מאמר שיטה

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

DOI:

10.3791/58670

⸱

29 בנובמבר 2018

 ,  , 
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.

סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות8, 9,10. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (Tagg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן12. הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד13. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זריעה של תאים

הערה: לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה ראה איור 1. רשימה מפורטת של נוגדנים וחומרים זמינים את הטבלה של חומרים.

  1. לפני זריעה של התאים, לקדוח חורים עם מקדח רגיל במסגרת שחורה 384-ובכן הדמיה assay צלחות כדי להימנע מלהיות לכוד מתחת לצלחת מאוחר יותר במהלך השלב חימום בועות אוויר. כדי להימנע חלקיקי פלסטיק כניסה הבארות במהלך שלב זה וכדי לשמור על תנאים סטריליים, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק או לכסות את הצלחת לפני קידוח בשכונה תרביות רקמה. בדרך כלל, די 3 חורים בקוטר 3.5 מ מ בכל צד של הלוח (הקצר).
  2. הכן ספסל זרימה שכבתית על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בעקבות טכניקות סטנדרטי תרביות רקמה aseptic, להסיר מדיה תא הבקבוק או צלחת. לשטוף תאים עם 5-10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל טריפסין הבקבוקון. דגירה. הבקבוק ב 37 ° C עד לנתק התאים A-431. לספור התאים או באמצעות מונה haemocytometer או תא. הכן תא השעיה של 50,000 תאים למ"ל במדיום תרבות.
  3. לוותר על 40 µL תא השעיה (ויתור צפיפות תא הסופי של 2,000 תאים לכל טוב) לתוך כל טוב של צלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או pipet רב-ערוצי, בהתאם קנה המידה של הניסוי. בקצרה להעביר את הצלחת מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.
  4. כדי למזער תופעות צלחת-קצה, לאפשר את התאים להסתפק בחלק התחתון של הלוח assay 20 דקות בטמפרטורת החדר האחורי של מכסה המנוע זרימה שכבתית. אז, במקום את הצלחת במיכל פלסטיק עם מגבות נייר לחה כדי להבטיח אווירה לח. לפני השימוש, נגב את מיכל פלסטיק עם 70% אתנול.
  5. תקופת דגירה בתיבת עם לוחית וזמינותו של 2-3 ימים-37 ° C ו- 5% CO2 ב חממה humidified המקובלת. לפקח על confluency של התאים עד 50-75%, כפי מוערך על ידי בדיקה ויזואלית עם מיקרוסקופ אור.

2. טיפול מורכבות

  1. ביום של הניסוי, תשאף האמצעי בכל טוב בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה. אם דסקית צלחת אינה זמינה, ואז הנוזל ניתן להסיר על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. כל נוזל עודף מוסר לאחר מכן על ידי שמרחתי עם מגבות נייר.
  2. להוסיף 30 µL של תרכובות מדולל לריכוז הופקעו בינוני התרבות התא באמצעות dispensing אוטומטיות או פיפטה רב-ערוצי בהתאם קנה המידה של הניסוי. מבטיחים להוסיף שלילי (דימתיל סולפוקסיד) ושליטה חיובי (ליגנד ידוע) של כמה בארות שהלוח וזמינותו. מאז זה וזמינותו shift תרמי, זה הכרחי כי ריכוז מתחם חורגת קבוע דיסוציאציה להתבונן ייצוב חלבונים. לפיכך, קו מנחה קשה ריכוז מתחם פי 50 - 100 IC50, אבל יותר פירוט תיאורי עבור ריכוזים במתחם נמצאים במקטע דיון.
    הערה: דימתיל סולפוקסיד והסבילות של הקווים התא צריך להיבדק לפני הניסוי.
  3. חותם הצלחת assay שטופלו מתחם עם צלחת לנשימה לאטום, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified במשך 30 דקות.

3. לחמם אתגר

  1. ראשית, הגדר את המים הרותחים לטמפרטורה הרצויה. שימו לב כי הטמפרטורה הסופית אליה ניתן להגיע בתוך הבארות של צלחת assay יכול להיות שונה הטמפרטורה הסופי באמבט מים. לחקור את ההיסט מראש עם מד חום דמה צלחת, צמד תרמי. זה בדרך כלל לוקח 30 דקות על האמבטיה לייצב את הטמפרטורה הרצויה.
  2. כדי לוודא כי הטמפרטורה הרצויה היא להגיע בתוך הבארות של צלחת assay במהלך השלב חימום, להכין צלחת דמה unsealed המכיל באותו אמצעי אחסון בינוני כמו הצלחת וזמינותו.
  3. הסר את הצלחות וזמינותו של החממה. . תוריד את החותם לנשימה, לאטום מחדש את הצלחת assay המכילות את התאים שטופלו מתחם ברדיד אלומיניום דבק חזק על מנת להבטיח כי אין מים לדלוף לתוך הבארות במהלך החימום עוקבות באמבט מים. ודא קדיחת חורים במסגרת צלחת נגיש.
  4. הניחו את הצלחת assay ואת את הצלחת דמה באמבט מים עם חלקו התחתון של הלוח לכיוון פני המים כדי לאלץ את כל האוויר שנותרו בחוץ מתחת הצלחות.
  5. נטר את הטמפרטורה בתוך הבארות של צלחת בובה חדשה באמצעות מדחום צמד תרמי.
  6. מחממים את הצלחת assay באמבט מים במשך 3 דקות. מיד העברה assay וצלחת טמבל אחר המים הרותחים עם מזג חדר מים להתקרר למשך 5 דקות. הצלחת assay מוכן כעת עיבוד נוסף.

4. קיבוע

  1. לוותר על µL 10 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ישירות לצלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    הערה: כמה כתות ומייצבים מסווגים מסרטנים, צריכה להיות מלווה תקנות הבטיחות מוסדיים.
  2. האחות הפתרון PFA ולשטוף את התאים עם 300 PBS µL בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה.
    הערה: הליך זה מוטבה באמצעות פרוטוקול גלישה על צלחת למכונת הכביסה בו נוזלי הוא בו זמנית בגליל, הוסר. אם הצלחת מכונת. כביסה או הליך דומה אינה זמינה, הצעד כביסה לחלופין ניתן לבצע באופן ידני.
  3. ידני שטיפה הליך: הסר את הנוזל מן הבארות על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. להוסיף µL 80 ל- PBS עם פיפטה רב-ערוצי להפוך את הצלחת שוב כמפורט לעיל, חזור על התהליך הכביסה פעמיים. לאחר שעבר כביסה, כתם את הצלחת נגד מגבות נייר נקי כדי להסיר עודפי הנוזל.

5. permeabilization

  1. הוסף 20 µL של 0.1% (v/v) NP-40 לבארות עם pipet רב-ערוצי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את התאים באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
  2. לחלופין, בעת הצורך, החל אנטיגן אחזור פרוטוקול, למשל:
    1. להוסיף µL 20 1% למען חברה דמוקרטית הבארות עם pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולשטוף לפי אותו הנוהל המתואר לעיל (שלב 4.2).
    2. מוסיפים 80 μL של גליצין 10 מ מ ב- pH 7.2, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. האחות הפתרון גליצין בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.

6. חסימת

  1. להוסיף 15 µL של 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) ב- PBS הבארות באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.

7. נוגדן ראשוני

  1. האחות הפתרון חסימה בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.
  2. להוסיף 10 µL של נוגדן ראשוני מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.

8. משני נוגדן

  1. האחות הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף הבארות לפי ההליך כמתואר לעיל (שלב 4.2).
  2. להוסיף 10 µL של אלקסה 488 נוגדנים משניים מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאטום את הצלחת החותם רדיד אלומיניום דבק כדי להגן מפני אור.
    הערה: להגן על צלחת מאור במהלך זה והשלבים הבאים.

9. גרעיני מכתים ומסיכת תא

  1. להוסיף 10 µL של גרעיני צבע מדולל עד 0.05 מ"ג/מ"ל ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.
  2. האחות של נוגדנים משניים והפתרון Hoechst ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
  3. להוסיף 10 µL של מסיכת תא מדולל כדי 200 ng/mL ב- PBS כדי הבארות באמצעות pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  4. האחות הפתרון מסכת תא ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
  5. לוותר על µL 60 ל- PBS כדי כל הבארות באמצעות צלחת למכונת הכביסה, מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק.

10. תמונה רכישה וניתוח

  1. ללכוד תמונות ב- imager תוכן גבוהה באמצעות ערוצי פלורסנט 3: דאפי (387/447), ה-GFP (472/520) ו TexasRed (562 624). רוכשים 4 תמונות לכל טוב באמצעות המטרה X 10. שימוש אוטומטי לייזר פוקוס אוטומטי ולהחיל binning 2 במהלך הרכישה. לאחסן תמונות כקובצי tiff בקנה מידה 16 סיביות, אפור יחד עם מטה-נתונים.
  2. ניתוח תמונות בעזרת תוכנה הזמינים. זיהוי גבולות התא באמצעות אלגוריתם תא מניה עם דאפי (גרעין) TexasRed (ציטופלזמה).
  3. לחלץ את העוצמה הממוצעת עבור כל אורכי הגל רכשה עבור ניתוח נתונים נוסף.
  4. לחשב את הגורם-Z כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו.
  5. לחשב מייצב % באמצעות הנוסחה הבאה: 100 * (1-(עוצמת טוב – שליטה שלילי ממוצע עוצמת טוב) / (ממוצע עוצמת אינטנסיביות שליטה-ממוצע חיובי שליטה שלילי)). הנה שליטה שלילי דימתיל סולפוקסיד והוא בקרה חיובית החומר הפניה. מאז ייצוב המרבי בין תרכובות יכול להשתנות, למעשה להיות גדול מ הפקד חיובי עבור עיקולים ITDRF, עוצמות המזערי והמרבי מייצב עבור כל המתחם משמשים לפעמים במקום ערכי העוצמה של הבארות שליטה .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המתוארים באיור 1 מתאר את זרימת העבודה הבסיסי עבור הפעלת מבחני CETSA על תאים חסיד עם זיהוי של חלבון מסיס שנותרו על ידי הדמיה תוכן גבוהה. זרימת עבודה זו ניתן להתאים בקלות בכל שלבי ההתפתחות assay על-ידי שינוי הפריסה צלחת של תרכובות או ריאגנטים14. אנחנו פירוט התוצאות הצפויות כמה צפוי להשתמש במקרים שלהלן.

זיהוי נוגדנים ופיתוח וזמינותו. תנאי הכרחי לקבלת תוצאות מוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפריע לאות assay, כפי שמוצג באיור 2C על-ידי השמטת האתגר חום הוא מעודדים. כאשר אות מופחת בנוכחות של ליגנד נצפית, פרוטוקול אחזור אנטיגן כפי שמתואר בשלב 5.2 יכול להיבדק. חימום לא אחיד של הלוחות יכול לגרום לתנודו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין גילויים לדווח.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים להכיר תשתית תמיכה מן המדע החיים מעבדה קרולינסקה Institutet. המחברים להכיר גם קלט ודיונים עם מיכאלה Vallin, מגדלנה Otrocka, תומאס Lundbäck.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Medicago09-9400-100
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013לניתוק תאים ותת-תרבות
16% פרפורמלדהיד (PFA)ThermoFisherScientific28908קיבוע
עז אנטי-ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488 נוגדן מצומדThermoFisher ScientificA11008נוגדן משני
HCS CellMask כתם אדוםThermoFisher ScientificH32712כתם ציטופלזמה
NP-40Sigma-Aldrich56741לחדירות
כתם Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261כתם גרעיני
Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM) - גלוקוז גבוהSigma-Aldrich6429רכיב מדיה של תרבית תאים
סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)Sigma-AldrichF9665רכיב מדיה של תרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיציןSigma-AldrichP4333רכיב מדיה של תרבית תאים
Corning, חותם צלחת נושםSigma-AldrichCLS3345לשלב הדגירה של קופוונד
נוגדן ארנב נגד p38 [E229]Abcamab170099נוגדן ראשוני, LOT: GR305364-16
Falcon, לוחות הדמיה תחתונים שקופים שחורים 384 בארותVWR736-2044לוחות הדמיה
Greiner, לוחות פוליפרופילן בנפח נמוך 384 בארותVWR784201
רדיד אלומיניום דביקVWR30127790
אטם אלומיניום מתקלףAgilent24210-001עבור PlateLoc
LY2228820SelleckchemS1494p38α מעכב
PH797804SelleckchemPH797804p38α מעכב
BIRB796SelleckchemS1574p38α מעכב
SB203580Tocris1202p38α מעכב
AMG 548Tocris3920p38α מעכב
RWJ 67657Tocris2999p38α מעכב
L-SkepinoneCBCS אוסףp38α מעכב
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA7030חומר חוסם
SDS (נתרן דודציל סולפט)BDH44244המשמש לאחזור אנטיגן
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898בשימוש בתאי אחזור אנטיגן
A-431 ATCCATC-CRL-1555
Echo 550Labcyteלהכנת צלחות מורכבות
אוטם צלחותAgilentPlateLoc
מתקן ריאגנטים בתפזורתThermo Scientific5840300Multidrop Combi
נוזל אוטומטי טיפולבפלטפורמת טיפול בנוזלים Agilent Bravo; משמש להכנת צלחות מורכבות
מערכת אנליזה
תרכובות מכונת כביסה צלחות Tecan אמבט מים הידרוסיד Julabo TW12 צמד תרמי VWR מדחום מעבדה הניתן למעקב מצלמת תוכן גבוה מכשירים מולקולריים ImageXpress Micro XLS Widefield תוכן גבוה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091(2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040(2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

High Content ImagingTarget EngagementCellular Thermal Shift AssayAdherent CellsCompound Target InteractionSubcellular LocalizationIsothermal Dose ResponseThermal Aggregation CurveAntibody RecognitionPlate Washer

מאמרים קשורים