מאמר שיטה

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58751

⸱

4 בינואר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Anesthesiology Department, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2Scientific Research Center, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק phagocytosis שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia coli.

תקציר

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה לשחזור כדי לבצע וזמינותו של phagocytosis. החלק הראשון של שיטה זו כרוכה בניין וקטור pET-סומו-EGFP (סומו = צירוף קטן דמוי אוביקוויטין) לבטא משופרת חלבון פלורסצנטיות ירוק (EGFP) ב- Escherichia coli (BL21DE). ביטוי EGFP e. coli הוא coincubated עם מקרופאגים עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; קבוצת הביקורת השלילית מודגרת בקרח עבור אותה כמות של זמן. . אז, המקרופאגים מוכנים להערכה. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הצעדים שלו פשוט וברור, phagocytosis נמדד על ידי שני זרימה cytometer, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. הבעת-EGFP e. coli יציבים ולהציג אות פלורסצנטיות חזק גם לאחר המקרופאגים קבועים עם paraformaldehyde. שיטה זו היא לא רק מתאים ההערכה של קווי macrophage התא או מקרופאגים הראשית in vitro לקשרי אבל מתאים גם הערכת phagocytosis גרנולוציט, מונוציט בתאי תאי דם היקפיים. התוצאות מציגות כי היכולת phagocytic של מקרופאגים הצפק של עכברים צעירים (8-בת שבוע) הוא גבוה מזה של מקרופאגים מ בגילאי עכברים (חודש בן 16). לסיכום, שיטה זו מודדת מקרופאג phagocytosis ומתאים ללמוד את פונקציית מערכת החיסון המולדת.

מבוא

מקרופאג phagocytosis מבחני משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את תפקוד מערכת החיסון המולדת. התגובה החיסונית מולדת עשוי להצביע על הרגישות לזיהום. קווי macrophage התא נמצאים בשימוש נרחב במחקרים אימונולוגיה. אולם, מעבר מורחב עלול לגרום אובדן הגן, נחשף פונקציות החיסונית בשורות תאים אלו. כך, המקרופאגים הצפק העיקרי הם האובייקט האידיאלי שבו ללמוד את תפקוד התא1.

למרות התגובה החיסונית מולדת נחשב להיות שלמים בגוף בגילאי, היכולת phagocytic עשויה להקטין בהשוואה לכי בהצעיר הגוף2,3. כאן, אנו נדגים שיטה כדי להעריך את phagocytosis של מקרופאגים הצפק יאנג (8-בת שבוע) ועכבר יישון (חודש בן 16) באמצעות הבעת EGFP e. coli, וזה נוח, מהיר, כדאיות כלכלית.

השימוש של זן לבטא EGFP e. coli הוא אחד היתרונות של זה וזמינותו כי חיידקים אלה יציבים ולהציג אות חזק פלורסצנטיות, גם לאחר מקרופאגים נפתרות על-ידי paraformaldehyde 4% (w/v). בנוסף, באמצעות הבעת EGFP e. coli, החוקרים לא צריך מכתים נוסף לאחר phagocytosis, אשר חוסך זמן. יתר על כן, המקרופאגים הם immunoresponsive עבור e. coli האנטיגנים, עושה e. coli יותר מתאים וזמינותו phagocytosis מאשר את הבעת-EGFP פטריות או חרוזים התווית על-ידי fluorescein.

עם הבעת EGFP e. coli, וזמינותו phagocytosis יכול להיות בקלות הושלמה ב 2 h, נמדדת בשני לזרום cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, בהתאם למטרה של החוקר. מאז בשיטה זו ישירות מודד את היכולת phagocytic, התוצאות הן יותר לשחזור מאשר שיטות עקיפות אחרות.

שיטה זו אומתה גם בקו תא RAW264.7, דם היקפיים אנושי תאי תאי4. הטקסט שלהלן מספקת את הוראות מפורטות לביצוע הזה assay, מדגיש את השלבים הקריטיים החוקרים שעשויה לשנות כדי לענות על הצרכים של הניסויים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים היו מבוצעים תחת מוסדות לאומיים של בריאות הנחיות טיפול, שימוש של חיות מעבדה, הפרוטוקולים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של דאליאן האוניברסיטה הרפואית. 16 בן חודש (עם משקל הגוף של 30-35 גר'), בת שבוע-שמונה עכברים C57BL/6 (ספציפי פתוגן-חינם) גברים (20-25 גרם) SPF התקבלו ממרכז SPF בעלי חיים דאליין הרפואי האוניברסיטאי. עכברים כל הוחזקו בעלי חיים הדיור עם גישה כדי מים ואוכל ad libitum. הטמפרטורה היתה שמרו ב 20-24 מעלות צלזיוס, הלחות הייתה 40% - 70%, והיה תאורה 12 שעות אור/12 h כהה. חיות הורשו להסתגלות לסביבה לפחות 7 ימים לפני הניסוי.

1. בנייה של pET-סומו-EGFP פלסמיד, אינדוקציה של הביטוי EGFP

  1. לסנתז השבר ג'ין EGFP (רצף bp 717 מסונתז על ידי שירות סינתזה הגן מותאם אישית, ראה טבלה של חומרים , 1 קובץ משלים את הרצף) ומגבירים את השבר עם (פריימר לפנים 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') ולהפוך פריימר (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3 "), באמצעות אמינות גבוהה Taq DNA פולימראז.
  2. כדי לוודא המוצרים (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז יש אדנין המסוכך יחידה 3' עבור השיבוט ת א בשלב הבא, השתמש סיומת 30 דקות ב-72 מעלות לאחר האחרון מחזור (ראו 1 קובץ משלים PCR תנאים). בדוק את המוצר PCR על ידי agarose בג'ל.
  3. לשכפל את המוצר PCR לתוך הווקטור pET-סומו (ראה טבלה של חומרים) באמצעות לצבא שיבוט בשיטה5 עם T4 DNA ליגאז. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) במשך 30 דקות. וקטור הוא לליניארית בין נוקלאוטידים 653, 654 עם יונקות bp 1 T-החריגה על גדיל אחד.
  4. להפוך את המוצר מצדו המתח BL21(DE) e. coli כשיר מבחינה כימית כדלקמן: להוסיף 5 µL (100 ng) של מוצר ה-PCR µL 100 BL21(DE) תאים המוסמכת באמצעות הלם החום 42 ° C עבור 90 s; לשמור את התערובת על קרח למשך 3 דקות, ולאחר מכן, להוסיף µL 400 של מדיום מרק (ליברות) lysogeny טרופה ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת זה h 1 ב 37 ° C ו- 120 סל ד.
  5. לחסן µL 100 של החיידקים על פני צלחת (100 µg/mL) LB-kanamycin עם לקטוז משרן (0.5 mmol/L), מניב המתח ביטוי EGFP. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: אם EGFP בהצלחה מתבטא, ניתן לראות כמה מושבות כאור ירוק זוהר בחושך.
    1. לחילופין, בחר המושבות כדי לוודא השבר EGFP שנוסף על-ידי רצפי DNA. צבעי יסוד רצפי DNA הם: קדימה, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; הפוך, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
  6. לחסן מושבה חיובי לתוך מ ל LB בינוני עם 100 kanamycin µg/mL. דגירה של 37 ° C רועד חממה-120 סל ד כבר שעתיים, להוסיף את לקטוז משרן ריכוז סופי של 0.5 mmol/L ואז להמשיך ללחוץ על 6 שעות, גרימת ביטוי EGFP. מדעית, כאשר במשך 6 שעות, הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) עשוי להגיע 0.7 ומעלה.
  7. להוסיף 10 µL של המדיום התרבות חיידקי לשקופית, לכסות את זה coverslip, לבחון את הביטוי של EGFP תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה. החיידק לבטא EGFP יכול להיות מאוחסן המדיום ב 2-8 ° C למשך מספר שבועות.

2. עכבר מקרופאג הצפק בידוד ותרבות ראשי

  1. מוסיפים 3.5 g של thioglycolate 100 מ של מים מזוקקים, החיטוי התערובת עד עקרות לפני השימוש. משאבה המדיום thioglycolate לתוך 1 מ"ל סטרילי המזרק בשכונה להזרקה הצפק העכבר. השתמש עכבר אחד לאדם מזרק כדי למנוע זיהום. השימוש thioglycolate יכול להגדיל את המספר של מקרופאגים. המקרופאגים הצפק תושב ניתן לבודד ללא thioglycolate אבל עם התחתון מקרופאג התשואות.
  2. עזים ומתנגד העכבר באמצעות שיטה שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מקומיים ועל שימוש הוועדה. להזריק 1 מ"ל של 3.5% thioglycolate מדיום לתוך חלל הצפק של העכבר עם המזרק 1 מ"ל, באמצעות מחט 23 גרם.
    הערה: על ידי גרימת הרדמה, הזריקה הצפק ניתן בקלות לבצע ומפחיתה את הסיכון מפציעות לאיברים הפנימיים הנגרמת על ידי הזרקה.
  3. לשמור את העכבר עם מים ומזון ad libitum במשך 3 ימים. לנטר צריכת במשקל ואוכל את הגוף של בעל החיים כל יום. אם הירידה במשקל גוף גדול מ-10% בתוך 3 ימים, אל תכלול את החיה הניסוי.
  4. לאחר 3 ימים, המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר במהירות וגורם הרדמה על ידי sevoflurane בתוך קופסא סגורה. לחלופין, השתמש בשיטה זאת אושרה על ידי בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה המקומית לצורך המתת חסד של העכבר.
  5. לשים את העכבר לתוך תבשיל (בקוטר 10 ס מ) עם 75% אתנול לחטא, להעביר אותו במהירות מכסה המנוע. הנח את העכבר על צלחת ולהדק את כפה קדמית ללוח לתקן את המיקום של העכבר.
  6. באמצעות מזרק 5 מ ל המצורפת של 20 גרם המחט, הצבת המסגרת המשופעת המחט למעלה בזווית של 30° - 40 מעלות, להזריק 5 מ"ל של קור (4-10 ° C) באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) בחלק התחתון של הבטן לתוך חלל הצפק של העכבר, הימנעות ניקב את המעי. אם המעי הגס (או כל איבר אחר) נוקב, העכבר ולתאי יכול עוד לשמש לניסויים, זה יכול להפעיל את התאים שאינם מתאימים לתרבות התא הראשי.
  7. לבצע עיסוי עדין על שני הצדדים של הבטן של העכבר. לאחר מכן, וארוקן את הנוזלים ובאיטיות. לוותר על הנוזל הצפק לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. חזור על שלבים אלה 2 x או 3 x.
  8. Centrifuge התאים על תנאי למשך 10 דקות ב x 400 g ומפרידה בקירור (4-8 ° C). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא RPMI 1640 בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS). לספור את התאים. מדעית, צפיפות התאים שווה כ 5 x 106 תאים למ"ל כאשר התאים הם resuspended ב- 10 מ"ל של מדיום.
  9. להוסיף 5 x 106 תאים לתוך כל טוב של צלחת 6-ובכן assay cytometry זרימה, 5 x 105 תאים לכל טוב לתוך צלחת 24-ובכן למיקרוסקופ זריחה. התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% בין לילה. ניתן לרענן את המדיום תרבות לאחר 3 h כדי להסיר תאים nonadherent כי רוב אלה הם לימפוציטים. התאים חסיד הן בעיקר המקרופאגים, הם יכולים לדבוק היטב פלסטיק רקמות-תרבות-מטופלים.

3. מקרופאג phagocytosis assay באמצעות המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

  1. לבחון את התאים במיקרוסקופ שדה בהיר להערכת הכדאיות תא וצפיפות התאים.
  2. הסר את המדיום תרבות הצלחת 24-. טוב. להוסיף 100 µL טריים תרבות בינוני 10 µL של חיידקי השעיה (כ 2 x 107 תאים) כל טוב כפי שמתואר בטבלה 1. תקופת דגירה של 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.
  3. לשטוף בעדינות 3 x x-5 עם µL 500 ל- PBS קר לכל טוב לשטוף חיידקים noninternalized.
  4. דגירה התאים עם 4% פורמלדהיד ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. לשטוף את התאים קבוע 3 x עם PBS (500 µL טוב).
  6. להוסיף 200 µL של זריחה phalloidin 633 לצבוע את הפתרון עובד מצומדת (ראה טבלה של חומרים) כדי להכתים את F-אקטין. חנות במקום חשוך ולח (60% - 80%) בטמפרטורת החדר במשך 60 דק לשטוף את התאים 3 x עם PBS (500 µL/טוב) כדי להסיר את כל phalloidin עודף. על ידי צביעת F-אקטין, הציטופלסמה יכול להיות המתוארים ולעזור כדי להבחין בין החיידק למביטה.
  7. להוסיף 200 µL של הפתרון עובד דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (µg 1/mL) כתם גרעין התא, תקופת דגירה של 5 דקות במקום חשוך ולח בטמפרטורת החדר. לשטוף 1 x עם PBS (500 µL טוב) ו x 1 באותו אמצעי אחסון של מים מזוקקים. לאחר מכן, התאים יהיה מוכן להסתכלות תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

4. מקרופאג phagocytosis assay באמצעות cytometry זרימה

  1. כדי לצמצם את השגיאות ניסיוני, לעשות פרשנות נכונה של התוצאות, להגדיר את הקבוצות ולשלוט צינורות עבור הניסוי כמפורט בטבלה מס ' 2.
    1. עבור קבוצת בקרה, אשר ימוקמו על קרח (קבוצה 4 בטבלה מס ' 2), להסיר את המדיום מהצלחת 6-ובכן, לשטוף אותו x 1 עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של EDTA קר 70 מ"מ לתוך הבאר כדי לנתק את התאים ומעבירים אותם אל הצינור cytometry זרימה. להוסיף 50 µL של השעיה חיידקיים לתוך הצינור ומניחים אותו על קרח לשעה.
    2. קבוצות אחרות, להסיר את המדיום תרבות. להוסיף 1 מ"ל בינוני טריים כל טוב. להוסיף 50 µL של חיידקי השעיה לתוך הבארות בהתאם להגדרת קבוצה, כפי שמתואר בטבלה מס ' 2. אז, במקום את הצלחת. ובכן 6 c ° 37, 5% CO2 מגשים עבור 1 h.
  2. כדי להרוות את זריחה של noninternalized e. coli, להוסיף 200 µL של 0.8% קריסטל ויולט (CV) מים פתרון לתוך הבאר, להשפיע תוך זמן קצר, וכך להימנע תוצאות חיוביות שגויות על-ידי האיגוד לבטא EGFP e. coli אל פני השטח של מקרופאגים אבל לא הפנימו. לשטוף את התאים 3 x עם PBS כדי להסיר את כל קורות חיים שיורית.
  3. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של EDTA קר 70 מ"מ לתוך הבאר כדי לנתק את התאים ומעבירים אותם אל הצינור cytometry זרימה.
  4. Centrifuge הצינורות ב x 400 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 100 µL ל- PBS כדי resuspend את התאים. להוסיף 5 µL של נוגדן F4/80-PE-מצומדת (אנטיגן פני הביע על העכבר macrophages) לתוך צינורות, או isotype לשימוש IgG2a-PE, בהתאם להגדרת קבוצה. מערבולת בקצרה דגירה בדגימות על קרח למשך 5-10 דקות בחושך.
  6. להוסיף 1 מ"ל של PBS לתוך כל שפופרת וזורקים צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דק את תגובת שיקוע. Resuspend כדורי תא עם 200-300 µL ל- PBS לניתוח cytometry זרימה. הפעל כל שפופרת של נתוני לאירועים לפחות 10,000 תאים F4/80+ .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הווקטור pET-סומו מנצל צירוף אוביקוויטין דמויי קטנים כדי לאפשר הביטוי של חלבונים מקורית e. coli. סומו פיוז'ן יכול לשפר באופן משמעותי את המסיסות EGFP, ומאפשרת לזהות בקלות. אם הביטוי EGFP בהצלחה הנגרמת על ידי לקטוז, מושבות ירוק יכול להיות שנצפו בחושך (איור 1 א'). נקודות ירוקות, אשר מייצגים את הבעת-EGFP e. coli, יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות משתמשים בעדשה המטרה 40 x (איור 1B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים של פרוטוקול זה הם די פשוטה וישירה. אחד השלבים הקריטיים הוא לגרום EGFP ביטוי ב e. coli. בדרך כלל, כאשר הגן של פרוקריוטים, כמו EGFP, מתוכנן לבטא באופן אאוקריוטים כמו e. coli, יש סיכון כי החלבון טופס לא פעיל אגרגטים (הכללה גופים), אשר משנה את הפעילות ומבנה מקורית של החלבון. באמצעות וקטור pET-סומו ו בניית את פלסמיד pET-סומו-EGFP, החלבון פיוז'ן EGFP-סומו הביע בהצלחה, האות האור היה חזק מספיק שהוא זוהה על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות והן cytometer של זרימה.

השלב הקריטי השני נועד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31800046) את מדעי הטבע קרן של ליאונינג (מספר 20170540262) תמיכה עבודה זו. העבודה הזו הושלמה במעבדות של המרכז לחקר מדעי באוניברסיטה השני בבית החולים של דאליאן רפואי. המחברים רוצה להודות שאו-לין סאנג עבור שלה בסיוע cytometry זרימה, ואת Qu בו יאנג דונג-צ'ואן לסיוע שלהם בהפקת הוידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BD FACSCanto II ציטומטר זרימהBD Biosciences-ביוטין
אנטי עכבר CD16/32 נוגדןBiolegendCat101303
אלוף pET SUMO מערכת ביטוי חלבוןInvitrogenK300-01
שירות סינתזת גנים מותאם אישיתTakara Biotech.-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisherD1306
F4/80-PE נוגדן נגד עכבר עבור FACSBiolegendCat123110
Leica DMI3000 B  מיקרוסקופ הפוךLeica Microsystems-PE
Rat IgG2a, κ-בקרת איזוטיפBiolegendCat400507
Phalloidin 633 תמיסת עבודה מצומדת צבע פלואורסצנטיAAT BioquestCat23125
מדיום תיוגליקולטסיגמא-אולדריץ'T9032

מקורות

  1. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
  2. Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
  3. Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
  4. Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
  5. Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
  6. Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
  7. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
  8. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  9. Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
  10. Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
  11. Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Escherichia Coli EGFPEGFPQuenchingF4 80

מאמרים קשורים