הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58622

⸱

28 בנובמבר 2018

 , 
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.

תקציר

Spermiograms סטנדרטית המתארת איכות הזרע מתבססים בעיקר על הפרמטרים פיזיולוגיים וחזותית, כמו לפלוט נפח, ריכוז, תנועתיות, תנועתיות מתקדמת, ו זרע-מורפולוגיה הכדאיות. עם זאת, הערכות אלה לא מספיק טוב כדי לנבא את איכות הזרע. בהתחשב בכך תחזוקה של זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה תלוי הקרומיות ופונקציונליות תאיים, הערכה של פרמטרים אלה עשויות לאפשר חיזוי טוב יותר של מיומנות ההפריה של הזרע. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות האפשריים כדי להעריך את איכות הזרע שימוש ספציפי הגששים פלורסנט בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry ניתוחים. ניתוחים העריכו propidium יודיד (PI), הקרומיות acrosomal באמצעות fluorescein מצומדת isothiocyanate של קרום פלזמה תקינות באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) אפון השדה agglutinin (FITC-PSA) ו מיטוכונדריאלי הקרומיות באמצעות 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1). שילובים של שיטות אלה מוצגים. למשל, השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס). אנו מאמינים כי שיטות אלה, אשר מבוססים על בחינת ממברנות תא זרע, הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות הזרע.

מבוא

שלמות והפונקציונליות של ממברנות זרע הם כמה הגורמים המציין זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה. קרום פלזמה משמש כמחסום בין תאים תאיים, חוץ-תאית, ובכך שמירה על שיווי משקל osmotic הסלולר1. מתח שגורם נזק שלמות קרום פלזמה עלול לפגום הומאוסטזיס, תצמצם הקיבולת הכדאיות, הפריה ולהגדיל מוות של תאים. למשל, הקפאה קריוגנית מפחיתה את הכדאיות זרע עקב נזק שלה קרום פלזמה, עקב שינויי טמפרטורה ומתח osmotic2. בעבר דיווחנו כי חשיפת זרע בול ריכוזים נמוכים של והקאה מזהמים כגון מסוג אטרזין של חומרי הדברה, diaminochlorotriazine העיקריים המטבוליט שלה או את aflatoxin mycotoxin B1, מפחית את הזרע הכדאיות1,3 . זה נקבע על-ידי תיוג ה-DNA גדילי כפול עם דאפי בשילוב עם PI, אשר נקשר ה-DNA של תאים עם קרום פלזמה פגום.

תגובה acrosome (AR) כרוך פיוז'ן של קרום acrosome החיצוני של קרום פלזמה שמעליה וכתוצאה מכך שחרורו של אנזימים acrosomal4,5. אלה אירועים חיוני עבור חדירה zona-pellucida ומיזוג נוסף של הזרע עם oocyte6. לכן, הערכת הקרומיות acrosomal מהווה פרמטר שימושי כדי להעריך את איכות תאי הזרע ואת פוריות הגבר-7,-8,-9. מספר טכניקות פלורסנט מתאימים עבור אימות תקינות acrosome, FITC-הרשות הפלסטינית או FITC-PSA8,10. במחקרים קודמים שלנו, באמצעות דפוסי FITC-PSA מכתימים1,3, סיפק הגדרות מדויקות עבור (i) acrosome ללא פגע, (ii) פגום acrosome ממברנה ואנו (iii) הגיב acrosome. בדו ח הנוכחי, לנו להעריך את מצב acrosome באמצעות cytometry זרימה ייעודיים זרע ולהשוות את התוצאות לאלה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.

המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles מעורב ב, בין אחרים דברים, ATP סינתזה, ייצור מינים חמצן תגובתי, סידן איתות אפופטוזיס. תפקוד פיזיולוגי, כולל פוריות זכר ונקבה, הם קשורים פונקציה מיטוכונדריאלי שונה11. זרע המיטוכונדריה מסודרים של midpiece, לשחק תפקיד מכריע תנועתיות הזרע12. זה מקובל גם גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) מזוהה עם נורמלי תנועתיות הפריה גבוהה קיבולת13. לעומת זאת, ΔΨm נמוכה קשורה עם רמה גבוה של מינים חמצן תגובתי שומן מופחתת הפריה שיעור14. בכל זאת, תרכובות סביבתיים שונים, למשל האנדוקרינית משבשים, יכול לגרום מתח סלולארית, להוביל גידול ארעי של ΔΨm, hyperpolarization1,3, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים, בסופו של דבר. אפופטוזיס15. החללית פלורסנט 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1) מאפשר בחינת לדוגמה, את ההשפעות של רעלים והקאה על זרע ΔΨm1,3.

Spermiograms סטנדרטי, בהתבסס על פרמטרים פיזיולוגיים, מורפולוגיים, אינם טובים מספיק לחזות ספירת זרע. שיטות מדויקות יותר נדרשים כדי להבטיח את איכות הזרע. כאן, אנו מספקים שתי שיטות האפשריים כדי לקבוע את איכות הזרע בהתבסס על הערכות של זרע ממברנות: צביעת מרובע בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תיאר ב שלנו מחקרים1,3 cytometry זרימה מתקדמות ייעודיים זרע, מנוצל לאחרונה המעבדה שלנו, כבר נמצא בשימוש על-ידי אחרים16,17,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ישראל 1994 עבור רווחת בעלי חיים. זרע שור סופקו על ידי חברה ישראלית מסחרית עבור הזרעה והשבחה. שופך של שוורים 11 הוערכו במחקר זה.

1. זרע מדגם הכנה

הערה: התהליך מבוסס על המעבדה רוט פרוטוקול1,3.

  1. להשיג כ 1-6 מ"ל של שור מאודה בשפופרת 15 מ"ל בטמפרטורת החדר.
  2. כל 1 מ של זרע, להוסיף 6 מ של NKM prewarmed (ב- 37 מעלות צלזיוס) מאגר (110 מ מ NaCl, 5 מ מ. אשלגן כלורי, 20 מ מ מגבים [חומצה 3-N-morphilino propanesulfonic; pH 7.4]), צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 600 x גרם, 1 – 2 פעמים עד תגובת שיקוע לנקות.
    הערה: אם ריכוז הזרע או אמצעי האחסון הראשונית הן גבוהות מאוד, לפצל שני צינורות ברחיצת הראשון.
  3. מיד להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ברור ולהשאיר כ 1 ס מ של תגובת שיקוע מעל בגדר.
  4. בזהירות להישען על הצינורות בזווית של 30 מעלות כדי להגדיל את שטח הפנים לזרע לשחות במעלה ולהמתין 20 – 30 דקות כדי לאפשר spermatozoa לשחות במעלה ב 37 º C.
    הערה: ניתן לראות עכירות.
  5. באמצעות micropipette של בקפידה, להסיר את העליון 1 מ"ל של תגובת שיקוע המכילה את תאי spermatozoa על צינור 1.5 מ.
  6. לשמור את הזרע ב 37 ° C עד השימוש.
  7. מעריכים את ספירת הזרע באמצעות hemocytometer נויבאואר.
    הערה: תא ספירה שונות יכול לשמש במקום, אך הספירה שונה.
    1. כדי למנוע תנועה תא זרע, לדלל 100 µL של spermatozoa תאי עם 10 מ ל מים מזוקקים כפול (DDW) (דילול מטריים) צינור 15 מ"ל ומערבבים בעדינות.
    2. טען µL 10 המדגם בכל צד של hemocytometer ושל coverslip. לוודא למנוע היווצרות בועה בתוך החדר כמו התוצאה עשויה ספירת זרע לא מדויק.
    3. להתבונן במיקרוסקופ מתחם עם יעד X 20.
      הערה: הרשת מלאה ב- hemocytometer מכילה 9 ריבועים גדולים, לכל 1 מ2, coverglass נח 0.1 מ מ מעל הרצפה של החדר. לפיכך, אמצעי האחסון מעל אזור הספירה המרכזי נמצא 0.1 מ מ3 או 0.1 µL. האזור המרכזי של hemocytometer מכיל 25 ריבועים בינוני, כל ריבוע בינוני יש 16 ריבועים קטנים יותר עם שורות בודדות.
    4. לספור את המספר הכולל של תאים נמצא 4 ריבועים פינה בינוני, הכיכר המרכזית. לקבלת דיוק גבוה יותר, נחשב שני תאים (משני הצדדים של hemocytometer נויבאואר) ושימוש הממוצע לחישוב התא ריכוז.
    5. לחשב את ספירת הזרע על-ידי הכפלת המספר אומר שהושג על ידי 5 (כדי לקבל את מספר התאים לפי ספירת אזור) ועל ידי 10,000 (כדי לקבל את מספר התאים לכל 1 מ של דגימה מדולל). ואז להכפיל את ספירת שהושג על ידי הגורם דילול (1: 100).
      הערה: לדוגמה, מספר ממוצע של זרע במניין 5 הריבועים בינונית 25 בתוך אזור הספירה המרכזית של שני תאים הוא 150 ([152 + 148] / 2). לכן, המספר הממוצע של תאי זרע לכל קאמרית (או לכל 0.1 µL) הוא 150 x 5 = 750. הכפל 750 מאת 10,000 כדי להשיג מספר התאים לכל 1 מ של דגימה מדולל (7,500,000) ולאחר מכן להכפיל ב- 100 (דילול פקטור) כדי לקבל 75 x 107 תאים לכל מיליליטר דגימת זרע המקורי.

2. טכניקת #1: הערכת סימולטני של ממברנות הזרע באמצעות פלורסנט מרובים רגשים

הערה: זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) היו העריכו כאמור שתואר על ידי Celeghini et al.10, עם מספר שינויים. מיקרוסקופ פלורסנטי שימש, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית עם עירור ב- 450-490 nm, פליטה-515-565 nm באמצעות מסנן משולש.

  1. להכין מלאי פתרונות.
    1. להכין 0.1 מ"ג/מ"ל דאפי פתרון מניות על ידי המסת 5 מ"ג של דאפי ב 50 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). להכין 50 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם PBS ב 1:10 (הפתרון עובד; 10 µg/mL).
    2. להכין 1 מ"ג/מ"ל FITC – PSA פתרון מניות על ידי המסת 1 מ ג של FITC – PSA ב 1 מ"ל ל- PBS. להכין 50 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם PBS ב 1:10 (הפתרון עובד; µg 100/mL).
    3. להכין פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל JC-1 על ידי המסת 1 מ ג של JC-1 ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). להכין 10 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם דימתיל סולפוקסיד ב 1:10 (הפתרון עובד; 0.1 מ"ג/מ"ל).
    4. להכין את הפתרון PI מניות על ידי המסת 10 מ ג של PI ב µL 400 ל- PBS (ויתור 2.5 מ"ג/מ"ל). החנות + 4 ° C. לדלל מניות 1 עם PBS ב 1:20 (הפתרון עובד; 0.125 מ"ג/מ"ל). לאחסן ב +4 ° C כפתרון מניות.
      התראה: פאי מוטגן פוטנציאליים, צריך להיות מטופל לטיפול. לצבוע יש להמית בבטחה ובהתאם ישימים תקנות מקומיות.
  2. העברה 133 µL של spermatozoa תאי (שלב 1.5) צינור 1.5 מ ל (25 x 106 זרע/mL).
    הערה: אם מדגם ריכוז גבוהה, למהול אותו במאגר NKM כדי להשיג את הריכוז הנדרש; אם הריכוז מדגם של השחייה את הדגימה היא נמוכה יותר, centrifuge את תגובת שיקוע שהושג לאחר שחייה עד 1,000 x g עבור 5 דקות, להסיר 0.5 מיליליטר תגובת שיקוע, לספור את הזרע שוב.
  3. להוסיף µL 17 של דאפי (הפתרון עובד), תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
  4. צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. כדי בגדר, להוסיף 100 µL NKM מאגר.
  6. להוסיף 50 µL של FITC – PSA, 2 µL של JC-1 ו- 3 µL של PI (עובד פתרונות) ואת תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
  7. צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
  8. כדי בגדר, להוסיף 40 µL מאגר NKM, resuspend על ידי pipetting.
  9. להעביר 10 µL של המדגם שקופיות זכוכית, השמצות, coverslip.
  10. לדמיין באופן מיידי על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (שימוש 40 x המטרה) עם מסנן משולש, מצויד with a מצלמה דיגיטלית, ללכוד תמונה בנפרד עבור כל מסנן.
    הערה: יש משמעות לסדר מסננים דמיינו.
    1. דמיינו תחת דאפי ערוץ עם עירור ב 358 nm, פליטה-461 ננומטר.
    2. דמיינו תחת FITC ערוץ של מונומרים ירוק עם עירור ב 450 – 490 nm, פליטה-515-565 ננומטר.
    3. דמיינו תחת PI ערוץ למצרפי אדום עם עירור-488 ננומטר, פליטה-590 ננומטר.
    4. דמיינו תחת JC-1 אגרגטים אדום עם עירור 559 ננומטר, ואת פליטת בטווח של 574 – 627 ננומטר; JC-1 מונומרים ירוק עם עירור 488 ננומטר, פליטה בטווח של 500 – 535 nm.
  11. מיזוג תמונות שלוש קיבל את המסננים בפורמט JPG/JPEG, באמצעות האפשרות "מיזוג" של תוכנת המצלמה.
  12. לפתוח את התמונה הממוזגת בכלי "צבע", השתמש באפשרות ' מברשת ' כדי לסמן spermatozoa שנספרו.
  13. לסווג את spermatozoa מבוסס על קרינה פלואורסצנטית הנפלטים כל בדיקה:
    1. להעריך באופן כללי את spermatozoa לפחות 200 לכל שקופית — כל התאים מופיעים כחול (דאפי).
    2. הערכת הכדאיות על ידי ספירת תאים מתים, אשר מופיעים סגול (PI [אדום] + [כחול] דאפי) ולחשב את האחוז של תאים מתים (מת תאים/סה כ לספור תאים x 100).
    3. הערכת מצב acrosome באמצעות דפוסי פלורסנט מכתים (FITC – PSA). לחשב את האחוזים של הדפוסים שונים (ללא פגע, פגום או יפעלו ויגיבו acrosome תאים/סה כ לספור תאים x 100).
      הערה: קרום acrosomal פגום מופיע בתור כובע acrosome ירוקה, מוכתמים לחלוטין; קרום acrosomal יפעלו ויגיבו מראה שיורית ירוק המשוונית או העליון מכתימה; תאים המכילים ממברנה acrosomal שלם לא תערוכת כל מכתים הירוק של האזור acrosomal.
    4. הערכת ΔΨm על ידי הבחנה spermatozoa עם ΔΨm גבוהה, אשר מוצג על midpiece המוכתמות באדום, spermatozoa עם ΔΨm נמוך, אשר מוצג midpiece מוכתם ירוק. סופר אדום ירוק midpieces בנפרד, לחשב את היחס (אדום/ירוק).

3. טכניקה #2: הערכה של ממברנות זרע עם ערכות מוכנות לשימוש, Cytometry זרימה

הערה: הערכה של קרום פלזמה שלמות, מיטוכונדריאלי הקרומיות קרום פוטנציאליים, acrosomal בוצעה עם ערכות cytometry זרימה מוכן לשימוש המכיל fluorochromes lyophilized כל היטב. ההליך בוצע על פי היצרנים עם מספר שינויים.

  1. הערכת תקינות קרום פלזמה
    1. . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת הכדאיות וריכוז (PI ו- SYbr14), להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
    2. הוסף 199 µL של פתרון במאגר עבור cytometry לכל טוב.
    3. להוסיף 1 µL של זרע הומוגניות-57 x 106/mL (57,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
    4. מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
    5. תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
    6. תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה ההגדרה 'פנוי'.
  2. מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית
    1. . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת פעילות מיטוכונדריאלי (JC-1), להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
    2. להוסיף 10 µL של כוהל מוחלט לכל טוב, פיפטה כדי resuspend את האבקה נוכח בתוך הבאר.
    3. הוסף µL 190 ל- PBS לכל טוב, homogenize על ידי pipetting.
    4. הוסף µL 0.75 של זרע הומוגניות-57 x 106/mL (50,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
    5. מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
    6. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
    7. תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה עם הפעילות ʽmitochondrial ' הגדרה '.
  3. הקרומיות acrosomal
    הערה: FITC – PSA מכתים (ראה טכניקת #1) מאפשר הערכת 3 קטגוריות acrosome (acrosome ללא פגע, יפעלו ויגיבו acrosome ו- acrosome פגום). באמצעות זרימת cytometer ואת הכדאיות & ערכת שלמות acrosome (PI ו- FITC – הרשות הפלסטינית), spermatozoa מופרדים בקטגוריות אלה 3.
    1. . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת שלמות הכדאיות & acrosome, להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
    2. להוסיף 200 µL של פתרון במאגר עבור cytometry לכל טוב.
    3. הוסף µL 0.7 של זרע הומוגנית-57 x 106/mL (40,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
    4. מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
    5. תקופת דגירה של 45 min ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
    6. תריצי את הדגימה דרך הזרימה cytometer עם ʽInCyte ההגדרה '.
    7. לנתח את תוצאות היסטוגרמה ידי gating בשלושה תחומים סמן לפי עוצמת קרינה פלואורסצנטית, המייצג זניח, נמוך-ואזוריט תאים עם שלם, מוכתם acrosome (R1), נמוך-ואזוריט תאים עם ממסר צבעונית חלק acrosome (R2) ו תאים מאוד ואזוריט עם שיבשו acrosome (R3).
      הערה: השתמש במקטע "ניתוח קבצים שנרכשו באמצעות מודולים אחרים" במדריך למשתמש מכשיר על מנת ליצור את האזורים שלוש (R1, R2, R3).

4. טכניקה #3: הערכה של ממברנות הזרע באמצעות המחקרים פלורסנט וכל Cytometry זרימה

הערה: השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס).

  1. להכין 1 x annexin V מאגר איגוד מ 20 x מניות פתרון (שתדללו µL 500 של annexin V איגוד מאגר 20 x פתרון מניות עם 9.5 מ ל מים מזוקקים סטריליים).
  2. מעריכים את ספירת הזרע באמצעות hemocytometer נויבאואר כמתואר בסעיף 1.7.
  3. רחץ 106 spermatozoa ב 1 מ"ל של 1 x annexin V איגוד מאגר, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
  4. תשאף את תגובת שיקוע לחלוטין.
  5. Resuspend בגדר ב µL 100 1 x annexin V איגוד מאגר.
  6. להוסיף 10 µL של annexin V מצומדת כדי FITC.
  7. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף spermatozoa על-ידי הוספת 1 מ"ל 1 x annexin V איגוד מאגר לכל 106 תאים ו צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 10 דקות.
  9. תשאף את תגובת שיקוע לחלוטין.
  10. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL 1 x annexin V איגוד מאגר לכל 106 תאים הכולל.
  11. להוסיף 1 µg/mL PI מייד לפני ניתוח עם cytometer זרימה.
  12. תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה על ʽInCyte'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה fluorimetric בו זמנית הערכה של זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) שימוש PI, דאפי, FITC-PSA, JC-1. הערכה של ממברנות הזרע באמצעות צביעת בו זמנית עם ארבעה מכשירי בדיקה פלורסנט מאפשר, לדוגמה, הערכת שיעור זרע בכל קטגוריה – חיים לעומת המלח; גבוה לעומת נמוך ΔΨm; שלם vs. נזק acrosome — בו-זמנית עבור כל תא זרע.

איור 2 מציג את הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פוטנציאל הפריה זרע תלויה בגורמים מרובים המשקף את איכותם. ריכוז גבוה של spermatozoa, שיעור גבוה של spermatozoa מאוד בהדרגה תאי עשוי להיחשב זרע באיכות גבוהה. למרות זאת, כזה הערכה לא לקחת בחשבון פרמטרים אחרים התאית ופונקציונליים. השימוש microcapillary 'ספסל-top' זרימת cytometer ניתן להתאים בקלות להערכה של מבנים זרע שונים באמצעות הגששים פלורסנט, כפי שמוצג בעבר על-ידי אחרים17 והפגינו בזאת (טכניקה #3). לדוגמה, זרע acrosome תקינות חשוב במיוחד עבור המופע של דישון טבעי מוצלח, לכן, הערכה מדויקת של מצב acros...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי ישנם שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים רוצה להודות "שיאון" חברה ישראלית עבור הזרעה והשבחה (חפץ-חיים, ישראל) על עזרתם שיתוף פעולה, ואת גברת Li Na (IMV טכנולוגיות, l ' aigle, צרפת) לקבלת סיוע עם כלי התקנה, הדרכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]SigmaM1254
PBSSigmaP5493
DMSOSigmaD2438
אתנול מוחלטSigma64-17-5
Hemacytometerנויבאואר גרמניההמוציטומטר
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול)סיגמאD9542בדיקה פלואורסצנטית
PI (פרופידיום יודיד)בדיקה פלואורסצנטיתסיגמאP4170
FITC-PSA (פלואורסצאין איזותיוציאנט מצומד Pisum sativum agglutinin)סיגמאL0770בדיקה
פלואורסצנטיתJC-1 (5,5',6,6'-טטרה-כלורו-1,1',3,3'-טטרה אתיל-בנזמידזוליל קרבוציאנין יודיד)ENZOBiochem, ניו יורק, ניו יורק, ארה"בבדיקהפלואורסצנטית
ENZ52304 נספח V מצומד ל-FITCMACS, Miltenyi Biotec130-093-060בדיקה פלואורסצנטית
מאגר מחייב Annexin V 20x תמיסת מלאיMACS, Miltenyi Biotec130-092-820מאגר
Nikon Eclipse, TE-2000-uניקון, טוקיו, יפןמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך
Nis ElementsNikon, טוקיו, יפןתוכנה
Nikon DXM1200FNikon, טוקיו, יפןמצלמה דיגיטלית
Guava EasyCyte PlusIMV Technologies, L'Aigle, צרפתציטומטר זרימת זרע מיקרו-נימי
CytoSoftGuava Technologies Inc., הייוורד, קליפורניה, ארה"ב; מופץ על ידי תוכנת IMV Technologies
פתרון חוצץ לציטומטריהIMV Technologies, L'Aigle, צרפתערכת 023862
חיץ כדאיות וריכוזIMV Technologies, L'Aigle, צרפתערכת 024708להערכת כדאיות
ערכת פעילות מיטוכונדריאליתIMV Technologies, L'Aigle, צרפתערכת 024864לפעילות מיטוכונדריאלית ערכת
כדאיות ושלמות אקרוזוםIMV Technologies, L'Aigle, צרפת025293ערכה להערכת תקינות אקרוזום
JMP-13SAS Institute Inc., 2004, ארי, קרוליינה הצפונית, ארה"בתוכנה
זרע בקר"SION", חברה ישראלית להזרעה מלאכותית והזרעה, חפץ-חיים, ישראל

מקורות

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שלמות ממбраנתו של הזרעגשים פלואורסצנטייםציטומטריה של זרימהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתממברנה פלזמטיתממברנה אקרוזומליתממברנה מיטוכונדריאליתצביעת DAPIצביעת PIFITC-PSA
Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.