. כדי לבצע ניתוח מקיף morphometric של המרתף תלת-ממד (סניף המורכבות, כרכים של סניפים, somas, פני השטח), פתח את הקובץ בתוכנה. בכרטיסיה תצוגה , לחץ על בחר הכל. בחר את הכרטיסיה נתח . לאחר מכן בחר המבנה של ניתוח מבנה הענף.

3. וגישה לפתרון בעיות

  1. שינוי הגדרות המצלמה. לקבלת תוצאות מיטביות, הגדר את זמן החשיפה פחות מ-100 מילישניות לזכות, לקזז קרוב ל 0 ככל האפשר.
  2. אם התוכנה שחזור נוירון יציג את קווי המתאר עקיבה כגוף תלת-ממדי התא ב 3D להמחיש בכרטיסיה מעקב , בחר בחר אובייקטים בכרטיסיה מעקב , החזק את מקש Ctrl במקלדת, לחץ על כל קווי המתאר מצוירות, לחץ לחיצה ימנית ולאחר מכן בחר להגדיר גוף התא בתפריט הנפתח.
  3. כדי להתאים את הפרמטרים-z של ענף בודדים, בחרו את העץ (בבחר אובייקטים בכרטיסיה מעקב ) ולהגדיר הנפתחת z-ההתאמה של כל נקודות דרך התפריט הימני. בחר שינוי מיקום z, ולאחר מכן בחר ערך z Shift והזן הערך הנדרש.
  4. ליישר מחדש את שחזורים באמצעות 'מעבר אל' בכרטיסיה ' להזיז' כאשר יש צורך לעבור מרחק רב מעל העקיבה.
  5. להוסיף צמתים נוספים בשלב כלשהו במהלך תהליך השיקום. בחר את הסניף איפה הצומת למקם לתוך (בחירת עצמים ב- tab מעקב ולחץ על הענף), לחץ לחיצה ימנית ובחר להוסיף צומת לתוך העץ שנבחר. לאחר מכן לחץ על המיקום הנכון על הענף.
  6. בעת שיחזור מכא מורכבים, לאתר סניפים תואמות בנפרד ולא אחוי אותם מאוחר יותר לזיהוי קל יותר של ענפים. לאתר הענפים במדור החדש בנפרד ולאחר מכן לצרף ענפים אלה כדי הענפים תואמות בסעיף הקודם על-ידי ריחוף מעל הסוף של הענף להיות משולבים, לחץ לחיצה ימנית ובחר אחוי, ולאחר מכן מרחף מעל הסוף זה הסניף נמצא כדי להיות משולבים כדי ולחץ.
  7. אם ענף נמצא במעקב תחת הסוג הלא נכון, לבחור את העץ, באמצעות לחצן העכבר הימני, בחר סוג עץ שינויולאחר בחר את סוג העץ המתאים.
  8. אם נקודת מושם באופן שגוי, לבצע Ctrl + Z, או לחץ על הלחצן ' בטל ' בתפריט ' מעקב ' כדי להסיר את הנקודה האחרונה. עם זאת, הליך זה לא יעבוד אם הג'ויסטיק משמש כדי לעבור בין המקטע לפני מנסה להסיר את נקודת. במקרה זה, הנקודה יוסרו כאשר הענף נמצא כעת. בחר הסניף (הקש על בחר אובייקט ולחץ על הענף), רחף מעל הנקודה ניתן להסיר, לחץ לחיצה ימנית ובחר הסר נקודות.
  9. אם לא בטוח שאם שני הסניפים הם מתאימים, גם 1) השתמש 3D Visualize בכרטיסיה מעקב כדי לבדוק אם הענפים תואם ב z-המישור, או 2) להשתמש בתכונה להראות איגוף במנהל סעיף סדרתי כדי להציג סעיפים מיד לעיל, מתחת למקטע הנוכחי באפור.
  10. אם מקטע זה התהפך, ללכת על הכלים היחידים מעקב בחר לשנות קנה מידה של XY ושנה ציר ה-x ל--1. לאחר מכן בחר Z הנכון - הצטמקות , לשנות ציר z ל-1. ואז לאתר סניפים כרגיל. זכור לבטל שינויים אלה בעת העברת למקטע אשר היה את כיוון ההדפסה המקורי. לשנות את x - ו z ציר לא לשנות את סניף סיום תוויות, בזהירות שחבור קצות הנכונים נמצאים בשימוש.
  11. Z-הצטמקות נכונה ניתן לתקן, אם יש הבדל משמעותי בין המקטע לחתוך עובי העובי הנטען נמדד. בכרטיסיה ' מעקב ', בחר כלים, אז תקן Z-הצטמקותוהזן לפחות על ציר z ייצוג עשרוני של העובי לחתוך מחולק העובי הנטען.

תוצאות

נוירונים ב- CA2 בהיפוקמפוס היו מלאים biocytin בעקבות הקלטות אלקטרופזיולוגים (דמויות 1Ac, Ad ו- 1Bc, Bd). הפרוסות תוקנו במשך הלילה בעקבות ההקלטות, נוירוכימיה ואפיון מורפולוגי של נוירונים נחשפו בעקבות פרוטוקול המתוארים כאן.

סידן מחייב חלבון או תכולת החלבון של interneurons מלא נקבע על ידי המקננת הפרוסות תחילה עם נוגדנים הראשי ולאחר מכן עם נוגדנים משניים fluorescently עם תוויות ברורות. מאפייני ירי interneurons במהלך ההקלטות יכתיב את הבחירה של נוגדנים העיקרי בשימוש. אבידין-AMCA שימש כדי להמחיש את interneuron מלא biocytin, אנטי-העכבר fluorescein isothiocyanate (FITC) עז נגד ארנב אדום טקסס (TR) שימשו כדי לאפיין את נוירוכימיה interneuronal (איור 1Bb).

בעקבות הפריט החזותי פלורסצנטיות, פרוטוקול HRP שימש כדי לחשוף את biocytin (איור 1Ab). האנטומיה מפורט בסדר של CA2 interneurons נמשך אז תלת-ממד באמצעות תוכנת שחזור נוירון (איור 2 ו- 3 א איור). סרטון של שחזור תלת-ממד של תא סל הקליטה, מולאו CA2 מוצג וידאו. שחזורים עצביים נחשבו כמשימה שהושלמה, אם שניהם ובשבילים דנדריטי ואת עצב הוגבלו בתוך העומק של הפרוסה μm 450-500. ארבור עצב המסכן מכתים הוערכה על ידי הנוכחות של סניפים קטום עם סופים פתוחים בחלק העליון או התחתון של הפרוסה או על-ידי מכתימה את זה היה מוגבל ל קטע הראשונית האקסון וסניפים מקורב מאוד. איור 4 מייצג את הדוגמאות של טובה והדמיה של עניים HRP מכתימים הבאים biocytin.

ניתוח Morphometric של שחזורים תלת-ממד (איור 3) יכול להתבצע כדי להדגים סניף המורכבות, סומה פני השטח ואת שטח ףקיהב ובשבילים דנדריטים, עצב.

figure-results-1
איור 1 : שחזורים עצביים של שני סוגים של תאים סל הקליטה מלא באזור CA2 בהיפוקמפוס ואת בקורלציה אלקטרופיזיולוגיות נתונים שהושגו בעקבות הקלטות תאיים במבחנה. איור זה השתנה מ מחקרים קודמים23,24. כל שכבה Oriens, SP שכבה Pyramidale, SR שכבה Radiatum, הסים שכבה Lacunosum Moleculare. (א) Aa: שחזור של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטי ואת עצב מוגבלת באמצעות שפופרת ציור (1000 X). דנדריטים הם בשחור, האקסון הוא אדום. Ab: תמונה של התא סל מלא biocytin בעקבות פרוטוקול אבידין-HRP המתוארים כאן. Ac: מעקב נציג של מתח התגובות hyperpolarizing ו- depolarizing הנוכחי הזרקה של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטי ואת עצב מוגבלת. מודעה: דוגמה של פירמידה CA2 לצמצם ארבור סל תא חיבורים הקליטה באמצעות אלקטרודות חדה. פוטנציאל פוסט-סינפטיים סינאפסות ללא הפרדות צבע (EPSP) ממוצעים להציג דיכאון קצרה הרכבת נראית לעין במהלך התגובות רכבות של שלושה קוצים. (B) Ba: שחזור דו-ממדי של תא סל של CA2 ובשבילים דנדריטים של עצב באמצעות שפופרת ציור (1000 X). העץ הדנדריטי של תא זה סל (בשחור) מורחב רדיאלי דרך כל השכבות של CA2 ו- SO אופקית בתוך והאזור SP של CA2 ו CA3 אזורים. דנדריט אופקי אחד להגיע גם לאזור CA1. הפעולה באקסון (באדום) להרחיב CA3 ואת CA1 אזורים. Bb: מלא biocytin (AMCA ההכתמה) סל תא PV-immunopositive (צביעת FITC) והיה CB-immunonegative (צביעת טקסס-אדום). לפנה ס: מעקב נציג של מתח התגובות hyperpolarizing ו- depolarizing הנוכחי הזרקה של CA2 סל תא עם סוכת דנדריטים של עצב. Bd: ממוצעים EPSP מורכב להציג קצר הרכבת הקלה לכאורה במהלך התגובות רכבות של שלושה קוצים. ניתן למצוא דוגמאות של סוגים אחרים של interneurons טלקוה CA2 מחקרים קודמים25,30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

figure-results-2
איור 2 : שחזור תלת-ממדי גוף התא. (א) עקיבה תלת-ממד של גוף התא. מבט על קווי המתאר שונים לאתר z שונים ומעמדות תוך התמקדות דרך הגוף התא. (B) תצוגת תלת-ממד של קווי המתאר שונים. (ג) תצוגת תלת-ממד של גוף התא בזווית אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

figure-results-3
איור 3 : ניתוח Morphometry של שחזורים תלת-ממד עצביים. (א) שחזור תלת-ממד של CA2 arbor הצרה סל תא. כל סניף דנדריטים מיוצג על-ידי צבע (ירוק, כחול, אדום וורוד), האקסון כחול בהיר. Dendrogram (B) של התא סל המייצגים מספר הסניפים דנדריטי ואת האורך של כל אחד מהמקטעים הכלול בתוך התחומים קונצנטריים עם סומא, במרווחים של 100 μm של סומא. הצבעים dendrogram מקבילים לאלה של דנדריטים בדוגמה (ג) א של ניתוח morphometric מתבצע על תאים כפירמידה CA2 (הותאם מן המחקר הקודם23). מספר הסניפים דנדריטים הייתה להתוות נגד המרחק soma של CA2 הפירמידלית הבנויה תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

figure-results-4
איור 4 : דוגמאות טוב (א) ועני (ב) HRP מכתים. (א) Biocytin השחזור חשף interneuron טוב מאוד מלא ב CA2. גוף התא (CB) היא מוכתמת בקדרות ויש לו קווי מתאר ברורים. דנדריטים הם חרוזים ומוצגים כמה קוצים (המיוצגים על ידי כוכבים אדומים). סוכת עצב (א) הוא צפוף ומציגה עם העיתון ons קטן. (B) דוגמה עניים דנדריטי ואת עצב מכתים של 2 תאים כפירמידה CA2. ההכתמה של מגלן הוא חלש עם אין מתאר ברור. צביעת המסכן קשורה לעיתים קרובות עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות קצרים יותר וכתוצאה מכך בנוכחות ענפים עתירי biocytin מעט מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

וידאו 1: שחזור עצביים תלת-ממד של תא סל של CA2 מוגבלת דנדריטים ארבור (המכונה גם CA2 arbor הצרה סל תא) עם סומא שלה בשכבה pyramidale, דנדריטים המתפרסות על-פני כל שכבות של האקסון CA2 שכבה pyramidale, שכבה הסמוך oriens radiatum. סניפים מעטים הגיעו את oriens הרובד CA3 הפרוקסימלית ואת CA3 שכבה pyramidale. תא זה היה מלא biocytin בעקבות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סעיפים היו מעובדים עם אבידין-HRP בעקבות פרוטוקול המתוארים כאן. עקב עם פרוסות, נמצאה רק האקסון בתוך העומק של הפרוסה, למרות דנדריטים שלמים. דנדריטים הם ורוד כהה האקסון בלבן. גבולות השכבה ואזור נוספו בתחילת הסרטון. שחזור תלת-ממד על-ידי גאורגיה Economides-3D וידאו מאת פאלק Svenja. הווידאו היה הקליט עם תוכנת שחזור נוירון כאמור שלב 2.17, נערך עם תוכנת עריכת וידאו. לקשר הוידאו:30. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

פתרונות בשימושהרכב/הוראות
קיבוע פתרון4% paraformaldehyde, 0.2% רוויות חומצה picric פתרון, פתרון גלוטראלדהיד 0.025% 0.1 M פוספט מאגר (PB)
0.1 M מאגר פוספט pH 7.6להוסיף 100 מ של מניות 1 מ' פוספט מאגר 900 מ ל מים מזוקקים
פוספט buffered (PBS) מלוחים pH 7.4/7.5להוסיף 10 מ ל 0.1M פוספט מאגר, 0.2 גרם של אשלגן כלורי ו- g 8.76 של NaCl 990 מ של מים מזוקקים
טריס מאגר pH 7.5להמיס 5.72 g של טריס הידרוכלוריד, g 1.66 טריס הבסיס ב- 50 מ ל מים מזוקקים. ואז להפוך עד 1 ליטר עם מים מזוקקים.
פתרון גלוטראלדהיד מקבע paraformaldehyde במאגר4% paraformaldehyde, 0.2% רווי חומצה picric פתרון, פתרון גלוטראלדהיד 0.025% במאגר פוספט 0.1 M.
פתרון ABCפתרון להתבצע לפחות 30 דקות לפני השימוש הערכה ABC. להוסיף טיפה 1 של פתרון A וטיפה 1 של פתרון B 2.5 מ ל- PBS.
שרף אפוקסי Durcupan:כדי להפוך את הסירים 20: 20 גרם של רכיב A, 20 גרם של רכיב B, g 0.6 של רכיב C ו 0.4 g של רכיב D -
להגן על האיזון נשפך על ידי כיסוי לצלחת עם מעגל של נייר סינון. לשקול בזהירות את ריאגנטים לתוך גביע tripour בפרופורציות האמור לעיל. לערבב ביסודיות על ידי ערבוב נמרצות באמצעות שני מקלות עץ לפחות 5 דקות. התערובת צריך להיות צבע חום כהה צפיפות אחידה. מקם את הספל לתנור ב ~ 50 מעלות צלזיוס לכל היותר 10 דקות להסיר את בועות אוויר רבים ככל האפשר. הערה: השרף תתחיל לרפא אם לעזוב. הספל בתנור יותר מ 10 דקות Decant השרף דרך סירי פלסטיק או מזרקים מ ל, לצאת איתם ולא לאחסן במקפיא-20 ° C מוכן לשימוש.

טבלה 1: טבלה של פתרונות. 

דיון

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במבחנה (איור 1 Ac,d ו- לפנה ס, d) בשילוב עם פתולוגיה ולהפעיל הליכים immunohistochemical את תאור מפורט, סידן מחייב חלבון תוכן, זהותו של interneurons קורטיקלית למבוגרים הקליט להתגלות. באזור CA2, טכניקה זו אפשרה את חקר המעגלים המקומיות בפעם הראשונה וגילה מחלקות של interneurons זה היה לא תוארה בעבר CA1 או CA3: תאים דנדריטים של עצב ארבור סל (איור 1B), bistratified התאים, SP-SR interneurons.

הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. שלבים קריטיים כוללת את השימוש בטכניקה קיבוע כפול כדי לשפר את הניגודיות של מיקרוסקופ אור26 ותוספת של פתרון גלוטראלדהיד וחומצה picric הפתרון מקבע נוגדן חדירה לשפר ולשמר את עצביים ultrastructure27. הקפאת עדין-הפשרה permeabilization נותן יותר לשימור המבנה הדק, בעוד osmication והטבעה שרף להפחית את מטוס ה-z הצטמקות28. בנוסף, החזיית מאוד ומבנים (בסדר אקסונים עם קטן עם העיתון ons לדוגמה) משופרת על ידי המקננת הסעיפים עם2O H2 ו- NaBH4 כדי להפחית את הרקע מכתים. ניתן להגדיל חדות גם עם התוספת של NiCl2 כדי התגובה HRP.

ההליך היסטולוגית מפורט כאן מציע תוצאות מצוינות מבחינת הפארמצבטית ואמינות. עם זאת, משך הזמן של ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות יקבע את האיכות של כתמים, עם הקלטות קצר בדרך כלל מקושר עם צביעת עצב המסכן biocytin/קרינה פלואורסצנטית. הבחירה של הקלטה פרוטוקולים (הקלטות תאיים באמצעות אלקטרודות חדה לעומת תאים כל תיקון מחבר חובק למעקה) עשויים להשפיע גם biocytin השמירה ושימור אנטומיה משובחים.

למרות הקשיים נתקל שימור המבנה הדק במהלך עיבוד היסטולוגית המתוארים כאן, לוקחים את הזמן כדי לשחזר בהגדלה X 100 (1-4weeks בהתאם למורכבות האקסון) יתקבלו בברכה, ששיטה זו מאפשרת ייצוג מדויק של קטרים דנדריטים, עצב. השימוש פחות פרוטוקולים בדרישה לחשוף biocytin labelling הוא מובן, עם זאת, אלה לעיתים קרובות למנוע חזותי ברור של ענפי עצב בסדר. דטרגנטים, כדי לקדם את כניסת אבידין-HRP כדי לחשוף את biocytin ואת נוגדנים, נדרשים לעיתים קרובות בסעיפים עבה, אך יכול לשבש את המבנה הדק. מדעני מוח חיפוש ללא הרף לשיטות שחזור אוטומטי, אבל, עכשיו ולעולם אקסונים במיוחד, biocytin-HRP עם שחזור ידני נשאר תקן הזהב31.

מאוד מפורט שחזורים עצביים, במיוחד מדויק ציורים של עצב עם העיתון ons, צמתים, נוכחות או היעדרות של מיאלין, באופן כללי יותר הציור של ארבור עצב מלאה, עם ייצוג מדויק קוטר האקסון משתנה לאורך שלה אורך, לספק מידע לצורך זיהוי מדויק של סוג ייחודי של interneurone נוסף. למרות interneurons רבים עשויים לא להתאים בדיוק לתוך מחלקה מסוימת, בטכניקה המתוארת לעיל מספקת נתונים מתואם על מאפייני אלקטרופיזיולוגיות עצביים, פלסטיות לטווח קצר המשויך סוג ספציפי של חיבור ומפורט שחזורים עצביים, המאפשר את דיאגרמת החיווט, באזור CA2, לדוגמה, שילמדו בפירוט.

בסדר, מפורט מבנה היא פשוטה יותר לעיתים קרובות במודלים חישובית. בעוד מובן, התוצאה האובדן של מידע שיכול להוכיח הקריטי בעתיד. ניתוח של נתונים היסטוריים שחזורים תלת-ממד עם נתונים מקבילים סינפטית תאפשר התוספת של עוד קריטריונים לסיווג interneuronal. נתונים יכול להיות שהופקדו מאגרים ציבוריים ואת בשימוש על ידי בוני הדגמים לחקור את התוצאה של שינויים סדיר קוטר האקסון myelination על פוטנציאל הפעולה הפצת שהמפתחות.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה קיבל מימון לבין המועצה למחקר רפואי מוענק פרופ אלכס תומסון, ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC-BB/G008639-1), החברה פיזיולוגיים, האיחוד האירופי של נוברטיס פארמה (באזל) אופק 2020 תכנית המסגרת עבור מחקר וחדשנות מתחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 720270 (המוח האנושי פרוייקט SGA1) ותחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 785907 (SGA2 פרוייקט מהמוח האנושי). אנו מודים מאוד על פרופסור אלכס תומסון עבור הגדרת פרוטוקול אזורים קורטיקליים אחרים, הבטחת המימון, תמיכה שוטפת שלה עבור פרוייקט זה. התרומות שנעשו על ידי המעבדה-חברים אשר עזר אופטימיזציה פרוטוקול השחזור, שיחזר CA2 neurones הם בתודה הודה: ג'יי Deuchars, ה Pawelzik, ד א יוז, בניסטר עמ' א, ק Eastlake, Trigg ה, ש א Botcher.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן אבידין-7-אמינו-4-מתילקומרין-3-חומצה אצטית (אבידין-AMCA) - 20.8 מ"ג/מ"ל מעבדות וקטורA2008
ביוציטין  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 דיאמינובנזידין (DAB), להכנת 5 מ"לSigmaD4293
Durcupan שרף אפוקסי ASigma44611
Durcupan שרף אפוקסי BSigma44612
שרף אפוקסי Durcupan CSigma44613
שרף אפוקסי Durcupan DSigma44614
אתנול, puriss. p.a., מוחלט, ≥ 99.8%סיגמא32221
ג'לטיןסיגמא48723
תמיסת גלוטרלדהיד, דרגה I, 25% ב-H2OסיגמאG5882
גליצרול, ≥ 99% SigmaG5516
סרום עיזיםSigmaG9023
עיזים נגד עכברים פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - 14.3 מ"ג/מ"לSigmaF2653
עיזים נגד ארנב טקסס אדום (TR) - 3.3 מ"ג/מ"לInvitrogenT2767
מי חמצן, תמיסה 30%SigmaH-1009
שמן טבילה, צמיגות 1.250 cSt (מואר)סיגמאI0890
ניקל כלוריד (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
אוסמיום טטרוקסיד, למיקרוסקופ אלקטרונים, 4% ב-H2O סיגמא75632
פרפורמלדהיד, דרגת ריאגנט, גבישי SigmaP6148
חומצה פיקרית, לחה במים, ≥ 98%סיגמא
1 מ'סיגמאP3619
תחמוצת פרופילן (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
נתרן טטרה-הידרובוראטVWR27885.134
סוכרוזפישר מדעיS/8600/53
טריזמה הידרוכלוריד, ≥ 99.0%SigmaT5941
בסיס Trizma, ≥ 99.9%SigmaT6066
Vectashield Antifade הרכבה בינונית, מקדם שבירה 1.45 מעבדות וקטורH-1000
Vectastain Elite ABC ערכת HRPמעבדות וקטורPK6100
ציוד בשימוש 
VibratomeAgar Scientific
C4A פלנצ'ט אלומיניום מכוסה GA-MA & עמיתים, בע"מ
מיקרוסקופ Leica DMR Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  מקור אור פלואורסצנטי אקסליטאס טכנולוגיות 
מצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית Leica DFC450 לייקה מיקרוסיסטמס 
עט שרטוט טכני רפידוגרף 0.18 מ"מ מרכז
0.18 מ"מ ציפורן רפידוגרף מרכזגרפי
עט ציור טכני רפידוגרף 0.25 מ"מ לונדון גרפיקה מרכז
0.25 מ"מ רפידוגרף ציפורןלונדון מרכז גרפי
מערכת Neurolucida כולל תחנת עבודה למחשב, במה, מצלמה וג'ויסטיק לבקרת שלב XYZMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida גרסת תוכנה 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW גרפיקה Suite X5Corel
תוכנה לעריכת וידאו בקבוקוני זכוכית Adobe Premiere Pro
14 מ"לפישר מדעי 
חוצץ פוספט 197378 גרפי לונדוןלונדון

מקורות

  1. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
  4. Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
  5. Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
  6. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  7. Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
  8. Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
  9. Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
  10. Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
  13. Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
  14. Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
  15. Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621(2017).
  16. Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
  17. Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).
  18. Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
  19. Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
  20. Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
  21. West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
  22. Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
  23. Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
  24. Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
  25. Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
  26. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
  27. Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
  28. Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
  29. Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).
  30. Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).
  31. Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Avidin HRP
שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.