הקלטות סימולטני של פוטנציאל שדה מקומי קורטיקליים ו- Electrocorticograms בתגובה לגירויים לייזר Nociceptive לנוע בחופשיות חולדות

Summary

פיתחנו שיטה רשומות בו-זמנית גם electrocorticography וגם שדה מקומי פוטנציאל בתגובה לגירויים לייזר nociceptive לנוע בחופשיות חולדות. טכניקה זו מסייעת ליצור מערכת יחסים ישירה של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, אשר מקלה על החקירה של nociceptive מידע לעיבוד במוח.

Abstract

תגובות Electrocortical, שהפיק פעימות החום לייזר שמפעילים באופן סלקטיבי nociceptive חינם עצביים, נמצאים בשימוש נרחב במחקרים רבים בעלי חיים ועל האדם לחקור עיבוד מידע nociceptive קורטיקלית. אלה פוטנציאל המוח עורר לייזר (LEPs) מורכב מספר תגובות ארעי, כי הם נעולים בזמן תחילתה של גירויים לייזר. עם זאת, המאפיינים הפונקציונליים של התגובות LEP הם עדיין אינו מודע לקיומם, עקב חוסר טכניקה דגימה בו-זמנית יכול להקליט את פעילות עצבית על פני השטח של קליפת המוח (קרי, electrocorticogram [ECoG], הקרקפת העוויתיים [הקרקפת EEG]) בתוך המוח (קרי, פוטנציאל שדה מקומי [LFP]). כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציגים כאן פרוטוקול בבעלי חיים באמצעות חולדות נעה בחופשיות. פרוטוקול זה מורכב שלושה הליכים עיקריים: (1) בעלי חיים והכנה הליכים כירורגיים, (2) הקלטה בו זמנית של ECoG ו- LFP בתגובה לגירויים לייזר nociceptive ולאחר מיצוי כוללים, ניתוח נתונים (3). באופן ספציפי, עם העזרה של מעטפת הגנה מודפס 3D, אלקטרודות ECoG והן LFP מושתל על הגולגולת של החולדה בצורה מאובטחת התקיימו ביחד. בעת איסוף הנתונים, פעימות לייזר נמסרו על forepaws של החולדה דרך פערים בחלק התחתון של התא, כאשר החיה הייתה דממה ספונטנית. רעש לבן שוטף ניגן כדי למנוע את הפעלת מערכת השמיעה סאונד שנוצרו על-ידי לייזר. כתוצאה מכך, רק nociceptive תגובות נרשמו באופן סלקטיבי. באמצעות תהליכים אנליטיים תקן (למשל, הלהקה לעבור סינון, חילוץ אפוק, ותיקון בסיסית) כדי לחלץ תגובות הקשורות גירוי המוח, השגנו תוצאות מציג כי היו LEPs עם יחס אות לרעש גבוה במקביל הקליטה של אלקטרודות ECoG ו- LFP. מתודולוגיה זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של ECoG ופעילויות LFP, אשר מספק גשר של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, ובכך להקל על החקירה של עיבוד מידע nociceptive במוח.

Introduction

EEG היא טכניקה כדי להקליט פוטנציאל חשמלי ופעילויות המוח מתנדנדות שנוצר על ידי פעילות מתואמת של אלפי נוירונים במוח. הוא משמש העממי רבים מחקרים בסיסיים, יישומים קליניים^1,2. למשל, תגובות EEG לייזר אינטנסיבי חום פולסים (קרי, LEPs) הם אימצו אותו באופן נרחב כדי לחקור היקפיים ומרכזי העיבוד של^4,nociceptive חושית קלט^3,5. בבני אדם, LEPs בעיקר מורכב deflections שלושה ייחודי: הרכיב מוקדם (N1) זה somatotopically מאורגן, סביר להניח משקפים הפעילות של קליפת המגע העיקרית (S1)⁶, את הרכיבים מאוחר (N2 ו- P2) המהווים מרכזי מבוזרת, נוטים יותר משקפים הפעילות של קליפה המגע המשני, insula, cingulate cortex הקדמי^7,8. ^9,הקודם מחקרים¹⁰, להדגים את העכברוש הזה LEPs, שנדגמו באמצעות ECoG (סוג של תוך-גולגולתי EEG) של אלקטרודות וממוקם על פני השטח החשוף של המוח, מורכב גם שלושה ייחודי deflections ( כלומר, somatotopically מאורגן N1, N2 מרכזי מבוזרת, P2). הקוטביות סדר, הטופוגרפיה של רכיבי LEP עכברוש דומים LEPs האנושי¹¹. עם זאת, בשל הרזולוציה המרחבית מוגבלת של הקרקפת EEG ו- ECoG לשטף הקלטות¹², כמו גם הטבע לא מדויק של EEG מקור טכניקות ניתוח¹³, התרומה מפורט של הפעילות העצבית לרכיבים LEP הוא הרבה ויכוח. לדוגמה, זה לא ברור אם ואת המידה שבה S1 תורמת החלק המוקדם של התגובה בקליפת המוח (N1) שהפיק לייזר גירויים⁶.

שונה מן השיטה הקלטה ב מאקרוסקופית רמה, ישירה תוך-גולגולתי הקלטות באמצעות מערכי microwire סייעו על ידי מכשיר stereotaxic microdrives^14,15 יכול למדוד פעילות עצבית (למשל, LFPs ) של אזורים מסוימים. LFPs משקפים בעיקר הסיכום של פוטנציאל postsynaptic מעכבות או סינאפסות של האוכלוסייה המקומית עצביים¹⁶. מאז שנדגמו LFP פעילות עצבית משקפים תהליכים עצביים המתרחשים בתוך מאות מיקרומטר סביב האלקטרודה הקלטה, טכניקה זו הקלטה משמש כדי לחקור את המידע לעיבוד במוח ברמת mesoscopic. עם זאת, זה רק מתמקד שינויים מקומיים מדויק של פעילות המוח, לא יכול לענות על השאלה של איך אותות אזורים מרובים משולבים (למשלאיך LEP רכיבים משולבים-אזורים במוח מרובים).

ראוי לציין כי ההקלטה סימולטני של ECoG ו LFPs קורטיקלית לנוע בחופשיות חולדות יכול להקל על החקירה של מידע קורטיקלית עיבוד בשני מאקרוסקופית ורמות mesoscopic. בנוסף, מתודולוגיה זו מהווה הזדמנות מצוינת ומדדים שאליה הפעילות העצבית של האזורים במוח מראש לתרום LEPs. ואכן, מחקרים קודמים מספר שהערכת ה קוהרנטיות בין קוצים, LFP בקליפת המוח, ואת ECoG אותות^17,18 והפגינו LFP^19,20 הסמוך האלקטרודה EEG תורמת צורה של תגובות הקשורות גירוי המוח. עם זאת, השיטה הקיימת משמש בדרך כלל כדי להקליט את המוח תגובות מחיות ומורדמת עקב חסר של מעטפת הגנה כדי למנוע את האלקטרודות להיות פגום על-ידי ההתנגשות. במילים אחרות, הטכניקה יכולה לבנות את הגשר של אותות electrocortical mesoscopic (LFP בקליפת המוח), מאקרוסקופית (EEG ו- ECoG) רמות בחופשיות העברת חולדות עדיין חסר.

כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו בטכניקה יכול להקליט ECoG ו- LFPs בקליפת המוח באזורים במוח מרובים בו זמנית מ בחופשיות העברת חולדות. טכניקה זו מסייעת ליצור את הקשר הישיר של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, ובכך להקל על החקירה של nociceptive מידע לעיבוד במוח.

Protocol

למבוגרים חולדות ספראג-Dawley זכר (שקילה 400-450 גרם) שימשו את הניסוי. כל הליכים כירורגיים וניסויים בעקבות המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר-המכון לפסיכולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים.

1. אלקטרודה השרשה

1. עזים ומתנגד החולדה בחדר עם איזופלוריין 5%, שיעור זרימת האוויר של 1 ליטר/דקה לפני הניתוח.
2. באמצעות מנגנון stereotaxic, לתקן את הראש. של העכברוש עם האף שלה להציב לתוך המסכה הרדמה. לנהל איזופלוריין דרך המסכה הרדמה-ריכוז של 2% עם שיעור זרימת האוויר של חצי ליטר/דקה כדי לשמור על העומק הרדמה במהלך הניתוח. שימו לב כי הסובלנות כירורגי מושגת כאשר העכברוש מצליח להגיב צובט את הבוהן.
3. להחיל משחה אופטלמולוגיות בעיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית.
4. לגלח העליון של הקרקפת עכברים באמצעות מכונת הגילוח סטנדרטי.
5. לעקר את הקרקפת באמצעות iodophor רפואי חיטוי פתרון ו- 75% האלכוהול כדי להסיר יוד.
6. להזריק לידוקאין (2%) לתוך הקרקפת על שיכוך כאבים מקומיים. להזריק אטרופין (0.2 mL i.p.) כדי לעכב נשימה hypersecretion.
7. עושים חתך קו האמצע של 2-3 ס מ על הקרקפת באמצעות אזמל. לחתוך להסיר את הקרקפת לאורך הקו האמצעי, לחשוף את הגולגולת. השתמש את המוסדי והחקלאי כדי לעצור את הדימום, בעת הצורך.
8. סמן את המיקומים של אלקטרודות ECoG סמך הקואורדינטות stereotaxic מוגדרים מראש (ממוקם בהתאם למיקום של Bregma) ואת המיקומים של האלקטרודות הפניה ואת הקרקע בקו האמצע (ממוקם 2 ו 4 מ"מ. הקליפה עד למדא, בהתאמה).
9. קודחים חורים (קוטר: 0.5 מ מ) עבור הברגים ECoG, באמצעות מקדחה חשמלית הגולגולת על הגולגולת באתרים מסומן, מבלי להרוס את השכבה הקשה של המוח.
10. כונן בורג פלדה אל חלד (מחוץ קוטר: 0.6 מ"מ), אשר מתחבר מצופה בידוד? חוט הנחושת, לתוך החור כ- 1 מ מ לעומק מבלי לחדור את השכבה הקשה של המוח כבסיס. הברגים הללו לשמש ECoG הפניה, אלקטרודות הקרקע במהלך הניסוי.
11. מניחים על בסיס מעטפת הגנה על הגולגולת. לתקן את הבסיס עם הברגים הסמוכים שלה על הגולגולת בעזרת שיניים אקרילי. השתמש צמר גפן רפואי יכול להסירו לאחר מכן כדי להגן על האזור המיועד לשמש להשתלה תיל עומק של להיות מכוסה.
    הערה: מעטפת מגן הוא מוצר שעוצב polylactic מודפס 3D, אשר מורכב משלושה חלקים: בסיס, קיר, כובע. הקיר מכוסה על ידי נחושת מתחדד לבנות כלוב פאראדיי.
12. מסמנים את מיקומם של האלקטרודות תיל עומק על סמך הקואורדינטות stereotaxic מוגדרים מראש.
13. לקדוח חורים קטנים (קוטר: 0.2 מ מ) על הגולגולת סביב האתרים המסומנים חוט ההשתלה, הסר בזהירות את מכסה העצם לחשוף השכבה הקשה של המוח. לשטוף את הניתוח בתדירות גבוהה, באמצעות תמיסת מלח. איור 1 מתאר את הסידור לפני ההשתלה של עומק תיל האלקטרודות.
14. באמצעות מחט, הרם, חותכים את השכבה הקשה של המוח ללא פגיעה מאטר pia של ספינות, השטח של קליפת.
15. להוריד את האלקטרודות תיל עומק השטח של קליפת והוא, ואז, לאט לאט לחדור למוח העומק היעד. לעתים קרובות עוצרים מתדרדרת האלקטרודות על חוסן נפשי קורטיקלית. במחקר הנוכחי, הוא העומק של קצה חוט 0.5 מ מ מתחת לפני השטח קורטיקלית.
16. חותם את הניתוח עם תערובת של שעווה ושמן פרפין כדי להבטיח כי ניתן להעביר האלקטרודות תיל עומק על מניפולציות ניסיוני עוקבות.
17. לתקן את המנגנון אלקטרודה באמצעות שיניים אקריליק על הגולגולת.
18. לרתך כל חוטי נחושת המחבר הבורג ECoG לערוץ המתאים על המודול מחבר. מכסים את הנקודות ריתוך באמצעות חימר כדי להימנע מכל מגע אפשרי בין ערוצים שונים.
19. להרכיב את הקיר שריון הגנה לבסיס, לרתך האלקטרודות הפניה ואת הקרקע לערוצים המתאימים.
20. לתקן את המכסה מעטפת הגנה באמצעות הקלטות כדי למנוע זיהום.
21. להחדיר את החולדה פניצילין (60,000 U, i.p.) מיד לאחר הניתוח כדי למנוע זיהומים postsurgical.
22. יחיד-בית העכברוש ב ולחות-מבוקרי טמפרטורה בכלוב, לשמור את זה במחזור יום/לילה 12 שעות אחרי הניתוח, עם אוכל ומים ad libitum למשך לפחות שבוע לפני הניסוי LEP.
    הערה: במקביל להקליט ECoG ופעילויות LFP קורטיקלית, מכשירים שימש כאן זה הורכב עם שני סוגים של אלקטרודות מקושר מודול מחבר, אשר הכיל מספר microdrives מחובר מערכי חוט של טונגסטן. סיכות זהב שימשו כדי לחבר את החוטים טונגסטן ללוח הממשק אלקטרודה (EIB) של המודול מחבר בלחיצה את החוטים לתוך חורים מתכת קטנים על EIB. שני חורים מתכת על EIB היו מולחם עם חוטי נחושת מצופה, הקצה הפתוח של כל חוט הנחושת היה מולחם עם חוט הנחושת המתאימים מחובר ECoG בורג. הפרטים של ייצור היה תיאר במקום אחר²¹.

2. איסוף נתונים

1. לדגדג את החולדה לפחות 1 x יום שלוש או יותר ימים רצופים לפני הניסוי כדי להבטיח כי החולדה מקבל מוכר הנסיין²².
2. מקם את החולדה בבית הבליעה התנהגות במשך לפחות שעה לפני הניסוי כדי להבטיח שהעכברוש acclimatizes אל סביבת הקלטה.
   הערה: התא הוא קוביית פלסטיק באורך הצד של 30 ס מ. החלק התחתון של החדר מורכב של סורגים עם פערים ~ 8 מ מ.
3. לחבר את headstage הקלטה עם מודול אלקטרודה בעדינות, כדי להימנע מפחיד את החולדה ופגיעה המודול אלקטרודה.
4. להגדיר את הגנרטור לייזר, לחבר סיבים אופטיים, להתאים את גודל ספוט הלייזר לפי המדריך של המפעיל ציוד. חבר את פלט דיגיטלי מן הגנרטור מפעיל יציאת קלט דיגיטלי של הלוח הקלטה.
   הערה: הקפידו לא תלתל סיבים אופטיים יתר על המידה כדי למנוע שבירת הסיבים. לפני הקלטה, ודא האותות על ההדק התצוגה של נרשם על ידי תוכנת הצריבה. ב פרוטוקול זה, קורן-חום גירויים הנוצרים על-ידי פרוביסקיט אלומיניום איטריום ניאודימיום אינפרא-אדום (Nd: נובח) לייזר עם אורך גל של 1.34 μm. הקוטר של גודל נקודה בלייזר נקבע כ 5 מ מ על ידי התמקדות עדשות. לייזר הוא-Ne הצביע על האזור מגורה, אשר מוגדרת בהתאם מטרת הניסוי. כמו כן, אנרגית גירוי פעימות לייזר נקבע על-פי הנבחנים. משך הדופק לייזר הוא 4 ms.
5. הגדר את מצלמת הוידאו מתחת לפינת החדר ניסיוני ברציפות להקליט את התנהגויות nociceptive של העכברוש כאשר כף היד שלה מקבל גירויים לייזר nociceptive. להתאים את המיקום ואת הכיוון של המצלמה כדי לוודא שהתנהגויות nociceptive נרשמים לחלוטין לאורך כל הניסוי.
   הערה: מצלמה מהיר תשלום מצמידים מכשיר (CCD) היא מאד מומלצת, כמו זה יכול לספק את אותות ההפעלה ללוח הראשי של מערכת הקלטה להקליט את תחילת הזמן ואת משך הפעולה nociceptive בדיוק. התנהגויות nociceptive הם מוערך על ידי הנסיין לאחר כל גירוי לייזר, בהתאם לקריטריונים שהוגדרו בעבר על סמך^23,תנועה חיה²⁴, כדלקמן: אין תנועה (ציון = 0), מושך (ובכלל זה טלטולים או היא מרוממת את הראש; ציון = 1), להירתע (קרי, גוף קטן פתאומי מקפיץ תנועה; ציון = 2), נסיגה (קרי, כפת נסיגה מן הגירוי לייזר; ציון = 3), התנועה מלקק ו לכל הגוף (ציון = 4).
6. לספק רעש לבן מתמשך (50 dB SPL) באמצעות רמקול בחלק העליון של התא.
   הערה: כפי שמוצג מחקרים קודמים^10,25, גירוי לייזר נמסר על העור מפיק סאונד שניתן לאתר על ידי מערכת השמיעה חולדה. מסיבה זו, רעש לבן מתמשך הוא שיחק לאורך כל הניסוי כדי למנוע את הפעלת מערכת השמיעה בתגובה סאונד שנוצרו על-ידי לייזר. הליך זה מאפשר את ההקלטה סלקטיבי של המוח תגובות הקשורות להפעלת מערכת nociceptive.
7. לאסוף את הנתונים אלקטרופיזיולוגיות את ECoG והן האלקטרודות תיל עומק, באמצעות מערכת הקלטה לפי המדריך של המפעיל ציוד.
   הערה: אותות ההפעלה של המצלמה וההדק אותות פעימות לייזר הן לטעום בו זמנית עם הנתונים אלקטרופיזיולוגיות באותו קצב הדגימה (כל הנתונים הם מוגבר, דיגיטציה באמצעות קצב הדגימה של 20,000 הרץ), אשר מבטיח כי כל הנתונים נמצאים מסונכרן בזמן.
8. לספק את פעימות לייזר plantar של forepaw של החולדה דרך פרצות בחלק התחתון של החדר.
   הערה: הגירוי לייזר רק מועבר כאשר העכברוש הוא ספונטני דממה עבור יותר מ 2 s המבוססת על ההתבוננות של הנסיין, כדי למזער את הזיהום אות של הממצאים הקשורות לתנועה. כדי למנוע עייפות קולטן אזעקה או רגישות עולה, המטרה של קרן הלייזר היא שנעקרו באופן ידני לאחר כל גירוי, המרווח interstimulus מעולם לא קצר יותר מאשר 40 ס ECoG ואת אותות LFP ניתן לצרוב מספר פעמים של כל עכברוש. העכברוש צריך לשים בבית הבליעה ניסיוני 1 h לפני כל הפעלה הקלטה. אחרי כל אולפן הקלטות, העכברוש היה עמוק מרדימים, perfused transcardially עם קרח באגירה פוספט תמיסת ואחריו 4% paraformaldehyde. המוח היה להסיר את הגולגולת, למחלקה לזהות את העמדות אלקטרודה.

3. ניתוח נתונים

1. סנן את הנתונים רציפה עם מסנן הלהקה מעברים בין 1 ל- 30 הרץ.
2. אפוק נתונים באמצעות חלון ניתוח של 3 s, מורחב 1 s לפני 2 s לאחר תחילתה של גירויים לייזר. תיקון בסיסית מתבצע על ידי הפחתה של משרעת רשע בתוך מרווח הזמן prestimulus.
3. באופן ידני דוחים שהשרתים זה שזוהמו על ידי חפצים ברוטו.
4. חשב את ואת LEP בממוצע כי הם נעולים בזמן תחילתה של גירויים לייזר עבור כל תנאי הניסוי.
5. חשב שה קוהרנטיות המרה אדוה (WTC) של LEP ואת הקליט מ ECoGs ועומק תיל אלקטרודות.
   הערה: WTC היא טכניקה לביצוע ה קוהרנטיות בין זוגות אלקטרודות כפונקציה של זמן ותדר. ניתן לחשב WTC בין שני אותות בכל נקודת זמן-תדר, אשר יש את היתרון של יצירת ערכים קוהרנטית כל קשת זמן-תדר. היה הפרטים של המתודולוגיה המתוארת במקום²⁶.

Results

בניסוי נציג, נרשמו הנתונים אלקטרופיזיולוגיות מכל חמישה חולדות. הגירויים לייזר נמסרו את forepaw נכון של כל עכברוש בשביל 20 פעמים עם > 40 s במרווחים interstimulus. המוח לייזר-עורר תגובות נרשמו באמצעות ברגים ECoG ואת עומק חוטים וגם את החוטים עומק היו מושתלים דו צדדיים cortices המגע הראשי (S1), מנוע ראשי cortices (M1).

כפי שסוכם באיור1, שני ECoGs (מסומן בשחור) ועומק תיל אלקטרודות (מסומן בצבע, 5 חוטים...

Discussion

במחקר הנוכחי, אנו המתואר טכניקה במקביל להקליט ECoGs ותגובות LFP קורטיקלית שהפיק לייזר nociceptive גירויים לנוע בחופשיות חולדות. התוצאות הראו כי LEP תגובות יכול להיות בבירור זוהה לאחר תחילתה של גירויים לייזר ב- ECoG והן LFP אותות. הקלטה בו זמנית של ECoG ואת אותות LFP קורטיקלית תאפשר למדענים לחקור את מערכת היחסים שלהם עבור יותר הבנת התרומה של הפעילות העצבית לרכיבים LEP.

ראוי לציין חמישה שלבים קריטיים בשיטה המוצעת. ראשית, חשוב לוודא כי המשטח של הגולגולת הוא נקי ויבש לפני תיקון המעטפת מגן הבסיס על...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
זכר Sprague-Drawley חולדות	Vital River
Isoflurane	RWD Life Science
מערכת הרדמה איזופלורן לבעלי חיים קטנים	RWD מדעי		כולל מסכת גז הרדמה לחולדות
מכשיר סטריאוטקסי	RWD מדעי
החיים המכשיר עם אלקטרודות			משולבות ECoG ו-LFPהמנגנון תוצרת בית, המרכיב את אלקטרודות ה-ECoG וחוט העומק למודול מחבר
		מגן מודפסת בתלת מימד	מרקם המעטפת הוא פולילקטי, והמעטפת תוצרת בית ומכילה שלושה חלקים: בסיס, קיר וכובע. הקיר מכוסה במתחדדי נחושת לבנייה ככלוב פאראדיי
חוטי טונגסטן (קוטר: 50 מ"מ)חברת		California Fine Wires	האלקטרודות להקלטת LFP קליפת המוח
ברגי נירוסטה (קוטר: 0.6 מ"מ)			האלקטרודות להקלטת ECoG
מקדחת גולגולת חשמלית	RWD Life Science
מקדח (קוטר: 0.5 מ"מ)	RWD מדעי		החיים המקדחה משמשת לקידוח החורים של ברגי ECoG
מקדח (קוטר: 0.2 מ"מ)	RWD מדעי		החיים המקדחה משמשת לקידוח חורים של חוטי עומק
אבקת אריליק דנטלית	SNC שיניים
נוזל ארילי דנטלי	דנטלי
	פישר סיינטיפיק		התערובת משמשת לאיטום הגולגולת כדי להבטיח את התנועה הבאה של מערכי מיקרו-חוטים
שמן מינרלי	פישר סיינטיפיק
אלקטרו-קואגולטור	Bovie Medical Corporation
RHD2132 לוחות מגברים	Intan Technologies		במה ראשית של 32 ערוצים
RHD2000 מערכת	Intan Technologies		מערכת רכישת הנתונים
מחולל לייזר אינפרא אדום ניאודימיום איטריום אלומיניום פרובסקיט (Nd:YAP)	הנדסת אלקטרוניקה
Matlab R2016b	The MathWorks