פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור
במאמר זה
סיכום
תקציר
HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה "הלם ולהרוג" נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.
מבוא
למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5' מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: נהלי שכפול, שינוי, רצף הם דנו במקום18,19. הפרוטוקולים בזאת מתחילים מ תקנים של הווקטורים בתרבית של הביטוי (איור 3).
1. תרביות תאים תאים HEK293T עם כתבת צבע כפול לבנות
- לטפח HEK293T תאים הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 μg/מ"ל) בחממה2 CO 5% ב 37 º C. לאחר מפשיר, מעבר תאים HEK293T 2 - 3 פעמים לפני השימוש בהם תקנים ניסויים. זה ייתן את הזמן תאים כדי להתאושש מההליך שהביקושים.
התראה: Mycoplasma זיהום של תרביות תאים נשא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נציג התוצאות מוצגות באיור 5 עבור הביטוי של HIV-1 unspliced (EGFP), משולבים המוצרים (DsRed) בעקבות טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1. הן JQ1(+) והן בלשכת המידע לתיירים הגדילה משמעותית את אחוז התאים לבטא EGFP (FC 2.18 ו 4.13 מעל דימתיל סולפוקסיד בהתאמה; n = 3) מעידה על תעתיקים unspliced. יתר על כן, JQ1(+) גדל באופן משמעותי את אחוז התאים לבטא DsRed (46.6 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) כמו גם היחס משולבים המוצר (7.37 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) לרמה דומה מידה (FC 59.6 ו 5.83.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O'Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכשר וירוסים22. המודל התנאים הפיזיולוגיים של HIV השהיה ב נח CD4 + T תאים, מערכות כתב פלורסנט כפול התפתח כמו הכתבת RGH (אדום-ירוק-HIV) שפותחה על ידי הקבוצה של איוון סדוסקי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג'ני ל' אנדרסון ולי י' מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <תרבית תאים חזקה> | |||
| HEK293T (תאי כליה עובריים אנושיים) | ATCC | CRL-3216 | משכפל וקטורים הנושאים את אזור השכפול SV40. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז + 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10099-141 | מקור אוסטרליה |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Sigma | P4458 | |
| תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום | Gibco | 14190-136 | |
| כתם כחול טריפאן, 0.4% | גיבקו | 15250 | |
| טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום | גיבקו | 25300054 | |
| ליפופקטמין 2000 | Invitrogen | 11668-019 | מגיב טרנספקציה ליפידים |
| Opti-MEM I (1x) סרום מופחת בינוני | Gibco | 31985-070 | בינוני ללא סרום |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 פלסמיד | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | ביטוי של EGFP בתאי יונקים, מקדם CMVIE. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa)632429 | ביטוי של DsRed-Express בתאי יונקים, מקדם CMVIE. | |
| pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 1 μ M |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 1 μ M |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | מלאי ב-100 μ גרם/מ"ל ב-DMSO; ריכוז עבודה 10 ננומטר |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | מלאי ב-1 μ g/μ L ב-PBS; ריכוז עבודה 10 μ גר'/מ"ל |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 0.5 μ M |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 30 ננומטר |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, מבוסס PCR |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow Cytometer (4 לייזרים-כחול, אדום, סגול וצהוב) | |
| LSR II | BD Biosciences | ציטומטר זרימה (3 לייזרים-כחול, אדום וסגול) | |
| LIVE / DEAD ניתן לתיקון קרוב ל- IR מת ערכת כתמי תאים | Life Technologies | L34976 | צבע כדאיות: לעירור של 633 או 635 ננומטר, 400 בדיקות. רכיב A ו-B מסופקים שניהם בערכה. |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| תמיסת פורמלדהיד 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS& T מחקר חרוזים | BD Biosciences | 655050 | חרוזי כיול |
| Sphero קשת חלקיקי כיול (8 פסגות) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 מ"מ |
| תמיסת נדן | Chem-Supply | SA046 | 90 גרם NaCl ב 10 ליטר מים |
| HAZ-כרטיסיות | אורח רפואי | H8801 | טבליות שחרור כלור לחיטוי |
| דקון 90 | Decon Laboratories Limited | N / A | חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. פתרון עבודה Decon 90 5%. |
| נתרן היפוכלוריט (תמיסה של 12-13%) | Labco | SODHYPO-5L | חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. תמיסת עבודה אקונומיקה 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. פתרון עבודה 7x 1%. |
| <חזק>שם< | חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>חומרים | |||
| צלוחיות תרבית רקמות (75 ס"מ2, צוואר משומר, כובע מאוורר) | קורנינג | 430641U | |
| צלחות תרבית רקמות (96 תחתית שטוחה היטב עם מכסה) | Costar | 3599 | |
| צלחות תרבית רקמות (96 באר V-bottom ללא מכסה) | Costar | 3896 | |
| צינורות צנטריפוגה (10 מ"ל) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 מ"מ |
| צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל) | CellStar | 227261 | 30x115 מ"מ |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| סרולוגי פיפטה סטרילית (25 מ"ל), | סטרילית קורנינג | CLS4489-200EA | |
| (10 מ"ל), | קורנינג | CLS4488-200EA | |
| (5 מ"ל), | של קורנינג | CLS4487-200EA | |
| (50 מ"ל), | קורנינג | CLS4470-200EA | |
| 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים | קורנינג | 352235 סגנון 12 x 75 מ"מ, 70 מ"מ | |
| רשת ניילון | SEFAR | 03-100/32 | 100 מ"מ |
| Titertube מבחנות מיקרו, | צינורות מיקרופקס | BIO-RAD | 2239391 |
| 5 מ"ל מבחנת פוליסטירן תחתונה עגולה, ללא מכסה | Corning | 352008 | 12x75 מ"מ |
| מכסי הצמד למבחנות 12x75 מ"מ | Corning | 352032 | |
| תא ספירה, נויבאואר שיפר את פסיקת הרשת הכפולה, קו בהיר (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | ריבועים גדולים בגודל 3x3 של 1 מ"מ2; עומק 0.100 מ"מ; נפח 0.1 מ"ל; שטח מינימלי 0.0025 מ"מ2 |
| Coverslips (Menzel-Glä סר) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 מ"מ |
| מיקרוסקופ | Nikon TMS | 310528 | |
| צנטריפוגה 5810R מקוררת | Eppendorf | 5811000487 | עם רוטור A-4-81 כולל מתאמים לצינורות חרוטיים של 15/50 מ"ל |
| קורא מיקרו-צלחת FLUOstar Omega | BMG Labtech | N/A | קורא צלחות לבדיקת התפשטות תאים. מסנן 490 ננומטר. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow תוכנית איסוף וניתוח נתונים של ציטומטר זרימה, גרסה 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | תוכנית ניתוח נתונים של ציטומטר זרימה, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar בקרת קורא מרובה משתמשים, גרסה 5.11 | |
| Omega - ניתוח נתונים | BMG Labtech | MARS | FLUOstar ניתוח נתונים, גרסה 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | גרסה 7.0c |
מקורות
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cur....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
