העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

התפקיד של כלי הלימפה LECs בכבד אינה מובנת היטב. בעוד כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים הפורטל של הכבד¹ ולהתרחב במהלך המחלה², מעט מאוד מובנת לגבי תפקוד ו פנוטיפ של LECs בתוך הכבד. עם גילוי סמנים הנמצאים בעיקר על LECs³, ימלא החשיבות של תאים אלה בתוך גומחות רקמות שונות בהומאוסטזיס ומחלות פער משמעותי בהבנה שלנו. LECs יש תפקיד מרכזי בשמירה על סובלנות היקפיים הצומת לימפה, גידולים גרורות באמצעות אינטראקציה ישירה עם T תאים^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs הצומת לימפה יכול לקדם חיסון הגנתי דרך האינטראקציות שלהם עם נדידת תאים דנדריטים^14,15,16. לכן, ישנם תפקידים מרובים LECs אשר עשויים להיות ספציפיים ברקמות ואינטראקציות שבו הם נמצאים. עם זאת, מעט מאוד מובנת על איך LECs אינטראקציה עם תאים חיסוניים בתוך הרקמה או איך LECs פועלים מערכות איברים שונים; לפיכך, הערכת LECs על בסיס לכל תא בתוך הכבד או איברים אחרים עשויים להוביל ההתקדמות איך LECs תוכנית חסינות רקמות ספציפיות. אף רוב הספרים המתמקד LECs בכבד מיקרוסקופ כדי להמחיש LECs שימוש אחד או שני סמנים ומורפולוגיה¹⁷, מעט מאוד נעשה להעריך באופן ספציפי LECs על בסיס תא על-ידי התא באמצעות cytometry זרימה, מחקר אחד בכל זאת להעריך את ההבדלים בין תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSECs) LECs¹⁸. היכולת לנתח לץ אוכלוסיות בכבד על ידי cytometry זרימה מאפשר מחקר מעמיק של פנוטיפ לץ במהלך הומאוסטזיס נורמלי או מחלה.

כדי להעריך את LECs על ידי cytometry זרימה, נדרשים מספר סמני פני השטח. בדרך כלל, LECs הם דמיינו ידי הביטוי של גנים homeobox הקשורות פרוספרו 1 (Prox-1), קולטן חומצה היאלורונית אנדותל כלי הלימפה 1 (LYVE1) או צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 3 (VEGFR3) באמצעות מיקרוסקופ. עם זאת, בכבד, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת LECs. Prox-1 מבוטא באופן נרחב על-ידי hepatocytes במהלך פיתוח בכבד, התחדשות, פציעה¹⁹, LYVE1 ו- VEGFR3 באים לידי ביטוי על ידי תאי אנדותל כבד sinusoidal¹⁸. הצומת לימפה, LECs מזוהים באמצעות cytometry זרימה כמו אשכולות של בידול (CD) CD45 - CD31 +, podoplanin + (PDPN)¹⁶. עם זאת, גישה זו היא יותר מידי מינימלית כדי לבודד LECs בכבד מאז CD45 - CD31 + תאים ללכוד תאי אנדותל, האוכלוסייה הדומיננטית של תאי אנדותל כלי הדם בכבד הם LSECs. לפיכך, סמנים אחרים נדרשים כדי להבחין בין האוכלוסייה לץ נדיר מהאוכלוסייה LSEC שופע. CD16/32 (לידי ביטוי LSECs בוגר¹⁸) והן CD146 (נפוץ תא אנדותל כלי הדם סמן זה יוכפל לאחר המרתו לידי בתוך sinusoids הכבד תאי אנדותל sinusoidal הכבד²⁰ עם מעט שום הבעה על ידי הלימפה תאי אנדותל²¹) היו הסמנים המועמד.

לכן, אנחנו אופטימיזציה שיטה אנליטית והצגה של LECs בכבד באמצעות את לעיל סמנים CD45, CD31, CD146, CD16/32, PDPN עבור cytometry זרימה. אנו מתארים את השימוש collagenase הרביעי DNase 1, ההפרדה המכני לעיכול רקמת הכבד להשעיה תא בודד. אנו מתארים גם את השימוש iodixanol דחיסות צבע עבור הבידוד של תאים שאינם parenchymal (NPC), כדי לסלק פסולת הסלולר. לבסוף, באמצעות מספר סמני, נוכל לקבוע האסטרטגיה המגביל ביותר cytometry זרימה אופטימלית לזהות LECs מן הכבד עם PDPN כמו דה מרקר הדומיננטית.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של הקמפוס הרפואי של Anschutz אוניברסיטת קולורדו.

1. הכנת החומרים

1. להפוך את פתרון 5 מ"ג/מ"ל של DNase. אני בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
2. להכין תערובת העיכול על-ידי הוספת 5,000 U/mL של collagenase הרביעי EHAA מדיה של לחץ.
3. לחמם את תערובת עיכול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש.
4. להפוך של בידוד מאגר על-ידי הוספת 4.8% אלבומין שור (BSA) ומאוזנת 2 מ מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) של הנקס תמיסת מלח (HBSS).
5. להפוך את מאגר תאי הדם האדומים (RBC) פירוק על-ידי הוספת 100 מ מ אמוניום כלוריד, 10 מ מ KHCO₃ו- 0.1 מ"מ EDTA כדי מזוקקים H₂O.

2. הכנת השעיה תא בודד של כבד עכבר

1. המתת חסד את העכבר עם CO₂ ונקע בצוואר הרחם.
2. תרסיס למטה העכבר עם 70% אתנול להרטיב את פרוותו. להצמיד את העכבר הרגליים לקרש חיתוך.
3. באמצעות חיתוך מספריים לחתוך את העור, כ- 1 ס מ מעל פי הטבעת, נזהר לחתוך רק העור (בערך 1 מ מ). משוך את העור מהגוף עם מלקחיים במיתולגיות והכנס את המספריים בין העור לבין הצפק. פתח את המספריים כדי להפריד את העור הצפק, ואז לחתוך את העור של החתך בצוואר.
4. להצמיד את העור ללוח לנתיחה באמצעות סיכה אחת תחת כל זרוע ומעל כל רגל. . תעלה את שק הצפק וחותכים כלפי מעלה לכיוון הצוואר. תפוס את אונות הכבד, לחתוך בדיוק מתחת לעצם החזה.
   הערה: כדאי לשים לב אם כל הכבד ישמש עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC).
5. . לחתוך את הכבד, להסיר את הכבד של העכבר והנח אותו ב- 4 מיליליטר EHAA מדיה של לחץ.
6. באמצעות אזמל, חותכים הכבד ב ~ 1 מ"מ קוטר חתיכות.
7. להוסיף 500 µL של תערובת עיכול, µL 500 של DNase אני (2 מ"ג/מ"ל) עד הכבד.
8. דגירה הכבד למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות, מערבבים את הנוזל בעזרת פיפטה 5 מ.
9. לאחר 30 דקות של דגירה, להעביר את הדגימה מתעכל דרך מסננת 100 מיקרומטר צינור חרוטי 50 מ.
10. דחף בעדינות את החלקים הנותרים דרך המסנן עם הבוכנה של מזרק 1-mL.
11. רוחצים את המסנן עם 5 מ של בידוד מאגר את דחף בעדינות את הרקמות דרך מסננת בגב בוכנה של מזרק 1 מ"ל. חזור על פעולה זו עד המסנן נשטף עם 25 מ של מאגר בידוד.
12. Centrifuge התאים ב 400 x g עבור 5 דק בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע.
13. Resuspend בגדר עם 4 מ של RBC פירוק מאגר. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
14. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של מאגר בידוד, צנטריפוגה ב 400 x g למשך 5 דקות.
15. לספור את התאים על hemocytometer כדי לקבוע את ספירת מלא כבד.
16. Resuspend התאים ב- 5 מ של 20% iodixanol ושכבה אותם עם 1 מ"ל ל- PBS.
17. Centrifuge התאים ב x 300 גרם למשך 15 דקות בלי בלם.
18. להסיר את שכבת בין מגניב של iodixanol ולמקם אותם, דרך מסנן 100 מיקרומטר, לתוך צינור חרוטי 50 מ.
19. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של מאגר בידוד, צנטריפוגה ב 400 x g למשך 5 דקות.
20. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 ל- PBS עם 2% סרום שור עוברית (FBS).

3. זרימה ניתוח Cytometric של תאים בודדים מן הכבד

1. לספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ, באמצעות אי-הכללה trypan blue כדי למדוד את התאים קיימא hemocytometer. להוסיף 10 µL של התאים µL 10 של trypan blue, מיד למקם אותם על hemocytometer ולספור את התאים הפועלים (לא כחול) תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לחשב את מספר התאים לכל microliter.
2. Aliquot כ-5 מיליון של התאים nonparenchymal הנותרים לבאר בודדת של צלחת 96-ובכן.
3. Centrifuge התאים ב x 400 g למשך 5 דקות.
4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 90 ל- PBS עם 2% FBS.
5. להוסיף אנטי-CD45 (1:200), אנטי-CD146 (1:200), אנטי-CD31 (1:200), PDPN (1:200) מעורבבת עם µL 10 של 10 x 2.4G2 או אנטי-CD16/32 (1:200).
   הערה: אין לחסום Fc (2.4G2) נעשה שימוש כאשר נוגדן anti-CD16/32-שכותרתו הייתה בשימוש.
6. כדי לקבוע היכן צריך להיות מוגדר השערים חיוביים ושליליים, כוללים פלורסצנטיות מינוס הכתם (FMO) אחת עבור כל צבע ונוגדן שליטה isotype.
7. כדי לקבוע חיים לעומת תאים מתים, כתם עם סמן הכדאיות (למשל, רפאים אדומים 780). דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
8. לשטוף את התאים עם µL 100 ל- PBS עם 2% FBS.
9. השתמש aliquot קטן של תאים כדי לכוונן את ההגדרות לייזר ופיצוי על cytometer הזרימה. כתם התאים עם נוגדן כל fluorophore נפרדים, אחד ללא כל נוגדן.
   הערה: בהתאם cytometer זרימה בשימוש, יש להקים מטריצה פיצוי כדי להסיר חפיפה ספקטרלי.
10. למקם את הצינור מדגם על גבי החללית cytometer ו לאסוף ולהקליט כל האירועים.

4. ניתוח נתונים

1. מסתכלים על הצד-פיזור לעומת העבר-פיזור איזור, שער על תאים "חי" בהתבסס על הגודל, צפיפות, הכדאיות סמן צבע.
2. בשלב הבא, שימוש 510 סגול מבריק CD45 ו CD31 PerCp Cy5.5, שער על תאים CD45 - CD31 + שימוש פקדים isotype ו- FMO כדי לקבוע אוכלוסיות חיוביים ושליליים.
3. לבסוף, באמצעות CD146 v450 או FITC CD16/32 ו PDPN APC, לקחת את CD146 - PDPN + או CD16/32-PDPN + תאים, שוב באמצעות פקדי isotype ו- FMO, כדי לקבוע אוכלוסיות חיוביים ושליליים. תאים אלה הם LECs.

לימודי ניתוח lymphatics בכבד בעיקר השתמשו אימונוהיסטוכימיה כדי quantitate את התדירות ואת קוטר של כלי הלימפה בכבד. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת עבור הערכת LECs על בסיס תא-על ידי תאים-תאים או ביטוי של מספר סמנים, ציטוקינים, נוגדנים או גורמי שעתוק. לכן, שאלנו אם הכבד LECs יכול להיות מבודד מן הכבד ואת להעריך באמצעות cytometry זרימה. העבודות הקודמות לבודד את הצומת לימפה LECs בוצעה באמצעות Liberase DL (collagenase I-II-ו-dispase) ו- 1 DNase בשילוב עם ההפרדה מכני של רקמת לימפה עם מחטים14,16. לכן, השתמשו באותו פרוטוקול עיכול על רקמת הכבד, או collagenase הרביעי ו- DNase 1 שימש כפי שתואר קודם לכן, לבידוד תא החיסון מן הכבד22 . ועקבתי העיכול עם צעד צפיפות הדרגתיות ההפרדה (iodixanol) להסיר hepatocytes ולהגדיל את התדירות של סוגי תאים אחרים בתוך הכבד (איור 1 א'). בעקבות, כבד לעיכול, צנטריפוגה במעבר צפיפות התאים היו מוכתמים CD45, CD31, PDPN ו- CD16/32. CD16/32 תואר לבוא לידי ביטוי על ידי אוכלוסיות LSEC בוגרת, אבל לא לץ אוכלוסיות18. לפיכך, LECs היו מגודרת כמו CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + תאים, בעוד LSECs היו מגודרת כמו CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + PDPN-(איור 1 א'). השערים היו על תאים חיים (רפאים אדומים שלילי), המבוסס על פקדי isotype ו- FMO מכתים (איור 1 א'). APC LYVE-1 על האוכלוסייה לץ היה גם מאושרות (איור 1B). שתי השיטות מותר הפריט החזותי של האוכלוסייה לץ בתוך הכבד; אולם, לפרופיל ההגדלה של התאים היה טוב יותר מבחינה חזותית בעת שימוש collagenase הרביעי ו- DNase 1 יותר collagenase אני-II-ו-dispase (איור 1C). לכן, כל המניפולציות בעתיד בוצעו באמצעות collagenase הרביעי ו- DNase 1, כמפורט בפרוטוקול. בממוצע, השגנו כ- 1,300 LECs לגרם של רקמת הכבד או LECs 2,200 לכל תמים הכבד, בשיטה זו מערכת העיכול.

כדי למטב את האסטרטגיה המגביל, שילוב של fluorophores, כדי למנוע זיהום של LSECs, CD16/32 והן CD146 שימשו. CD16/32 קולטנים גמא Fc II ו- III, מבוטא על LSECs בוגרת אך לא על LECs18. CD16/32 יכול להבחין PDPN + CD16/32-התאים לבין PDPN-CD16 / 32 + תאים, במיוחד בעת שימוש PDPN מצומדת APC או PE CD16/32 מצומדת FITC (איור 1 א'), אבל פחות טוב מתי PDPN היה מצומדת ל PE-Cy7 (איור 1C). הביטוי של CD16/32 לא נמצא על LECs אך נמצא על LSECs. Fc לחסום משתמש הנוגדן CD16/32 כדי למזער את האיגוד קולטן Fc ואיגוד nonantigen ספציפיים של immunoglobulins אל קולטנים Fc. מאז CD16/32 שימש לדמיין LSECs, הכריכה לא ספציפית של immunoglobulins היה גבוה יותר, CD146 היה מותאם כחלופה כדי למדוד את LSECs. לכן, בדקנו CD146 מצומדת כדי V450, סמן תא אנדותל כלי הדם לידי ביטוי מאוד על-ידי LSECs אחרים תאי אנדותל כלי הדם20 אבל נמוך אין ביטוי LECs23. אנחנו קודם ממוטב ההכתמה של CD146 באמצעות FMO ו- isotype CD16/32 וגם CD146 (איור 2 א). אם אנו מוערכים רק את CD16 / 32 + תאים או CD16/32-תאי, CD16 / 32 + התאים היו כל CD146 + PDPN - בעוד CD16/32-התאים היו בעיקר CD146 - PDPN - או PDPN + (איור 2B). כדי לאשר זה מכתים, שימש FMO. על-ידי הסרת PDPN הכתם, האוכלוסייה PDPN + נעלם (איור 2C). מעניין לציין, היו אף CD146 + PDPN + תא, המאשר כי CD146 לא או מאוד נחותה מתבטא בכך PDPN + LECs. לפיכך, אנו בטוחים כי גם סמנים אלה יכולים לשמש לשער את תאי אנדותל כלי הדם בכבד.

כדי לתת תוקף נוסף כי PDPN הוא סמן המתאים עבור LECs, סעיפים כבד מן העכברים היו מוכתמים PDPN (ירוק) והן F4/80 (חום) (איור 3 א). לא אנדותל כלי הדם ולא מקרופאגים ביטוי PDPN הכבד מאתר. היינו גם מסוגלים להבחין cholangiocytes, אשר יכול להכתים חיובי עבור PDPN, של כלי הלימפה, בהתבסס על מבנה הגרעין ברורים של צינורות המרה ועל ידי cytokeratin 7 מכתים (איור 3B; אדום: cytokeratin 7, ירוק: PDPN). מאז מספר סמני משמשים עבור cytometry זרימה, כגון CD31, אשר אינו מתבטא מאת cholangiocytes24, אנו בטוחים כי אנחנו מסירים תאים אלה מניתוח, ובכך מאשר שתאים מן הכבד כי הם CD45-, CD31 +, CD146 lo/מינוס, CD16/32-, PDPN + הם LECs. לבסוף, כדי לספק ראיות כי התאים מוכתמים הם LECs, אנו ממוין אוכלוסייה זו של תאים, המשמשים איכותי בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית להערכת הביטויים Vegfr3 ו- prox-1 . הן Vegfr3 והן prox-1 הוערכו, כפי התעתיקים הללו באים לידי ביטוי על ידי תאים אחרים בכבד —prox1 על ידי hepatocytes ו Vegfr3 על ידי LSECS (בין השאר) – אבל אין תאים אחרים חוץ LECs אקספרס שניהם. הביטוי של שני הסמנים הללו היה גבוה באופן משמעותי באוכלוסייה ממוינים יותר בקו תא מקרופאג מאתר בתרבית (RAW264.7) אשר ואינה מבטאת בדרך כלל ההתחייבויות האלו אבל הוא דומה ביטוי תרבותי מאתר LECs (איור 3C ).

איור 1 : ניתוח cytometry זרימה נציג של collagenase אני-II-dispase ו- collagenase הרביעי-מעוכלים מאתר רקמת הכבד. (א) לוח זה מראה את האסטרטגיה המגביל, זריחה מינוס אחד מכתים, ושולטת isotype עבור ההליך. (B) לוח זה מראה את LYVE-1. ההכתמה של CD16/32-PDPN + תאים. (C) לוח זה מראה את השער cytometry זרימה הסופי לאחר עיכול העכבר כבדים עם גם collagenase אני-II-dispase (למשל, Liberase DL) או collagenase IV ו חישוב CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 איפה LECs CD16/32- ו PDPN +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : זיהוי של CD146 ו- PDPN כסמני המתאים עבור תאי אנדותל הלימפה כבד. פקדים (A) זו זריחה מראה החלונית מינוס אחת, isotype CD16/32 (משמאל) ו CD146 (מימין). (B) לוח זה מציג מגודרת CD16/32 חיובי או שלילי תאים נקבע לוח A. המוצג הוא CD146XPDPN של שתי האוכלוסיות. (ג) לוח זה מציג פלורסצנטיות מינוס אחד עבור PDPN להדגים כי ההכתמה היא נעדרת כאשר הנוגדן לא יתווסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : זיהוי של זרימה PDPN + תאי הלימפה כמו תאי אנדותל- (א) לוח זה מראה אימונוהיסטוכימיה נציג של עכבר הכבד מוכתם PDPN (כחול/ירוק) ו- F4/80 (חום). כלי הלימפה (LV), כלי דם (BV) ו מקרופאג (MF) מסומנות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. פורמלין-תיקון רקמות פרפין-מוטבע היה deparaffinized עבור 20 דקות ב קסילן. רקמות היו להתייבש למים דרך מעבר הדרגתי של אתנול, ואני אחזור אנטיגן התבצע בעזרת ה-pH 6 אנטיגן אחזור מאגר בסיר לחץ במשך 15 דקות רקמות נחסמה בעזרת 0.1% BSA והמוכתמות בעזרת העכבר אנטי PDPN ועכבר אנטי-F4/80 לשעה בחדר טמפרטורה. אוגר אנטי אג HRP ארנב אנטי אג HRP שימשו כמו נוגדנים משניים. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + ירוק Vina שימשו כדי לזהות את F4/80 ו- PDPN, בהתאמה. רקמת counterstained עם hematoxylin, עם תמונה במיקרוסקופ. (B) לוח זה מראה את הניסוי באותו תרגיל כמו לוח , חוץ מכאן, PDPN מוצג cytokeratin ירוק, 7 ב red ו- 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) בצבע כחול. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. רקמות נחסם באמצעות חמור 5% ו- 5% עז סרום והמוכתמות בעזרת העכבר אנטי PDPN (8.1.1) מטריים ועכבר אנטי-cytokeratin 7 1:200 לשעה בטמפרטורת החדר. אוגר אנטי AF647 אג וארנבת אנטי איג-PE שימשו נוגדנים משניים. רקמת counterstained עם דאפי, עם תמונה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. כלי הלימפה (LV) כלי דם (BV), צינור המרה (BD) מסומנות. (ג) לוח זה מציג קיפול יומן שינוי בביטוי Vegfr3 ו- prox-1 מן הכבד ממוינים LECs מבוסס על ההכתמה בפרוטוקול (CD45 - CD31 +, CD146lo/מינוס, PDPN +) לעומת תאים RAW או ראשי הצומת לימפה מאתר LECs. תאים ממוינים הועברו באמצעות עמודה גיזום ביופולימרים RNA שהופק באמצעות ערכת חילוץ של RNA, cDNA נוצר באמצעות ערכת שעתוק במהופך. שפע התעתיק היה מנורמל ל הגן משק בית, Gapdh, עבור כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.