כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס
במאמר זה
סיכום
תקציר
הישנות סרטן זמן נחקרה על ידי אונקולוגים בעוד המנגנון המשמש כבסיס אינן ברורות. לאחרונה, אנחנו ואחרים מצאו כי תופעה בשם אפופטוזיס היפוך מוביל tumorigenicity מוגברת בדגמי תא שונים תחת גירויים שונים. מחקרים קודמים כבר התמקדו מעקב אחר תהליך זה במבחנה, אין ויוו; עם זאת, הבידוד של תאים הפוכה ממש טרם ניתן להשיג, אשר מגביל את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. כאן, אנו לנצל צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 לתאים תווית עם caspases מופעל לאחר מוות אינדוקציה. תאים עם אותות חיוביים מסודרים נוספת על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עבור שחזור. בדיקת מורפולוגיה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית מסייע לאשר את מצב אפופטוטיים להיפגע לפני FACS. עלייה tumorigenicity לעתים קרובות ניתן לייחס את העלאת באחוזים של תאי סרטן (CSC)-כמו תאים. כמו כן, לאור את הטרוגניות של סרטן השד, זיהוי המקור של תאים אלה CSC דמוי יהיה קריטי לטיפול בסרטן. לפיכך, אנו מכינים תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לפני מפעילה אפופטוזיס, לבודד תאים קספאז מופעל, ביצוע הליך היפוך אפופטוזיס. ניתוח cytometry זרימה מגלה כי תאים דמויי CSC בשד מחדש יופיעו בקבוצה הפוכה, המציין תאים דמויי CSC בשד הם transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס. לסיכום, פרוטוקול זה כולל את ניתוקה של תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע וזיהוי של שינויים באחוזים CSC בתאים הפוכה על ידי cytometry זרימה.
מבוא
סרטן כבר מובילה סיבת המוות, גורם מהווה נטל כלכלי כבד על מדינות ברחבי העולם1. סרטן השד מדרג גבוה מבחינת שכיחות ותמותה בחולים הנשי בין כל סוגי הסרטן1. בשל הטרוגניות סרטן, בשילוב של תרופות בדרך כלל משמש כימותרפיה כדי להשיג סרטן התא מוות2,3,4. עם זאת, מאז תרופות כימותרפיות נפוצים לעתים קרובות למקד דנ א5,6, חלבון סינתזה7,8 ו/או microtubule dynamics9, במהירות גוברת תאים הם מושפעים ביותר בזמן השב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת השד הלא-גזע תאים סרטניים
- תרבות MCF-7, מד א-MB-231 בתאים 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) בקערה 100 מ מ. תרבות T47D ב- 10 מ"ל נטולת פנול אדום בינוני RPMI 1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין, 10% חום-להשבית FBS, ו- 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין (PS) בקערה 100 מ מ. התרבות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס 5% CO2/95% אוויר תא תרבות חממה.
הערה: פנול אדום משפיע על זיהוי מבוסס פלורסצנטיות, אבל יש גם השפעה פוטנציאלית על הצמיחה של תאים סרטניים בשד עקב שלה אפקטים דמויי אסטרוגן31. לדוגמה, פנול אדום יכול לעורר קולטני פרוגסטרון וצמיחה של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על מנת לצפות את המעבר מן השד הלא-גזע תאים סרטניים לתאי CSC, כמו השד, מיון הראשון של CD44–/CD24+ תאים סרטניים בשד היו נחוצים. עבור שורת תאים MCF-7, אשר בסביבות 0.15% תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית (איור 1), שלב זה עזר לא לכלול את האפשרות של CSC העשרה במהלך היפוך אפופטוזיס. להיפך, אם היו אין תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית, כגון עבור תאים T47D (איור 1), הליך המיון יכול להיות מושמט. אכן, ga.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה ישירה וברורה לגילוי את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לתאים CSC, כמו השד כתוצאה היפוך אפופטוזיס. אישור של CSC מאפייני תאים הפוכה אלה יכול להיות בסיוע באמצעות אניחוץ גופית n mammosphere היווצרות assay, ויוו xenograft השתלת עכברים immunodeficient18,24,26 ,27,42,43,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי חדשני בטכנולוגיית קרן של חדשנות טכנולוגיה הנציבות: מימון תמיכה של המדינה מפתח מעבדה של Agrobiotechnology (CUHK), קרן מחקר Lo ביו Kwee-סאונג, קרן Hysan לי. Y.X. נתמכה על ידי studentship לתואר שני מ- CUHK.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MCF-7 | אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | אוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC) | HTB-133 | |
| <חזק>מגיב | |||
| 0.05% טריפסין-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% טריפסין-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V מצומד | Invitrogen | A35109 | |
| אלבומין סרום בקר | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 צבע פלואורסצנטי ירוק | Invitrogen | C10423 | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | D2650 | |
| Fc בלוק | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| סרום בקר עוברי | Invitrogen | 16000044 | |
| HEPES | 16926 | ||
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| נוגדנים חד שבטיים כנגד CD24 | BD Biosciences | אנושי 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| נוגדנים חד שבטיים נגד CD44 BD Biosciences אנושי | 560531 | PERCP-CY5.5 שיבוט:G44-26 פריט:7230770 RRID:AB_1727485 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ בקרת איזוטיפ | BD Biosciences | 554648 | שיבוט: G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 עכבר IgG2b, κ בקרת איזוטיפ | BD Biosciences | 558304 | שיבוט: 27-35 RRID:AB_647257 |
| פוספט חוצץ מלח | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| פרופידיום יודיד | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 בינוני | Invitrogen | 11835055 | פנול נתרן אזיד ללא אדום |
| Sigma-Aldrich | S2002 | ||
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| <חזק>ציוד | |||
| 100 מ"מ צלחת תרבית | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12 בארות צלחות תרבית רקמות | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| מסננת תאים 40 μ m רשת ניילון | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite חבילת תוכנה v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | IX81 | 60X אובייקטיבי |
| FV10-ASW תוכנת מציג Ver.4.2b | אולימפוס-פוליסטירן | ||
| עגול-תחתון 12 וזמנים; צינורות 75 מ"מ | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e סדרן | Bio-Rad | 1451006 |
מקורות
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
