ברזולוציה גבוהה בדוגמת באמצעות התצהיר Biofilm pDawn-Ag43

סיכום

נדגים שיטה הפקדת biofilms חיידקי Escherichia coli בדפוסי המרחבי שרירותי עם רזולוציה גבוהה באמצעות גירוי אופטי של מבנה השטח-אדהזיה מקודדים גנטית.

תקציר

המבנה המרחבי של המתבנת לשחק תפקיד חשוב biofilms חיידקי. כאן נדגים שיטה נגיש עבור culturing biofilms חיידקי לתבניות המרחבי שרירותי ברזולוציה מרחבית גבוהה. הטכניקה משתמשת מבנה גנטי מקודד optogenetic — pDawn-Ag43 — זה זוגות ביופילמים ב e. coli אופטי גירוי על ידי אור כחול. אנו מפרטים את התהליך לשינוי צורה של e. coli עם pDawn-Ag43, הכנת את הסידור האופטי הנדרש, והפרוטוקול culturing biofilms בדוגמת באמצעות חיידקים pDawn-Ag43. באמצעות פרוטוקול זה, להיות בדוגמת biofilms עם רזולוציה מרחבית מתחת 25 μm על משטחים שונים, סביבות, כולל תאי סגור, ללא צורך מיקרו-מלאכותית, מתקני חדר או שטח רעלני. הטכניקה היא המתאימה לשימוש ביישומים לחקור את ההשפעה של מבנה biofilm, מתן tunable שליטה המתבנת biofilm ונוח. באופן כללי יותר, יש גם יישומים פוטנציאליים biomaterials, על החינוך ועל ביו-אמנות.

מבוא

Biofilms צמוד-משטח קהילות של חיידקים הינם ידועים היטב צימוד מבנה חזק-הפונקציה שלהם. הגאומטריה המרחבית ו המתבנת של biofilms לשחק תפקיד חשוב בתפקוד הקהילה הכללית (ולהיפך)¹. האורך קטן משנה את קנה המידה מעורב biofilm מבנה – הסדר עשרות מיקרונים²— להפוך פקד tunable ונוח של biofilm תכנים בעיה מאתגר. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול המאפשר biofilms להיות בדיוק בדוגמת ב שרירותי גיאומטריות, בהתבסס על תאורה אופטי.

פרוטוקול המובאת כאן משתמש pDawn-Ag43³, שאינה optogenetic זוגות ביופילמים בחיידק e. coli אופטי תאורה על ידי נהיגה הביטוי של Ag43 (adhesin הגן אחראי משטח הדבקה biofilm היווצרות) תחת השליטה של pDawn⁴ (הרגולטור תעתיק נשלט על ידי תאורה אופטי). השיטה נוחה לשימוש, ניתן biofilms דפוס שונות לפני השטח סביבות, כולל התרבות (שקוף) סגור צ'יימברס. לעומת שיטות התצהיר תא קיימות, כגון התצהיר מבוסס-droplet⁵ או משטח prepatterning/טיפול⁶, pDawn-Ag43 אינה דורשת מתקני מיקרו-מלאכותית או חדר, לא דורשת חומרים מעבר לאלה לרשות המעבדה למיקרוביולוגיה טיפוסי. הוא מסוגל תבנית עם רזולוציה מרחבית מתחת μm 25, מתקרבת לממדי המרחבי microcolonies של באופן טבעי הקיים biofilms². בסך הכל, טכניקה זו מספקת את היכולת לטפל biofilm מבנה, אשר לאחר מכן פותח דרכים רבות ללמוד microecology ב קהילות חיידקי⁷. בנוסף, biofilms בדוגמת עשוי לספק פלטפורמה נוחה על מנת מהנדס biomaterials שימושי^8,9. בנייר זה, אנו לדון את פרוטוקול בסיסי הדרוש עבור תכנים biofilms באמצעות pDawn-Ag43, כתובת פוטנציאליים שינויים, פתרון בעיות הקשורות השיטה.

פרוטוקול

1. הכנת זני חיידקים pDawn-Ag43

1. להפוך את pDawn-Ag43 זן e. coli עניין (איור 1).
   1. לגדל זן שיבוט אירוח פלסמיד pDawn-Ag43 (השגה של מאגר פלסמיד) מאת מזריקים את המתח בתוך מרק LB בתוספת 50 μg/mL spectinomycin (LB + spec) צינור תרבות (לילה בחממה חזק ב ~ 250 סל"ד, 37 ° C). לאחר מכן, להשתמש ערכת miniprep לקצור את פלסמיד מטוהרים pDawn-Ag43¹⁰.
   2. לבחור זן e. coli לעניין להיות בדוגמת. עד כה, pDawn-Ag43 אומת לעבוד ב- MG1655³ ו- BW25113.
   3. שימוש פרוטוקול מבוסס ליצירת המוסמכת (למשל, כשיר מבחינה כימית¹¹ -electrocompetent¹²) מניות של הנבחרת e. coli זן (למשל, MG1655).
   4. להפוך את pDawn-Ag43 פלסמיד ה חיידקים המוסמכת^11,12, ואחריו 1 h שחזור, וצלחת LB + פלטות אגר spec. לאפשר מושבות לגדול בין לילה ב 37 º C.
2. חנות pDawn-Ag43 הפך זנים.
   1. לחסן מושבה בודדת של pDawn-Ag43 מ ק ג + spec צלחת אגר לתוך LB + spec מרק צינור תרבות, לגדל את זה בחממה חזק (ב ~ 250 סל ד, 37 ° C) לשלב מעריכית (OD600 ~0.4 - 0.8).
   2. להכין מלאי כדי לאחסן את המתח pDawn-Ag43 הפך ב-80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך על ידי ערבוב 1 מ"ל של תרבות עם 1 מ"ל של 50% גליצרול סטרילי הקפאה-צינור כדי להשיג גליצרול 25% מניות מקפיא. לאחסן את זה במקפיא-80 ° C.
   3. אם פלסמידים נוספים (למשל, כתב פלורסנט פלסמידים) צריך להשתנות, ליצור תאים המוסמכת^11,12 מ- pDawn-Ag43 הפך זן וחזור על תהליך טרנספורמציה^{11 , 12} על פלסמידים נוספים לפי הצורך.
      הערה: אם משתמש אלקטרופורציה⁸, זה אפשרי cotransform מרובים פלסמידים (כולל pDawn-Ag43) בו זמנית. עם זאת, שינוי בו זמנית אינו מומלץ בשיטות טרנספורמציה כימיים, כמו גודל גדול (> 10 kB) pDawn-Ag43 אומר טרנספורמציה היעילות מופחתים.

2. הכנת הסידור אופטי מקרן לחיידקים זרחני

1. חממה חיידקי עם קירות שאינם שקופים חור על העברת כבלים, מקרן נייד המסוגל התאמה ותפקוד בתוך החממה חיידקי, והשתמש נישא המצוידים בתוכנת המצגת-השלכה (ראה טבלה של חומרים). כאשר בוחרים את המקרן ואת חממה, להבטיח מרחק מיקוד מינימלי של המקרן זה פחות מאשר הגובה הפנימי של החממה.
2. למקם את המקרן בתוך החממה בתחתית, עם צמצם מצביע ישירות כלפי מעלה, מבט בתקרה, איפה החדר תרבות biofilm מצורף (איור 2).
3. לתקן המקרן במקום על-ידי בניית מלכודת עם בממרח אופטי הבסיס מחובר לפרסם אנכי, בתורו מחובר פוסט אופקי שבו ברגים לתוך המקרן (איור 2). שים לב כי זה יכול להיות שונה בהתאם החלקים מקרן/זמינים. בסופו של דבר, הדרישה מפתח היא כי המקרן ביציבות קבוע ליד החלק התחתון של החממה, עם הפתח המצביעה כלפי מעלה.
4. חבר את המחשב הנייד באמצעות כבל התצוגה (למשל, HDMI) המקרן בתוך החממה.
5. אם המשטחים — במיוחד את התקרה – הפנים של החממה הם רעיוני (למשל, משטח מלוטש מתכת), לכסות אותם עם משטחים מט כהים לצמצם השתקפויות.
6. להשתמש בקלטת כדי לצרף צלחת ריקה תרבות 'טמבל' התקרה של החממה. שים לב, כמו עם המקרן, יש דרכים רבות מקובל לצרף לצלחת תרבות; ודא כי המשטח התחתון השקוף לשכת התרבות, שבו מתרחשת תאורה, אינו מכוסה.
7. התאם את המוקד במקרן על-ידי הפעלת הידית התמקדות כך המטוס התמקדות עולה בקנה אחד עם מהמשטח התחתון של המנה תרבות biofilm (למשל, צלחת טוב) מחוברת לתקרה של החממה (איור 2). המקרן צריך להאיר תמונה חדה, שאינם מטושטשות על גבי התחתון של המנה תרבות. להסיר את המנה תרבות 'טמבל' לאחר ההקרנה מוטבה.
8. באמצעות תוכנת מחשב נייד, לכוון את המקרן כדי להאיר את שדה הראייה מלא עם תאורה כחולה המרבי (למשל, RGB = [0, 0, 255]) על ידי הצגת שקופית כחול מלא.
9. למדוד את עוצמת תאורה של המקרן באמצעות מד הכוח האופטי על-ידי הצבת בראש photodetector מבט בתקרה חממה ולקרוא את עוצמת במד חשמל המתאימים המכויל ננומטר אורך גל האור 460. בצע את ההוראות על חיבור. ומכייל את photodetector עבור מד הכוח ספציפי משמש.
   1. להפחית את תאורת (למשל, לכבות את האורות בחדר, או למקם את החממה הרחק מקורות אור) ככל האפשר לפני קבלת תאורה בעוצמה מדידות.
10. התאם את עוצמת תאורה באמצעות מסנן הניתנים לשינוי דחיסות נייטרלית שהוצב הצמצם מקרן. לסובב את המסנן כדי לכוונן את עוצמת תאורה שהיא נמדדת על ידי מד הכוח, עד עוצמת תאורה במרכז האזור המתוכנן אור כחול קורא μW/ס מ 50².
    הערה: בזמן זה ניתן לכוונן את עוצמת תאורה באמצעות ערכי RGB הכחול התחתון בצד התוכנה, באמצעות מסנן בזמן למקסם את הערך RGB כחול יש את היתרון של הגדלת הניגוד אופטי של המערכת בין מואר vs . אזורים כהים.
11. לצייר דפוסים שרירותי שימוש בתוכנת המצגת/מקרן במחשב הנישא ולהציג את הדפוסים הללו בתקרת החממה, באמצעות המקרן.
    הערה: אזורים להיוות Biofilm צריכים להיות סגורים עם תאורה כחולה המרבי (למשל, RGB = [0, 0, 255]), שאינם biofilm-יוצרים אזורים עם תאורה אין (למשל, RGB = [0, 0, 0]).

3. culturing Biofilms בדוגמת

1. לפני תאורה, להכין את החיידקים pDawn-Ag43, החל מגליצרול מקפיא המניה, כך הם הם בצורה אמינה המושרה בשלב הגידול האקספוננציאלי מאוחר לתאורת (איור 3 א).
   1. במלאי גליצרול אל LB + פלטות אגר spec, צובעות זן pDawn-Ag43. לאפשר מושבות לגדול לילה (37 מעלות צלזיוס).
      הערה: מכאן ועד השלב תרבות תאורה, להבטיח התאים להישאר בחושך במידת האפשר – תקופות קצרות-תאורה תאורת הסביבה (למשל, עבור subdilution) מקובלים.
   2. לחסן מושבה של חיידקים pDawn-Ag43 מן צלחת אגר ב- LB + spec מרק ולגדול התרבות בין לילה לשלב נייח (ב חממה חזק ב ~ 250 סל ד, 37 ° C, עבור h ~ 16).
   3. Subdilute התרבות ביחס של 1:1,000 עם LB + spec מרק (למשל, להוסיף 1 μL של תרבות לילה 1 מ"ל LB טריים + spec).
   4. לאפשר את התרבות subdiluted לגדול עד שלב מאוחר מעריכי ותחילת נייח (OD ~ 1.0, ~ 6 h בחממה חזק ב ~ 250 סל"ד, 37 ° C).
   5. בזמן שחיכינו לתרבות לגדול, להכין M63 מדיה עם 1 x M63 מלחי, 1 מ MgSO₄, 0.2% גלוקוז, חומצות casamino 0.1% 50 μg/mL spectinomycin במים (להבטיח החלקים המרכיבים אותה סטרילי).
   6. Subdilute התרבות מאוחר-מעריכית-שלב ביחס של 1: 100 עם מדיה M63 בתוספת 50 spectinomycin μg/mL. לאחר מכן, להציג את הדילול לתוך תבשיל תרבות biofilm (למשלpipette המדגם מדולל לתוך צלחת טוב).
      הערה: אמצעי האחסון הנדרש עבור זה subdilution מטריים תלויים המנה תרבות בשימוש (לדוגמה, אם משתמש צלחת טוב פוליסטירן 6-טוב [הלא--תרביות רקמה מטופלים], דוגמה אחת דורש הוספת 20 μL של תרבות 2 מ של M63 + spec, כמו אחסון טוב סטנדרטי של צלחת 6-ובכן הוא ~ 2 מ"ל).
2. כל הדגימות מוכנים עכשיו תאורה, להקליט את המנה תרבות בתקרה של החממה, המבטיח כי השטח בחלק התחתון של המנה הוא שקוף לתאורת מלמטה על ידי המקרן.
   הערה: חשוב לוודא כי התקרה של החממה אינה רפלקטיביים, כדי למזער את תאורה תועה. תאורה תועה יכול גם להיות מופחת באמצעות לוחות קיר שחור כמו מנות תרבות, למרות שאין זה הכרחי לחלוטין — אם שימוש כזה צלחות, לוודא מהמשטח התחתון הוא שקוף.
3. לאפשר biofilms לתרבות בחממה בן לילה (16 h עם שום רעד בידיים, ב 37 מעלות צלזיוס). שימו לב כי מקרנים מסוימים להיות פחות אמינים בטמפרטורות גבוהות יותר. אם זה המקרה, תרבות בטמפרטורה נמוכה יותר (למשל, 30 מעלות צלזיוס), במחשבה שיש זמן הדגירה צורך להיות מוגברת, תלוי במתח e. coli .

4. הדמיה בדוגמת Biofilms

1. לאחר הגידול לילה של הדגימות biofilm, הסר את המנה תרבות של החממה. המנה תהיה biofilm חיידקים מצורף משטח תחתון איפה זה מואר, כמו גם חיידקים פלנקטוניים התפזרו בתקשורת נוזלי לעיל.
2. למחוק את התאים פלנקטוניים על-ידי הסרת התקשורת נוזלי המנה תרבות (למשל, על ידי בעדינות כ רפה בעברית עם פיפטה).
3. לשטוף את הדגימה 2 x עם פתרון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר תאים פלנקטוניים הנותרים (איור 3B) על ידי pipetting בעדינות ב- PBS, ואחריו השאיפה.
4. אם התאים fluorescently מתויגים, תמונה ישירות את הדגימות באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ¹³ (למשל, שדה רחב¹³, תלת-ממדי קונאפוקלית¹⁴, וכו ').
   הערה: פלורסנט biofilms יכולים גם להישמר בעזרת אמצעי הרכבה עצמית התקשות. החלת טיפה אחת של הרכבה מדיה מדגם biofilm, לכסות את זה עם coverslip זכוכית, מטפל לא לתפוס בועות מתחת, ולאפשר לו להקשיח בן לילה לפני הדמיה.
5. אם התאים בקטריאלי בשימוש fluorescently לא מתויגים, להחיל את קריסטל ויולט הכתם טכניקה¹⁵ (איור 3B) כדי לשפר את הניגודיות biofilm לפני הדמיה.

5. פרוטוקול שינויים/חלופות

1. לגדול חיידקים pDawn-Ag43 על משטחים שונים.
   1. לשים זכוכית או פולי-דימתיל-siloxane קופונים (PDMS) (למשל, coverslips או רצועות דקיקות של PDMS) לתוך צלחות היטב לפני התוספת של מדגם חיידקי/תאורה, ולהמשיך באותו הפרוטוקול כמו קודם כדי דפוס pDawn-ag43 biofilms זכוכית, PDMS.
2. לגדול חיידקים pDawn-Ag43 בתוך תא שקוף, תחום תרבות.
   1. צור תבנית לשכת התרבות של PDMS.
      1. עבור חדר תרבות בסיסיים, ליצור עובש על-ידי הצמדת מנסרה קשה, מלבני על משטח שטוח (המנסרה יהפוך חלל ב- PDMS המשמשת תא תרבות ברגע העובש הוא יצוק). שימו לב כי יותר מסובכים תרבות תא עובש יכול להיות מפוברק באמצעות הדפס אבן רכה¹⁶.
   2. הטלת חור PDMS על ידי מזיגת PDMS לתבנית ומאפשרת לרפא (עבור פרוטוקול מפורט הדפס אבן רכה, ראה מדע לחינוך מסד הנתונים של יופיטר¹⁶).
   3. לאחר ריפוי, לקצץ בכל PDMS עודף, אגרוף ערוצי כניסה/יציאה אל החדר חלל/תרבות, בונד את החלל על משטח שטוח (למשל, זכוכית/פוליסטירן) בהקשת בחוזקה את PDMS על גבי משטח שטוח, עוזב את החלל בין פני השטח, התקרה PDMS כמו תא תרבות biofilm.
      הערה: מליטה יותר קבוע המבוסס על טיפול פלזמה¹⁶ יכול לשמש גם, אבל הצ'יפס ואז לא תהיה לשימוש חוזר.
   4. לפי התקנון תרבות כמו בעבר, באמצעות מזרק עם קצה קהה מחטים (במקום פיפטה) כדי להציג את הדגימה חיידקיים לתוך תרבות הקאמרית/שטיפה עם מאגר PBS (איור 3C).
      1. אם באמצעות חור בונדד באופן זמני, להשתמש לחץ שלילי רק למשוך נוזלי לתוך וצ'ק אאוט של התא, כדי להבטיח כי החלל לא להיות unbonded מפני השטח זכוכית/פוליסטירן המשמש כבסיס.
3. לגדול חיידקים pDawn-Ag43 באמצעות photomask של הסרט עבור תאורה מובנית.
   1. עיצוב דפוס biofilm באמצעות תוכנות CAD תואם עם הסרט photomask מדפסת/הדפסה שירות. העיצוב הסרט photomask צריך להיות ברור באזורים איפה biofilm מיועד להדפסה, שחור/אטום במקום אחר. כשהפעולה תסתיים, לשלוח את הקובץ photomask לשירות מדפסת/הדפסה והמתן שיבת photomask הפיזי.
   2. להנחות את המקרן על מנת להאיר שדה מבט מלא עם תאורה כחולה המרבי (למשל, RGB = [0, 0, 255]) באמצעות תוכנת מחשב נייד.
   3. לגזור אזור ריבית photomask סרט גדול, ואת הסרט זה ישירות אל החלק התחתון של התרבות biofilm צלחת לפני החדרת המדגם חיידקי לתאורת לילה (דמות תלת-ממד). תרבות biofilms כבעבר ולהסיר את photomask לאחר culturing, לפני הדמיה.

תוצאות

כפי שניתן לראות באיור 4A, חיידקים pDawn-Ag43 שימשו כדי ליצור biofilms בדוגמת ב לוחות פוליסטירן טוב עם תאורה מקרן (המקרן נקבע כדי להאיר תבנית מנוקדת-), עם תמונה דרך מיקרוסקופ brightfield עם קריסטל כתם סגול כמו ניגודיות הסוכן, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות באמצעות חיידקים אדום-פלורסנט-חלבון-הבעת. דוגמאות biofilm פלורסנט יכולה גם השיקוף באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית¹⁴ כדי להשיג תמונות של biofilm בתלת-ממד (איור 4B). ב- 4C איור, אנו ממחישים את המתבנת ברזולוציה גבוהה ניתן באמצעות photomask של הסרט כדי לספק תאורה בדוגמת לדגימת biofilm. לבסוף, ב איור 4D ו- 4E, נדגים דוגמאות המתבנת על זכוכית ו משטחים PDMS, וכן צ'יימברס תרבות PDMS סגור — אלה להדגים סוגים שונים של סביבות שבו ניתן להחיל pDawn-Ag43 המתבנת.

איור 1: הכנה של חיידקים pDawn-Ag43 (פרוטוקול סעיף 1). הכנת pDawn-Ag43 חיידקים מסוגלים מוסדר אור ביופילמים כרוך לטיהור pDawn-Ag43 פלסמיד ממחשב מארח שיבוט זן, והפיכתו זן e. coli עניין ויצירת מקפיא חיידקי במניה לטווח ארוך אחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הכנת הגדרת אופטי לתאורת מדגם biofilm (פרוטוקול סעיף 2). הסידור אופטי שוכן בתוך חממה חיידקי והיא מורכבת מקרן מחשב המחובר מאירה מדגם biofilm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: תרבות פרוטוקול עבור תכנים biofilms (פרוטוקול בסעיף 3). (א) לפני תאורה, pDawn-Ag43 חיידקים מוכנים לפני תכנים כאלה הם הם בצורה אמינה המושרה בשלב צמיחה נכונה. (B) לאחר לילה מואר צמיחה, ממבנה biofilm בדוגמת יהיה נוכח בחלק התחתון של המנה תרבות, יחד עם תאים פלנקטוניים בתקשורת נוזלי, והוא לאחר קצת עיבוד נוסף, biofilm מוכן עבור הדמיה. (ג) כחלופה טוב צלחות, biofilms יכול להיות תרבותי בתאי תרבות סגורה כמו חור PDMS עי. במקרה זה, מזרקים המצורפת קצה קהה מחטים יכול לשמש כדי להציג את הדוגמה של ריקון נוזלים החוצה מהחדר. (ד) כחלופה תאורה מבוססי מקרן דפוסים, תבניות גם ניתן להפיק על ידי מקליטה הסרט photomasks ישירות לתחתית biofilm תרבות צ'יימברס. במקרה זה, המקרן צריך להגדיר כדי להאיר אור כחול על פני השדה מלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: תוצאות נציג biofilms בדוגמת באמצעות pDawn-Ag43. כל התוצאות התקבלו באמצעות זן המארח MG1655 e. coli . חיידקים pDawn-Ag43 (א) שימשו כדי ליצור biofilms בדוגמת ב לוחות פוליסטירן טוב עם תאורה מקרן (המקרן נקבע כדי להאיר תבנית מנוקדת-), עם תמונה דרך מיקרוסקופ brightfield עם קריסטל ויולט הכתם כמו הסוכן ניגודיות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות באמצעות חיידקים אדום-פלורסנט-חלבון-לבטא. דוגמאות biofilm פלורסנט (B) הם עם תמונה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להשיג תמונות תלת-ממדיות של biofilm. יכול להיות בדוגמת biofilms ברזולוציה גבוהה (C) עם photomask הסרט כדי לספק תאורה בדוגמת לדגימת biofilm. יכול להיות בדוגמת Biofilms (D) על זכוכית ומשטחים PDMS. יכול להיות בדוגמת Biofilms (E) בתאי תרבות סגורה. איור זה כבר ממאמרו של העבודה הקודמת³. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הבעיה	גורמים/פתרונות פוטנציאליים
Tranforming pDawn-Ag43 לתוך המחשב המארח זן - אין מושבות	נמוך ריכוז פלסמיד - לבדוק פלסמיד התרכזות ספקטרומטר. Miniprep אופייני של pDawn-Ag43 אמור להניב לפחות 100 ng/μL; להשתמש 10-100 ng עבור שינוי
סימון/מחודשת המוסמכת תאים: תאים המוסמכת צריך שינוי יעילות לפחות 10 ^ 6 cfu/µg אומתה באמצעות פלסמיד רגיל כגון pUC19 - אם לא, תאים המוסמכת מחודשת
טעות (רמת) אנטיביוטיקה בצלחת אגר LB - הקפד להשתמש spectinomycin μg/mL 50 לבחירה
מקרן תאורה פונה כבוי / לא עקבי בין לילה	בטל את התוכנה בעייתי כגון: לילה תוכנה/OS העדכון האוטומטי, מסנן אור כחול בלילה
מקרן עשוי להיות התחממות יתר - חממה להגדיר טמפרטורה נמוכה יותר תוך מקרן מופעלת (למשל 30 ° C במקום 37 ° C) - מקרן הערה כמו מקור החום עלול להתחמם יותר מדי חממה מעבר שנקבעה מראש
להסיר מיותר מקורות הלחות במדגרה, כמו אלה עשויים להשפיע על מקרן אלקטרוניקה
לא/נמוך רמות של biofilm נוצר אחרי לילה תאורה, אין התפתחות תאים פלנקטוניים גם (קרי נוזלי ברור)	טעות (רמת) אנטיביוטיקה - הקפד להשתמש 50 spectinomycin μg/mL
. תבדוק שהכל מתווסף M63 מתכון כמו שצריך
לא/נמוך רמות של biofilm נוצר אחרי לילה תאורה, רק פלנקטוניים תאים (קרי נוזל עכור)	בדוק אור רמה, מקרן צריך להיות מאירי עיניים אור כחול-μW 50/cm ^ 2-גל nm 460
נסה לתת חיידקים לגדול זמן קצר יותר/יותר לאחר 1:1000 LB subdilution שלב לפני הוספת M63
Restreak חיידקים בצלחת ליברות, תתחיל מהמושבה טריים כדי ליצור תרבות לילה פאזה נייחת
להבטיח מקרן פועלת בעקביות בין לילה - ראה לעיל נקודה
דפוסי biofilm מטושטש, רמות גבוהות של רעש רקע	להפחית אור תועה מן מערכת תאורה אופטי, לכסות על הפנים של חממה רפלקטיבית משטחים
שקול להשתמש תאורה מובנה מבוסס photomask (להבדיל מקרן המבוססת)
בדוק מקרן כראוי ממוקד על פני השטח התחתון של תא תרבות biofilm

טבלה 1: פתרון בעיות משותף.

דיון

לאור הצורך כלי מחקר המאפשרות לבקרת מבנה biofilm, הוצגו פרוטוקול קל לשימוש עבור תכנים biofilms חיידקי באמצעות הבונה optogenetic pDawn-Ag43. בטכניקה זו, biofilms חיידקי יכול להיות שטיחות בדוגמת על סביבות משטח שונים, כולל תאי סגור, עם רזולוציה מרחבית מתחת 25 μm.

בסך הכל, פרוטוקול זה יכול להיות שבור למטה לתוך ארבעה חלקים עיקריים: (1) הכנה של חיידקים pDawn-Ag43 (2) הכנת האופטי, תרבות תצורת חומרה, (3) השלבים תאורה טרום התפתחות חיידקים, תאורה שלאחר (4) שטיפות והדמיה.

החלק הקריטי של סעיף 1 הוא הטרנספורמציה מוצלחת של pDawn-Ag43 פלסמיד לתוך המתח e. coli עניין. זה הוא הקל על ידי בידוד פלסמיד מטוהרים באיכות גבוהה, הפקת תאים המוסמכת באיכות גבוהה לשינוי (טבלה 1, פתרון בעיות).

החלק הקריטי של סעיף 2 הוא אופטימיזציה של הגדרת המקרן כך עוצמת תאורה מותאם μW/ס מ 50² -אורך הגל 460-nm, המקרן מתמקדת כראוי בגובה מדגם biofilm. שימו לב כי ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של הגדרת תאורה הפוכה לאן המקרן מאירה אור מלמטה, מעלה לכיוון המדגם biofilm. היתרון של זה היא כי האור רק צריך לנסוע דרך החלק התחתון של המנה תרבות לפני שהגיע השטח היווצרות biofilm. תאורה מלמעלה כלומר האור צריך לנסוע דרך התקשורת נוזל מעל פני השטח biofilm, אשר, במהלך הגידול, מקבל מעונן עם תאים פלנקטוניים. בנוסף לחששות אלה, חשוב גם למזער את אור תועה בקביעת אופטי ככל האפשר, לדוגמה, על ידי מכסה משטחים משקפים על הפנים של החממה – זה עוזר להשיג biofilms בדוגמת חדה יותר. בנימה הקשורות דפוסי biofilm חדה יותר ניתן להשיג באמצעות photomask כדי לשלוט המתבנת תאורה (3D איור, איור 4C). בעיות נפוצות הדורשות פתרון בעיות כוללים בעיות אמינות מקרן בטמפרטורות גבוהות יותר (למשל, 37 מעלות צלזיוס), אשר ניתן למזער על ידי המקננת הגידול biofilm בטמפרטורה נמוכה יותר (למשל, 30 מעלות צלזיוס), וכן תוכנות מחשב זה גורם עדכונים למערכת ההפעלה או אור כחול סינון במהלך לילה צמיחה (טבלה 1). חשוב גם לציין כי, בהתאם לדגם החממה והן במקרן בשימוש, זה גם אפשרי כי החום שנוצר מהמקרן תגרום טמפרטורה פנימית גבוהה יותר מאשר החממה להגדיר טמפרטורה, אשר ייתכן שיהיה צורך לתקן.

החלק הקריטי של סעיף 3 הוא קבלת דגימות בקטריאליות הדיר ואמין לפני שהם הם המושרה על ידי תאורה. מסיבה זו, מומלץ לקבל המשובטים מושבות של חיידקים pDawn-Ag43 על-ידי ומבטא אותם על צלחת אגר ולאחר מכן באמצעות השלבים תרבית נוזלית כדי להבטיח כי החיידקים מואר/המושרה בשלב הגידול האקספוננציאלי מאוחר ב הדיר אופן.

בסופו של דבר, החלק הקריטי של סעיף 4 הוא לשטוף ביסודיות, אך גם בעדינות, התאים פלנקטוניים שנותרו לאחר biofilm תכנים פרוטוקול; לכן, מומלץ לבצע מספר צעדים יש לשטוף בעדינות עם PBS.

לעומת שיטות קיימות עבור תא המתבנת^5,6, אופטי biofilm תכנים בהתבסס על pDawn-Ag43 יש מחסום נמוך יחסית של ערך לשימוש, בכך שהוא אינו מצריך מיקרו-מלאכותית, מתקני חדר, מתחם כימיה, או משטח רעלני, ובכל זאת הוא עדיין מסוגל תבנית עם הרזולוציה הגבוהה (25 μm) הקשורות בדרך כלל בטכניקות מיקרו-מלאכותית. השיטה מרחיב עבודה קודמות על חיידקי פוטוליתוגרפיה לפיקוח על ביטוי גנים¹⁷. כיום, pDawn-Ag43 פלסמיד הוא מוגבל ל- e. coli, היא משתמשת מקור מבוססי pUC שכפול, אך pDawn Ag43 הן תואמות במינים אחרים חיידקי (גראם שליליים). טכניקות גנטי זמינים עבור פוטנציאל החדרת אור מוסדר ביופילמים למינים חיידקים שונים והוא מייצג כיוון אפשרי למחקר עתידי. עוד פוטנציאל מגבלה של הטכניקה היא שהיא פועלת על ידי הגדלת ביופילמים בתוך זנים עם חלש יליד ביופילמים (למשל, MG1655 e. coli). עם זאת, זנים עם חזק ביופילמים מקורי יש צורה biofilms ללא קשר לתנאי תאורה, מסלק בדוגמת ביופילמים באמצעות pDawn-Ag43 כפי שמתואר כאן; עוד טכניקות optogenetic עדיין עשויה להתברר ישים בוויסות ביופילמים. נציין כי בהקשרים אחרים, שיטות אלטרנטיביות biofilm המתבנת עשוי להיות זמין, כגון באמצעות האפנון c-di-GMP אופטי¹⁸.

בסך הכל, המתבנת pDawn-Ag43 מבוסס יהיה מתאים לשימוש ביישומים לחקור את ההשפעה של מבנה biofilm על פונקציה¹ ו, לכן, תוכל להפיק תועלת tunable שליטה המתבנת biofilm — רלוונטית במיוחד דוגמא לסימון היא המחקר של אקולוגיה מיקרוביאלית biofilms². כיוונים לעתיד כוללות ביצוע^8,biomaterials בדוגמת⁹ ו/או קהילות חיידקי מובנית. יישומים חלופית של פרוטוקול זה נגיש כוללים גם ביו-אמנות¹⁹, נתן את הפוטנציאל האסתטי ברורה, וכן^2221,20,החינוך הפורמלי והבלתי פורמלי מדעי החיים. מנקודת מבט חינוכית, הפרוטוקול המתואר כאן משלב טכניקות רבות הרלוונטיים (התרבות חיידקי, טרנספורמציה, אופטיקה/optogenetics), והוא גם באופן מודולארי להארכה (למשל, לכלול מיקרופלואידיקה).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DH5alpha / pDawn-Ag43	Addgene	107742	זן שיבוט DH5alpha המארח פלסמיד pDawn-Ag43 - יש להעביר פלסמיד לזן E. coli המעניין לפני השימוש
MG1655 E. coli	מרכז מלאי גנטי קולי - אוניברסיטת ייל	CGSC #6300	MG1655 שימש כזן E. coli מעניין בתוצאות המייצגות של מאמר זה
ביטוי RFP פלסמיד	iGEM biobricks	J04450-pSB4K5bb	קיימות אפשרויות רבות להשגת חיידקים פלואורסצנטיים - אם משתמשים בפלסמיד, ודא שעמוד השדרה אינו מתנגש עם colE1 ori של pDawn-Ag43
ערכת מיני-הכנה של פלסמיד	Qiagen	27104
LB אבקת מרק	Affymetrix	75852	הוסף 20 גרם/ליטר למים, חיטוי, הוסף 50 μ g/mL spectinomycin כדי לקבל סטרילי LB+spec
LB אבקת אגר	Affymetrix	75851	הוסף 35 גרם/ליטר למים, חיטוי, הוסף 50 μ g/mL spectinomycin, יוצקים לצלחות פטרי כדי לקבל צלחות סטריליות LB + מפרט
צלחות פטרי	Fisherbrand	431760
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate	abcam	ab141968	הכינו מלאי 1000x 50 מ"ג/מ"ל במים, סננו לעקר ולדלל למדיה לפי הצורך
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516	מערבבים ביחס של 1:1 עם מים, מעקרים על ידי חיטוי או מסנן לקבלת 50% גליצרול
מלחי מדיה M63 תמיסת 5X	Bio-world	705729	הוסף חומצות אמינו cas, גלוקוז ו-MgSO4, הביא לריכוז מלחים 1X על ידי הוספת מים סטריליים
חומצות קסאמינו	אמרסקו	J851	הכינו מלאי של 20% במים, סננו עיקרו והוסיפו ל-M63 כתוסף (ריכוז סופי 0.1%)
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270	הכינו 20% מלאי במים, סננו עקרו והוסיפו ל-M63 כתוסף (ריכוז סופי 0.2%)
מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M7506	הכינו מלאי של 1 M במים, חיטוי והוסיפו ל-M63 כתוסף (ריכוז סופי 1 מ"מ)
סגול קריסטל	Acros organics	212120250	לדלל ל-0.1% במים לפני השימוש באמצעי
הרכבה מתקשים עצמית (Shandon immumount)	Thermo Scientific	9990402	להשתמש לשימור דגימות לטווח ארוך להדמיית פלואורסצנטיות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	Gibco	10010023	יכול גם להשתמש ב-PBS מוכן מאבקה / טבליות
6 צלחת	באר Fisherbrand	351146	משמש כצלחת תרבית ביופילם לתוצאות מייצגות
ערכת PDMS	Dow	SYLGARD 184	ניתן להשתמש לייצור חללי מיקרו-תא סגורים באמצעות ליתוגרפיה רכה
מזרק BD 1 מ"ל	מזרק BD	309659	לשימוש עם טיפול בנוזלים עם מיקרו-תאים סגורים
מחט קצה קהה	אספקת CML	901-23-050	מתחברת למזרק 1 מ"ל
קלטת מעבדה	פישרברנד	15-901	השתמש לחיבור תא תרבית לתקרת החממה
חממת חיידקים	שלדון ייצור	SMI6	ודא שהגובה הפנימי של החממה גבוה מספיק כדי למקד את המקרן בתקרה
מקרן נייד	Ivation	IV-PJ-PRO-4-1	קיימים דגמי מקרנים ניידים רבים, pDawn-Ag43 נבדק עם מספר דגמים כולל מבוסס LED/לייזר, עם ערוץ אור כחול שנע בין אורך גל מרכזי של 450-460 ננומטר
בסיס לוח אב-טיפוס אופטי	בסיס ThorLabs	MSB6	להגדרה אופטית להחזקת מקרן - הגדרות רבות אחרות אפשריות, רק צריך להחזיק את המקרן בחוזקה בתחתית החממה, מצביע כלפי מעלה
פוסט אופטי	ThorLabs	TR8	דרושים 2 עמודים - אחד להתקנה אנכית הנמשך מבסיס לוח הלחם, אחד מחובר אופקית באמצעות מהדק זווית
ישרה מהדק זווית ישרה	אופטי ThorLabs	RA90	מחבר עמודים אנכיים ואופקיים
בסיס הרכבה	ThorLabs	BA1S	מחבר בסיס לוח אב-טיפוס אופטי ועמוד אנכי
בורג 1/4 אינץ'-20	ThorLabs	SH25S050	מחבר עמוד אנכי לבסיס ההרכבה, בסיס הרכבה לבסיס לוח אב-טיפוס
1/4 אינץ'-20 בורג	סט ThorLabs	SS25E63D	מחבר עמוד אופקי למקרן באמצעות חור בורג חצובה
מד כוח אופטי	ניופורט	840	השתמש עם גלאי מד כוח למדידת עוצמת התאורה של המקרן - קיימים דגמי מד כוח רבים, שימוש באחד שיש לו גלאי הניתן להרחבה יקל על המדידה
גלאי מד כוח אופטי	ניופורט	818-UV	מתחבר למד החשמל (למעלה) - גלאי UV אינו הכרחי לחלוטין מכיוון שאור כחול נמצא בטווח הנראה
מסנן ND מתכוונן	K& F קונספט	SKU0689	מתכוונן (על ידי סיבוב) פילטר צפיפות ניטרלי - מקום מעל צמצם המקרן
תוכנת מצגת-מקרן	מיקרוסופט	פאוורפוינט	כל תוכנה המאפשרת ציור / הצגה תספיק
תוכנת CAD	Autodesk	AutoCAD	משמש לעיצוב מסכות צילום, שירותי הדפסת מסכות רבים תואמים לקבצי AutoCAD
מסיכת צילום סרט	Fineline Imaging	n/a	קיימים שירותי מדפסת מסיכות צילום רבים להדפסת מסכות צילום ברזולוציה גבוהה (>30000DPI)