הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58642

⸱

26 בינואר 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.

תקציר

הישנות סרטן זמן נחקרה על ידי אונקולוגים בעוד המנגנון המשמש כבסיס אינן ברורות. לאחרונה, אנחנו ואחרים מצאו כי תופעה בשם אפופטוזיס היפוך מוביל tumorigenicity מוגברת בדגמי תא שונים תחת גירויים שונים. מחקרים קודמים כבר התמקדו מעקב אחר תהליך זה במבחנה, אין ויוו; עם זאת, הבידוד של תאים הפוכה ממש טרם ניתן להשיג, אשר מגביל את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. כאן, אנו לנצל צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 לתאים תווית עם caspases מופעל לאחר מוות אינדוקציה. תאים עם אותות חיוביים מסודרים נוספת על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עבור שחזור. בדיקת מורפולוגיה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית מסייע לאשר את מצב אפופטוטיים להיפגע לפני FACS. עלייה tumorigenicity לעתים קרובות ניתן לייחס את העלאת באחוזים של תאי סרטן (CSC)-כמו תאים. כמו כן, לאור את הטרוגניות של סרטן השד, זיהוי המקור של תאים אלה CSC דמוי יהיה קריטי לטיפול בסרטן. לפיכך, אנו מכינים תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לפני מפעילה אפופטוזיס, לבודד תאים קספאז מופעל, ביצוע הליך היפוך אפופטוזיס. ניתוח cytometry זרימה מגלה כי תאים דמויי CSC בשד מחדש יופיעו בקבוצה הפוכה, המציין תאים דמויי CSC בשד הם transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס. לסיכום, פרוטוקול זה כולל את ניתוקה של תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע וזיהוי של שינויים באחוזים CSC בתאים הפוכה על ידי cytometry זרימה.

מבוא

סרטן כבר מובילה סיבת המוות, גורם מהווה נטל כלכלי כבד על מדינות ברחבי העולם1. סרטן השד מדרג גבוה מבחינת שכיחות ותמותה בחולים הנשי בין כל סוגי הסרטן1. בשל הטרוגניות סרטן, בשילוב של תרופות בדרך כלל משמש כימותרפיה כדי להשיג סרטן התא מוות2,3,4. עם זאת, מאז תרופות כימותרפיות נפוצים לעתים קרובות למקד דנ א5,6, חלבון סינתזה7,8 ו/או microtubule dynamics9, במהירות גוברת תאים הם מושפעים ביותר בזמן השבתה הדרגתית תאים כגון סרטן תאי גזע (CSC) s הם בדרך כלל פחות מושפעת10. CSCs הם, לפיכך, סביר יותר לשרוד לאחר הטיפול, כשבסופו מאוחר יותר עמידות לתרופות, סרטן נסיגה10,11. ומכאן, חיסול של CSCs הפך להיות נושא חשוב לטיפול בסרטן, המחקר על המקור של CSCs הוא הכרחי.

מחקרים נוספים על התופעה של אפופטוזיס היפוך בוצעו ב מהעשור האחרון12,13,14,15,16,17,18 , 19. לפני הופעתה של המושג הזה, זה נרחב התקבלה כי תאים בלתי הפיך עוברים אפופטוזיס לאחר קספאז ההפעלה. Caspases הם משפחה של אנזימים חלבונים ממלאים תפקידים מרכזיים בשלבים ייזום וביצוע של אפופטוזיס, כולל את היווצרות מוות מורכבים, את המחשוף של סובסטרטים במורד הזרם20. הפעלה של התליין caspases כגון קספאז 3 או קספאז 7 נחשב כמו "נקודת האל חזור" אפופטוזיס21. עם זאת, החוקרים לאחרונה הבחינו כי היפוך אפופטוזיס מופיעה במבחנה, ויוו, במהלך אילו תאים יכולים להתאושש אפופטוזיס גם לאחר קספאז הפעלה12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. יתר על כן, תכונות אגרסיביות כגון עמידות גבוהה יותר משרן אפופטוטיים להיפגע המקורי, invasiveness גבוהה יותר מזוהים ב סרטן הפוכה תאים15. לפיכך, הוצע כי אחוז תאים דמויי CSC יהיה גבוה יותר בקרב האוכלוסייה הפוך בהשוואה לתאי לא מטופל, בסופו של דבר לתרום התכונות מהעטלפים לאחר היפוך אפופטוזיס18.

בעבר, מאמצים רבים נעשו כדי לעקוב אחר אפופטוזיס היפוך במבחנה וחשוב יותר, אין ויוו, אשר במידה רבה לעזור המאשרת האוניברסליות של זה תהליך16,17,19. עם זאת, מחקר מערכתית על ההשלכות של תאים הפוכה לוקה בחסר בשל הבידוד משביעת רצון של תאים שעברו באמת היפוך אפופטוזיס. אין צורך לרכוש בתאים אפופטוטיים להיפגע טהור ולשחזר אותם ללימוד נוסף. לפיכך, אנו להשתמש בסמן באופן מסורתי מקובל היטב של התליין קספאז הפעלת הסמן של ה "נקודת האל חזור"21 של אפופטוזיס ולנצל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) להפלות מופעל קספאז תאים צבעונית עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7. לצבוע מקושר covalently רצף של חומצות אמיניות קצר, DEVD, אשר ניתן לזהות ביקע מאת פעיל caspases 3/7. המחשוף מסייעת לשחרור לצבוע, אשר translocate מ ציטוזול את הגרעין איפה זה נקשר ל- DNA ופולט קרינה פלואורסצנטית חזקה. נוהל זה מונע שימוש בצובר תא אוכלוסייה שבו כמה תאים עשויים לא עברו אפופטוזיס.

CSCs או תאי הגידול. מתחילה זוהו בגידולים מוצקים רבים באמצעות יחיד או שילוב של מספר marker(s) משטח ומספרים מעט מאוד של תאים אלה מספיקים כדי טופס גידולים עכברים immunodeficient22,23, 24,25,26,27. שילוב של CD44 CD24 כבר בשימוש נפוץ מחקרים השד CSC, CD44+/CD24– תאים הוגדרו השד CSCs26,27,28,29 , 30. לאחרונה, ערכנו סדרת ניסויים כדי לאשר את היחסים המוצע בין היפוך אפופטוזיס CSCs ומדגימים כי תאים סרטניים בשד הפוכה צבר מוגברת להיוות הגידול היכולת במבחנה ויוו עם אחוז גבוה של תאים עם סמנים CSC18. למרות שאנחנו לא יכול לכלול את האפשרות כי השד CSCs לשרוד טוב יותר, ובכך להשיג מועשר לאחר היפוך אפופטוזיס, חשוב, כאשר אנחנו לבודד תאים סרטניים שאינם-גזע ונושא אותם אפופטוזיס היפוך, CSC יתעוררו בגזע במקור הלא- אוכלוסיית תאים סרטן, רומז הלא-גזע סרטן תאים יכולים לתרום העלייה באחוזים של CSCs במהלך היפוך אפופטוזיס.

מאמר זה מטרתו להדגים את המעבר מתאי גזע ללא סרטן השד תאים דמויי CSC בשד לאחר היפוך אפופטוזיס, לזהות מעבר זה על-ידי cytometry זרימה. תאים שאינם-גזע סרטניים בשד מוכנים בתחילה על-ידי בידוד CD44–/CD24+ השד תאים סרטניים על ידי FACS. לאחר מכן, אפופטוזיס הוא המושרה, אושר על ידי שינויים מורפולוגיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בתאים אפופטוטיים להיפגע מתויג באופן חיובי על ידי צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 מבודדת על ידי FACS, תרבותי נוסף בהיעדר אפופטוטיים להיפגע inducers עבור היפוך אפופטוזיס. התאים הפוך ואז מוכתמים CSC סמני לאחר 7 ימים של החלמה לניתוח cytometric זרימה. תאים עם CD44+/CD24 סמנים– מחדש מופיעים באוכלוסייה הפוכה, רומז כי המעבר מתאי גזע ללא סרטן תאים דמויי CSC אירעה במהלך היפוך אפופטוזיס.

היפוך אפופטוזיס נצפתה סרטן מרובות שורות תאים, כמו גם תאים נורמליים העיקרי מטופלים עם גירויים שונים מוות חוץ גופית12,13. תהליך זה גם הוביל ב דרוזופילה דגם ויוו16,17,19. ניתן לקבל הרבה מידע לגבי המנגנון הבסיסי של relapse סרטן מודלים מחלות סרטן שונות, המקור של CSCs באמצעות הטכניקה כמתואר בכתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת השד הלא-גזע תאים סרטניים

  1. תרבות MCF-7, מד א-MB-231 בתאים 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) בקערה 100 מ מ. תרבות T47D ב- 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני RPMI 1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין, 10% חום-להשבית FBS, ו- 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין (PS) בקערה 100 מ מ. התרבות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס 5% CO2/95% אוויר תא תרבות חממה.
    הערה: פנול אדום משפיע על זיהוי מבוסס פלורסצנטיות, אבל יש גם השפעה פוטנציאלית על הצמיחה של תאים סרטניים בשד עקב שלה אפקטים דמויי אסטרוגן31. לדוגמה, פנול אדום יכול לעורר קולטני פרוגסטרון וצמיחה של תאים MCF-731. זה גם יכול להמריץ את הצמיחה של תאים T47D31.
  2. שטיפת תאים עם 2 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) פעמיים. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA MCF-7 ו מד א-MB-231 או 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתאים T47D.
    הערה: הריכוז של טריפסין-EDTA הדרושים עבור הפרדת תאים בין סוגי תאים של סרטן השד שונים משתנים בזמן ריכוז בלתי הולם עלול להשפיע על הדפוס ביטוי של כמה סימונים פני שטח התא כגון CD44 ו- CD2432.
  3. תרבות הכלים עבור 5 דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר. לעתים קרובות בדוק הניתוק של תאים מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע תאים עיכול יתר על ידי טריפסין-EDTA.
  4. כאשר למעלה מ- 90% תאים לנתק, הוסף 5 מ של בינוני RPMI הושלמה למנה ' pipette זה על פני שכבת תאים מספר פעמים.
  5. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: בדרך כלל, ניתן להשיג בסביבות 6 x 106 תאים מתוך קערה 100 מ מ confluency מגיע ל-70%.
  6. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי-106 תאים/100 μL FACS מאגר (PBS המכיל BSA 0.5% ו- 0.1% אזיד הנתרן) צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  7. לחלק את התאים מספר צינורות. עבור תאים MCF-7, לחלק את התאים צינורות 4: שני isotype שולט, אחד עבור CD24 יחיד מכתים כמו בקרה חיובית CD24 ואחד עבור צביעת כפול.
  8. עבור תאים T47D, לחלק את התאים צינורות 3: שניים עבור פקדים isotype ואחד עבור צביעת כפול.
  9. עבור תאים מד א-MB-231, לחלק את התאים צינורות 4: שני isotype שולט, אחד עבור CD44 יחיד מכתים כמו בקרה חיובית CD44 ואחד עבור צביעת כפול.
  10. צנטריפוגה הצינורות שוב ב 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, ולאחר מכן להוסיף בלוק Fc מדולל 1:50 במאגר FACS.
  11. דגירה הדגימות על קרח למשך 20 דקות בחושך לפני צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  12. להוסיף fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD44 האנושית (PerCP-Cy5.5), CD24 (PE) בבית דילולים 1:40 ו- 1:10 (במאגר FACS) בכפול מכתים קבוצות. עבור פקדים חיובית, להוסיף CD44 (PerCP-Cy5.5) כדי מד א-MB-231 ולהוסיף CD24 (PE) MCF-7 תאים על ריכוז זהה, בהתאמה.
    הערה: השילוב של CD44 וסי24 כבר בשימוש נפוץ השד CSC המחקר26,27,28,29,30.
  13. עבור קבוצות שליטה isotype, להוסיף PerCP-Cy5.5 IgG2b עכבר, κ ב- 1:40 דילול של הפקד isotype נוגדנים CD44 ו PE העכבר IgG2a, κ ב- 1:10 דילול של הפקד isotype עבור CD24 נוגדנים ב 106 תאים/100 μL.
    הערה: Isotype פקדים עבור נוגדנים עניין מומלץ כמו הפקדים שלילי33.
  14. דגירה בדגימות (מתוך שלבים 1.12 ו- 1.13) ב 4 ° C בחושך במשך 30 דקות צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
  15. לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 μL של PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  16. Resuspend בגדר ב- 0.5 מ של PBS ואת מסנן דרך רשת ניילון 40 µm לפני הפעלת ב סדרן תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית.
  17. למטרות gating ופיצויים, כתם MCF-7 תאים עם נוגדנים anti-CD24 מצומדת-PE, כתם מד א-MB-231 תאים עם נוגדנים anti-CD44 PerCP-Cy5.5-מצומדת כפקדי חיובי. להשתמש בתאים צבעונית עם פקדים isotype כפקדי שלילי (איור 1).
  18. איסוף תאים עם CD44–/CD24+ סמני צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 x 75 מ מ המכיל 1 מ"ל של אוסף בינונית (ללא פנול אדום RPMI 1640 בינוני בתוספת 20% לא פעיל חום FBS ו- 2% v/v PS). Centrifuge הצינורות 300 x g ו- RT עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
    הערה: כמו CSC תאים בתאי סרטן השד מוגדרים CD44+/CD24– תאים26,27,28,29,30והשד הלא-גזע תאים סרטניים מוגדרים CD44–/CD24+ תאים18 (איור 1).
  19. צלחת תאים שאינם-גזע סרטניים בשד ממוינים בצלחת תרבות המכיל אוסף טרי בינוני לתרבות נוספת ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 תא תרבות חממה.

2. מוות אינדוקציה וזיהוי

  1. להכין 1 מ"מ staurosporine12,34 ב דימתיל סולפוקסיד. עבור קבוצת MCF-7 שטופלו, להוסיף 25 μL של 1 מ מ staurosporine המדיום שהושלמו של תאים MCF-7 כדי להפוך עד 10 מ"ל נפח סופי (2.5 μM staurosporine) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  2. הסר את המדיום תרבות מתאי, לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם 2.5 μM staurosporine MCF-7 תאים עבור 6-אייץ ' לגרום אפופטוזיס תא צפיפות מגיע ל-70% confluency.
  3. להכין 1 מ"מ פקליטקסל35,36 ב דימתיל סולפוקסיד. עבור קבוצת T47D שטופלו, להוסיף 12.5 μL של 1 מ מ פקליטקסל המדיום שהושלמו של תאים T47D כדי לפצות נפח סופי של 10 מ"ל (5 פקליטקסל μM) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  4. הסר המדיום התרבות התאים, לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם פקליטקסל μM 5 התאים T47D עבור h 10 לגרום אפופטוזיס תא צפיפות מגיע ל-70% confluency.
    הערה: צריך להיות מוטבת אינדוקציה והזמן את ריכוז inducers זה לגרום אפופטוזיס בכל פעם שורה חדשה בתא משמשת בפעם הראשונה.
  5. עבור קבוצת MCF-7 שטופלו הממס, להוסיף 25 μL של סטרילי דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) המדיום שהושלמו של תאים MCF-7 כדי לפצות נפח סופי של 10 מ"ל (קרי, 0.25% v/v דימתיל סולפוקסיד) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  6. הסר את המדיום תרבות מתאי MCF-7 שטופלו הממס, לשטוף עם 2 מ של PBS פעם. לאחר מכן להוסיף את 10 מ"ל של מדיום עם 0.25% v/v דימתיל סולפוקסיד עבור 6-אייץ ' של הפקד ממס עבור STS.
  7. עבור קבוצת T47D שטופלו הממס, להוסיף 5 μL של דימתיל סולפוקסיד סטרילי המדיום שהושלמו של תאים T47D כדי לפצות 10 מ"ל נפח סופי (קרי, 0.05% v/v דימתיל סולפוקסיד) צינור חרוטי 15 מ"ל. פיפטה לערבב את התוכן באופן שווה.
  8. הסר את המדיום תרבות מתאי T47D שטופלו הממס, לשטוף עם 2 מ של PBS פעם. לאחר מכן, הוסף את 10 מ"ל של מדיום עם 0.05% v/v דימתיל סולפוקסיד עבור 10 h של הפקד ממס עבור פקליטקסל.
  9. כדי לבחון את שינויים מורפולוגיים של תאים שטופלו, כתם תאים עם 50 ננומטר Mitotracker אדום CMXRos ו- 250 ננוגרם למ"ל Hoechst 33342, דגירה עוד כעשרים דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר. להתבונן המורפולוגיה תא אפופטוטיים להיפגע טיפוסי תחת 60 x לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (איור 2).
    הערה: מורפולוגיה אפופטוזיס טיפוסי כולל הצטמקות תא, קרום blebbing, פיצול המיטוכונדריה גרעיני התעבות אבל עם הממברנה התאית שלם12,13,14,15 18, ,37.

3. בידוד של מוות תאים וההליך היפוך אפופטוזיס

  1. כתם הן את מוות משרן, הממס-שטופלו MCF-7 או תאים T47D עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 μM 3-ריכוז תא /mL610 בחושך למשך 30 דקות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר.
  2. לסנן את התאים דרך רשת ניילון 40 µm לפני הפעלת ב סדרן למיון.
  3. עבור gating למטרות, תחילה שער האוכלוסייה הגדולים (R1), להוציא את הלכלוך ידי הגרף נקודות עם פיזור קדימה ופיזור צד (איור 3).
  4. השתמש התאים ללא טיפול מבלי להוסיף לצבוע קספאז-3/7 ירוק זיהוי כפקד שלילי לשער האזור שלילי (R2) (איור 3 א).
  5. להשתמש בתאים שטופלו staurosporine12,18,34 במשך 24 שעות ביממה, מוכתם לצבוע כפקד חיובי לשער האזור חיובי (R3) (איור 3B).
  6. איסוף תאים חיוביים (R3) הקבוצות שטופלו משרן צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 x 75 מ מ המכיל 1 מ"ל של אוסף בינוני (כמו המדיום אוסף בשלב 1.18) (דמויות 3ג-3D). Centrifuge הצינורות 300 x g ו- RT עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  7. איסוף תאים שלילי (R2) מקבוצות שטופלו ממיס צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן 12 × 75 מ מ עם 1 מ"ל של אוסף בינוני כמו שלב 3.6 (3 דמויותה-3F).
    הערה: חלק קטן של תאים (כמו 10,000 תאים) ניתן לאסוף ולהשתמש הפעל מחדש ב סדרן כדי לבדוק את התבנית של סמן caspases פעיל. אם מעל 90% של תאים ממוינים שטופלו הממס מוצגים באזור קספאז שלילי או מעל 90% של תאים ממוינים שטופלו משרן מוצגים באזור קספאז-חיובית, תאים שנאספו אלה מאמינים כי יחסית טהורה (דמויות 3 C-3F). אחרת, באזור המיון ו/או את סדרן יש לאפס.
  8. Resuspend התאים ממוינים אוסף טרי בינוני, זרע אותם תרביות רקמה. ובכן 12 צלחות ותרבות ב 37 ° C תחת אווירה של 5% CO2/95% אוויר במשך 7 ימים עבור היפוך אפופטוזיס.

4. אישור של אפופטוזיס מופעל קספאז תאים

  1. מערבבים 10 מ מ HEPES, 140 מ מ NaCl ו- 2.5 מ"מ CaCl2 להכין מאגר מחייב annexin (pH 7.4). לאחסן המאגר ב 4 ° C ולהימנע המאגר לחשוף לאור.
  2. הכן הפתרון עובד µg/mL 100 של propidium יודיד (PI) על ידי המדללת 5 µL של 1 mg/mL PI פתרון מניות ב- 45 µL מחייב annexin המאגר. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C ולהימנע הפתרון לחשוף לאור.
    הערה: PI מוטגן פוטנציאליים, צריך להיות מטופל לטיפול.
  3. הכינו את התאים שטופלו משרן כמו צעדים 2.1-2.5.
  4. לאסוף את משרן שטופלו MCF-7 או את התאים T47D על ידי pipetting המדיום מעל השכבה תא 3-5 x כדי לנתק את התאים. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה 300 x g ו- RT עבור 5 דק. להשליך תגובת שיקוע.
  6. Resuspend התאים הושלמה בינונית-ריכוז תא /mL610 1.5 mL microcentrifuge צינור, כתם תאים עם צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 μM 3 בחושך למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  7. צנטריפוגה 300 x g ו- RT עבור 5 דק. למחוק את supernatants.
  8. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח, צנטריפוגה ב x 300 גרם וזורקים 4 ° C עבור 5 דק את supernatants.
  9. Resuspend תאי μL 100 מחייב annexin מאגר עם μL הוסף 5 של המספר המשלים annexin V ו- 1 µL של 100 µg/mL PI הפתרון עובד על כל μL 100 של השעיה תא דגירה התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: Annexin V ו- PI משמשים יחד כדי להדביק תווית בתאים אפופטוטיים להיפגע לזרום cytometry38,39,40.
  10. להוסיף 400 µL מחייב annexin מאגר, לערבב בעדינות. שומרים את הדגימות על הקרח לפני הפעלת על cytometer של זרימה.

5. מדידה של השד תאים דמויי CSC מאת Cytometry זרימה

  1. לקצור את 7-MCF הפוך בשתי הקבוצות משרן או הממס-שטופלו עם 0.05% טריפסין-EDTA. קציר תאים T47D בשתי הקבוצות משרן או הממס-שטופלו או עם 0.25% טריפסין-EDTA כמו צעדים 1.2 עד 1.5.
  2. כתם התאים עם fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD44 האנושית (PerCP-Cy5.5), CD24 (PE) כמו שלב 1.12. . בינתיים, מכינים את הפקדים isotype כמו שלב 1.13.
  3. להפעיל את התאים cytometer זרימה ולגלות את אחוז תאים עם CD44+/CD24– סמנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת לצפות את המעבר מן השד הלא-גזע תאים סרטניים לתאי CSC, כמו השד, מיון הראשון של CD44–/CD24+ תאים סרטניים בשד היו נחוצים. עבור שורת תאים MCF-7, אשר בסביבות 0.15% תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית (איור 1), שלב זה עזר לא לכלול את האפשרות של CSC העשרה במהלך היפוך אפופטוזיס. להיפך, אם היו אין תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית, כגון עבור תאים T47D (איור 1), הליך המיון יכול להיות מושמט. אכן, ga...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה ישירה וברורה לגילוי את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לתאים CSC, כמו השד כתוצאה היפוך אפופטוזיס. אישור של CSC מאפייני תאים הפוכה אלה יכול להיות בסיוע באמצעות אניחוץ גופית n mammosphere היווצרות assay, ויוו xenograft השתלת עכברים immunodeficient18,24,26 ,27,42,43,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי חדשני בטכנולוגיית קרן של חדשנות טכנולוגיה הנציבות: מימון תמיכה של המדינה מפתח מעבדה של Agrobiotechnology (CUHK), קרן מחקר Lo ביו Kwee-סאונג, קרן Hysan לי. Y.X. נתמכה על ידי studentship לתואר שני מ- CUHK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MCF-7אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC)HTB-22
MDA-MB-231אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC)HTB-26
T47Dאוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC)HTB-133
<חזק>מגיב
0.05% טריפסין-EDTAInvitrogen25300054
0.25% טריפסין-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 annexin V מצומדInvitrogenA35109
אלבומין סרום בקרUSB9048-46-8
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC-5080
CellEvent caspase-3/7 צבע פלואורסצנטי ירוקInvitrogenC10423
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'D2650
Fc בלוקMiltenyi Biotec130-059-901
סרום בקר עובריInvitrogen16000044
HEPES16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-גלוטמיןInvitrogen25030081
Mitotracker Red CMXRosInvitrogenM7512
נוגדנים חד שבטיים כנגד CD24BD Biosciencesאנושי 555428PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
נוגדנים חד שבטיים נגד CD44 BD Biosciences אנושי560531PERCP-CY5.5 שיבוט:G44-26
פריט:7230770
RRID:AB_1727485
NaClSigma-Aldrich31434
paclitaxelSigma-AldrichT7402
PE Mouse IgG2a, κ בקרת איזוטיפBD Biosciences554648שיבוט: G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen15070-063
PerCP-Cy5.5 עכבר IgG2b, κ בקרת איזוטיפBD Biosciences558304שיבוט: 27-35
RRID:AB_647257
פוספט חוצץ מלחThermo Fisher Scientific21600010
פרופידיום יודידInvitrogenP1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 בינוניInvitrogen11835055פנול נתרן אזיד ללא אדום
Sigma-AldrichS2002
staurosporineSigma-AldrichS4400
<חזק>ציוד
100 מ"מ צלחת תרביתGreiner Bio-One664160
12 בארות צלחות תרבית רקמותThermo Fisher Scientific150628
מסננת תאים 40 μ m רשת ניילוןBD Biosciences08-771-1
FACSuite חבילת תוכנה v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
FluoView FV1000 מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסIX8160X אובייקטיבי
FV10-ASW תוכנת מציג Ver.4.2bאולימפוס-פוליסטירן
עגול-תחתון 12 וזמנים; צינורות 75 מ"מBD Biosciences352003
S3e סדרןBio-Rad1451006
USB

מקורות

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015(2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357(2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685(2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע של סרטן השדציטומטריה זרימהמיון תאים מופעל פלואורסצנציהמיקרוסקופיה קונפוקליתזיהוי Caspase-3/7סממני CD44 CD24תאי סרטן שאינם תאי גזעניתוח טורמיגניות
גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.