פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיסוני סרטן מוצלח יש פוטנציאל להשגת שליטה הגידול לטווח ארוך. למרות ההצלחות האחרונות קליני, נותר צורך דחוף טיפולים יעילה ובטוחה המותאמים פרופילים המערכת החיסונית גידול בודדים. וירוסים Oncolytic לאפשר את תנאי הגיוס של תגובות חיסוניות אנטי הגידול, כמו גם ביטוי גנים בעל הגבלת הגידול. פרוטוקול זה מתאר את דור לשעבר vivo וניתוח של וקטורים oncolytic immunomodulatory. התמקדות וירוסים החיסון נגד חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה, המתודולוגיה הכללית ניתן להתאים וירוס מינים אחרים, transgenes. זרימת העבודה הציג כוללת של עיצוב, שיבוט, הצלה, הפצת וירוסים רקומביננטי. מבחני לנתח שכפול קינטיקה, פעילות lytic של וקטור הפונקציונליות של immunomodulator מבודדים ex-vivo כלולים, ובכך להקל על הדור של סוכנים הרומן להמשך פיתוח במודלים פרה, ובסופו של דבר תרגום רפואי.
מבוא
Oncolytic וירוסים (OVs) מפותחים כמו הרפוי אנטי סרטניים, במיוחד לשכפל בתוך ולהרוג תאים סרטניים תוך השארת רקמות בריאה ללא פגע. זה הפך נפוץ להבין את virotherapy oncolytic (ש'), ברוב המקרים, לא להסתמך רק על פירוק הגידול מלאה על-ידי שכפול יעיל והפצת של הוירוס, אבל דורש מנגנון פעולה נוספים להצלחה בטיפול, כולל כלי הדם, סטרומה מיקוד ומעל הכל גירוי המערכת החיסונית1,2,3,4. בעוד מחקרים רבים OV מוקדם בשימוש וירוסים שלא שונתה, המחקר הנוכחי יש שהרוויח ביולוגית משופרת הבנה, וירוס biobanks המכילים פוטנציאל הרומן OVs, ואת האפשרויות המוצעות על ידי הנדסה גנטית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: [O], [P], ו [ז] להצביע על סעיפים קטנים החלים: OVs הכללי, paramyxoviruses (רוב) או MV בלבד, בהתאמה. [B] מציין סעיפים ספציפיים עבור BTE transgenes.
1 שכפול של קידוד Immunomodulator Transgenes לתוך וקטורים וירוס חצבת
-
[O] עיצוב הכנס רצף.
- [O] להחליט על immunomodulator עניין מבוסס על ספרות מחקר או על מידע כגון מסכי גנטי41 , שואבים את רצף cDNA רלוונטי המתאים מסדי נתונים כגון GenBank, הארכיון נוקלאוטיד האירופית, או ImMunoGeneTics מידע מערכת בינלאומית (IMGT).
- [O] להוסיף תכונות נוספות הרצף transgene (איור 3). רצף קוזאק הקודמת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מדגימה את מנגנון הפעולה של וירוסי חצבת oncolytic קידוד bispecific תא T engagers. תרשים זרימה המתאר את זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור2. איור 3 מראה דוגמה של גנום הוירוס חצבת oncolytic שונה. זה מספק ייצוג חזותי של השינויים מסוים מוחל על חצבת וירוס אנטי הגנום מסוים התכונות של transgenes שנוסף. Syncytia הנוצרות על-ידי וירוס חצבת טיפוסי מתוארים באיור<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Oncolytic חיסוני (כלומר., שעות נוספות בשילוב עם immunomodulation) טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפול בסרטן, בדרישה נוספת פיתוח ואופטימיזציה של וירוסים oncolytic קידוד חלבונים immunomodulatory. פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי ליצור ולאמת כזה וקטורים עבור בדיקות עוקבות הרלוונטיים במודלים פרה, תרגום קליניים עתידיים פוטנציאל הריפוי נגד סרטן.
רבים פלטפורמות וירוס oncolytic שונים עם יתרונות ברורים הם זמינים63. בנוסף ירידה לפרטים סרטן, וקטור הבטיחות, דרישות לייצור, יעילות פירוק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
Engeland לספירה מופיע בתור שותף הממציא של וירוסים RNA לגבי פטנטים עבור סרטן Immunovirotherapy בבעלות אוניברסיטת היידלברג. J.P.W. Heidbuechel אין לחשוף.
תודות
שיטות אלה הוקמו בקבוצה Virotherapy בראשות פרופסור ד ר ד ר גיא Ungerechts במרכז הלאומי למחלות הגידול בהיידלברג. . אנחנו חבים לו ואת כל חברי צוות מעבדה, במיוחד ד ר טוביאס שפק, ד ר Rūta Veinalde, ג'ודית פורסטר, בירגיט Hoyler ו ג'סיקה אלברט. עבודה זו נתמכה על ידי עוד Kröner-Fresenius-Stiftung (גרנט 2015_A78 כדי Engeland לספירה) של קרן המדע הלאומית הגרמנית (DFG, להעניק EN 1119/2-1 לספירה Engeland). J.P.W. Heidbuechel מקבל מלגה על ידי הלמהולץ הבינלאומי המדרשה לחקר הסרטן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DNA מהיר דפוס & ערכת קשירה | Roche Life Science, מנהיים, גרמניה | 4898117001 | |
| ערכת שיבוט CloneJET PCR | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה | A9539-500G | |
| QIAquick Gel Extraction | Kit QIAGEN, הילדן, גרמניה | 28704 | |
| NEB 10-beta Qualified E. coli | ניו אינגלנד ביולאבס (NEB), פרנקפורט / מיין, גרמניה | C3019I | |
| LB מדיום אחרי לנוקס | קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה | X964.1 | |
| אמפיצילין | קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, הילדן, גרמניה | 27104 | |
| אנזים הגבלה HindIII-HF | ניו אינגלנד ביולאבס (NEB), פרנקפורט / מיין, גרמניה | R3104S | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, דרמשטדט, גרמניה | 31966-021 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Biosera, בוסנס, צרפת | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, מנהיים, גרמניה | E2311 | עשוי להיות מוחלף על ידי מגיב טרנספקציה לבחירה |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה | K0129 | |
| תאי Vero | ATCC, Manassas, VA, ארה"ב | CCL81 | |
| B16-CD46 / B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ היידלברג | זמין על פי בקשה | |
| Granta-519 | DSMZ, בראונשווייג, גרמניה | ACC 342 | |
| Opti-MEM (מדיום נטול סרום) | Gibco Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה | 31985070 | |
| תא קולורימטרי ערכת כדאיות III (XTT) | PromoKine, היידלברג, גרמניה | PK-CA20-300-1000 | כולל מגיב XTT |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה | 14190-094 | |
| QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, הילדן, גרמניה | 31014 | |
| נתרן כלורי | Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | 3957.3 | |
| Imidazole | Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck , דרמשטדט, גרמניה | UFC901024 | |
| ערכת בדיקת חלבון BCA | Merck Milipore | 71285-3 | |
| IgG מסרום אנושי | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, גרמניה | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
| Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin מצומד, שיבוט MOPC-21 נוגדן | BD Biosciences, היידלברג, גרמניה | 555749 | RRID: AB_396091 |
| נוגדן נגד HA-ביוטין, שיבוט 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה | 130-042-201 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה | 130-042-303 | |
| מאגר RIPA | Rockland Immunochemicals, גילברטסוויל, פנסילבניה, ארה"ב | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית | Promega, מנהיים, גרמניה | G1780 | כולל תמיסת ליזה פי 10, תמיסת מצע (תערובת מצע ומאגר בדיקה), ותמיסת עצירה |
| מרים תאים | קורנינג, ריינוסה, מקסיקו | 3008 | |
| כלים 10 ס"מ | קורנינג, אונאונטה, ניו יורק, ארה"ב | 430167 | |
| כלים 15 ס"מ | Greiner Bio-One, פריקנהאוזן, גרמניה | 639160 | |
| צלחות 96 בארות, TPP תחתון U | , Trasadingen, שוויץ | 92097 | |
| צלחות 96 בארות, תחתית שטוחה | Neolab, היידלברג, גרמניה | 353072 | |
| צלחות 6 בארות | Neolab, היידלברג, גרמניה | 353046 | |
| צלחות 12 בארות | Neolab, היידלברג, גרמניה | 353043 | |
| צינורות 50 מ"ל | nerbe plus, Winsen / Luhe, גרמניה | 02-572-3001 | |
| צלוחיות תרבית תאים T175 Thermo | Fisher Scientific, St. לאון-ריקבון | 159910 | |
| 0.22 ומיקרו; m filters | Merck , דרמשטדט, גרמניה | SLGPM33RS |
מקורות
- Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
- Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
