מאמר שיטה

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

DOI:

10.3791/58615

⸱

14 במרץ 2019

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Medical Oncology, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 3Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro - ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3' ו את מצדו של מתאם-5' של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס' 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).

מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני1.

miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית2. באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.

ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט "האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס" (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.

דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר - 200 ב' - 3p, יש-מיר - 20 ב' - 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר - 3p, יש-מיר-29b - 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר - 520d - 3p, יש-מיר-92a - 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני3,4,5,6, צ'ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5' ו זנב poly(A) כדי 3' של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.

בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לבצע את כל הפעולות הבאות תחת ברדס fume סטיריליים על פי התרגול מעבדה טובה (GLP).

1. פלזמה האיסוף והאחסון

  1. לאסוף 3 מ"ל של דם היקפיים צינור K3E EDTA.
  2. Centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר ב x 1,880 g למשך 15 דקות.
  3. לשחזר פלזמה supernatant ב aliquots של 450 µL.
  4. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: תהליך הצינור דם היקפיים בתוך שעתיים של אוסף. בעת התאוששות הפלזמה הצינור, נא לא להפריע השכבה לימפוציטים.

2. מיצוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה (טבלה של חומרים)

  1. להכין את כל הפתרונות הנדרשים, להפשיר את הדגימות עבור הצעדים החילוץ.
    1. להוסיף 375 µL של מרקפטואתנול הפתרון x denaturating 2 ומערבבים היטב.
    2. להוסיף 21 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף miRNA אני, לערבב היטב.
    3. להוסיף 40 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף 2/3 ומערבבים היטב.
    4. לאפשר מסך פלזמה aliquot כדי להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להתחיל את השלבים החילוץ.
  2. חילוץ אורגני
    1. העברת µL 400 המדגם פלזמה לתוך צינור ללא RNase 2 מ"ל.
    2. להוסיף 400 µL של פתרון x denaturating 2, לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
    3. להוסיף 4 µL 1 ננומטר ספייק-אין לערבב על ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
    4. הוסף µL 800 של חומצת פנול-כלורופורם.
    5. מערבולת עבור 60 s ו צנטריפוגה במהירות המרבית (≥ 10, 000 x g) למשך 15 דקות.
    6. להעביר את שלב מימית העליון צינור טריים. נא לא להפריע את לאטמוספרה. הערה האחסון התאושש ולמחוק את הצינור המכיל את שלב אי-acqueous.
      הערה: 2 x denaturing פתרון מאוחסן ב 4 ° C, עשוי לחזק בטמפרטורה זו. לפני השימוש, חמים הפתרון 37 ° C, לזעזע מדי פעם במשך 10-15 דקות להיות זהירים כדי למשוך את שלב תחתון המכילים את חומצת פנול-סם הרדמה, לא המאגר acqueous שנמצאת מעל התערובת. מחממים את פתרון • תנאי או נוקלאז ללא מים עד 95 מעלות צלזיוס. יש להיזהר חום אמצעי אחסון נאותים של פתרון (100 µL לכל דגימה + 10% עודף).
  3. העשרה RNA קטנים
    1. מוסיפים 1/3 כמות אתנול 100% לשלב מימית מהשלב 2.2.6 ומערבבים היטב.
    2. המקום מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף טריים עבור כל דגימה.
    3. להעביר עד 700 µL של lysate שלב 2.3.1 ואתנול לתוך מסנן מחסנית צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s.
    4. אם יש > µL 700 של תערובת שמאלה, למקם את פילטרט של צינור טריים וחזור על שלב 2.3.3; חזור עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
    5. למדוד את הנפח הכולל של הזרימה דרך.
    6. להוסיף נפח 2/3 של אתנול 100% filtrate ולערבב היטב.
    7. הכנס מחסנית המסנן השני צינור אוסף טריים.
    8. להעביר עד 700 µL נפח דגימה לתוך הדיו, centrifuge ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך.
    9. חזור על שלב 2.3.8 עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
    10. חלות µL 700 miRNA שטיפת פתרון 1 הדיו מסנן, centrifuge הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בצינור אוסף אותו.
    11. החל µL 500 של שטיפת פתרון 2/3 מסנן מחסנית, צנטריפוגה הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים.
    12. למקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים וחזור על שלב 2.3.11 עם 500 µL של שטיפת פתרון 2/3. למחוק את הזרימה דרך ולהעביר את מחסנית מסנן צינור אוסף טריים.
    13. Centrifuge השפופרות עם מכלי מסנן ב x 10,000 g עבור 1 דקות.
    14. להעביר את מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף mL 1.5 טריים ומוסיפים µL 100 של פתרון • תנאי טרופה (95 ° C) או נוקלאז ללא מים.
    15. צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s כדי לשחזר miRNAs ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: התמיסה לבן עשוי בצורה הפתרון לשטוף 2/3. זה עודף EDTA שוחרר מן הפתרון. הימנע ממלאים גבישים אלו במהלך השלבים pipetting.

3. לבצע שעתוק במהופך miRNA קדם הגברה (טבלה של חומרים)

  1. ביצוע התגובה פוליאדנילציה
    1. הפשרת כל ריאגנטים בקרח, אז בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן. בנוסף, הפשרה 50% פג 8000, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
    2. מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה 0.5 mL, קבלת נפח סופי של 3 µL של תגובה קוקטייל עבור כל דגימה. השתמש את הכרכים הבאים, בתוספת 10% עודף אמצעי אחסון עבור כל ריאגנט.
    3. להוסיף µL 1.7 RNase ללא מים, 0.5 µL של 10 x Poly(A) מאגר, 0.5 µL של 10 מ מ ATP ו- 0.3 סוף סוף µL 5 תיקים עשויים U/µL האנזים.
    4. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
    5. להעביר µL 2 מדגם מכל קידוח של התגובה צלחת או תגובת הצינור ולהוסיף 3 µL של התגובה קוקטייל. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן.
    6. מניחים על הצלחת/צינורות הצנטרפוגה תרמי ולבצע את הפעולות הבאות.
    7. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות (שלב פוליאדנילציה).
    8. דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
  2. לבצע את התגובה מצדו.
    1. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
    2. להוסיף µL 0.4 RNase ללא מים, µL 3 5 x מאגר ה-DNA ליגאז, 0.6 µL של 25 x מתאם מצדו, 4.5 µL של 50% 8000 פג, µL סוף סוף 1.5 של רנ א ליגאז.
    3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
    4. להוסיף 10 µL של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר עוקב poly(A). מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
    5. למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: הדגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, עם קהל מעריצים להחזיק ב 4 º C.
      הערה: 50% 8000 פג הוא בעלי צמיגות גבוהה. השתמש בטמפרטורת החדר, כ רפה בעברית ו dispensing לאט. לאחר כל שאיפה, בכל שלב, להחזיק את plugger 10 s כדי לאפשר הכימית לזרום למעלה ולמטה.
  3. לבצע את התגובה שעתוק במהופך.
    1. מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה, עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
    2. הוסף µL 3.3 של RNase ללא מים, µL 6 5 x RT מאגר, µL 1.2 של dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד), µL 1.5 של 20 x תחל RT אוניברסלי 3 סוף סוף µL של 10 x מיקס האנזים RT.
    3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
    4. להוסיף µL 15 של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר מצדו. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
    5. מקום הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות.
    6. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (שעתוק במהופך).
    7. דגירה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
      הערה: המוצר RT עכשיו ניתן לאחסן ב-20 ° C, יישאר יציב עד 2 חודשים.
  4. לבצע את התגובה מיר-Amp (טבלה של חומרים).
    1. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
    2. הוסף µL 17.5 RNase ללא מים, µL 25 של המיקס מאסטר של מיר-Amp 2 x 2.5 µL של 20 x מיקס פריימר מיר-Amp.
    3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
    4. עבור כל דגימה, להעביר µL 45 של המיקס התגובה כל טוב של צלחת תגובה חדשה או צינור התגובה. להוסיף 5 µL של המוצר RT כל שפופרת טוב או תגובה. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
    5. למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל כפי שמוצג בטבלה 1.

4. ביצוע PCR בזמן אמת

  1. לדלל כל cDNA מדגם 1:10 במאגר טה 0.1 x.
  2. לחשב את מספר בארות/משכפל עבור כל דגימה. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה, הוספת 10% נפח עודף.
  3. להוסיף 4 µL של מים נטולי RNase 10 µL של 2 x מהר מתקדם מאסטר מיקס (טבלה של חומרים), µL סוף סוף 5 של cDNA מדולל.
  4. לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה כדי לסובב את התוכן.
  5. העברת µL 19 של תערובת התגובה כל טוב, לאטום את הצלחת, בקצרה צנטריפוגה.
  6. מבצע פרוטוקול תרמי (טבלה 2) מערכת ה-RT-PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתחנו את פאנל של הקשורות אנגיוגנזה miRNAs במחזור ביחס ההישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS), הכולל הישרדות (OS) ותגובות האובייקטיבית לדרג (אור) ב mCRC 52 חולים שטופלו עם טי מבוסס-B הערכת סמנים כזה בדגימות הפלסמה הוא מאתגר בשל קשיים טכניים. השתמשנו בשיטות הוקמה לחילוץ miRNA דגימות פלסמה החולה, שעתוק במהופך, הגברה מראש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, עם רק כמה שינויים נדרש, במיוחד בשלבים החילוץ, הערכנו בהצלחה כל המטרות שלנו בתוך האוכלוסייה המטופלת (איור 2).

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3' UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs נמצאים בטופס יציב בנוזלים ביולוגיים כגון דם, פלסמה, סרום, שתן ורוק, אשר הוביל עניין הולך וגובר ב התועלת שלהם פוטנציאל הקליני10.

למרות זאת, ההערכה של מחז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן באופן חלקי על ידי רוש S.p.A., סוכנות התרופות האיטלקית (דמרי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מנעול כספת ללא Rnase 1.5 מ"ל צינורותEppendorf0030 123.328
מנעול כספת ללא Rnase 2 מ"ל צינורותEppendorf0030 123.344
ללא Rnase 20 ומיקרו; טיפים LStarlabS1123-1810
ללא Rnase 200 ומיקרו; טיפיםL StarlabS1120-8810
ללא Rnase 1,000 ומיקרו; טיפים LStarlabS1122-1830
mirVana PARIS ערכת טיהור RNA וחלבון מקומיThermo FisherAM1556
TaqMan ערכת סינתזה מתקדמת של miRNA cDNAThermo FisherA28007
100% אתנול אנידרוס ACSריאגנטים של קרלו ארבה414605
2-מרקפטו-אתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher4444558
TaqMan בדיקות miRNA מתקדמותThermo FisherA25576
7500 מערכת PCR בזמן אמתApplied Biosystems4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 ומיקרו; L מעבדה פיפטות
ספסל מיקרוצנטריפוגה
מערבולת
בלוק
מכסה מנוע
0.2 מ"ל צינורות
חימום ספסל PCR

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
  2. Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
  3. Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
  4. Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
  5. Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  6. Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
  7. Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
  8. Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430(2015).
  9. Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
  10. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
  11. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
  12. Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
  13. Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
  14. Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443(2014).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAqRT PCRMicroRNA

מאמרים קשורים