מאמר שיטה

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 בינואר 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתאים חיים, תהליכים כגון היווצרות אדהזיה כרוך ביצוע שינויים מבניים נרחב קרום פלזמה ואת החלק הפנימי של התא. על מנת להמחיש את האירועים דינמי מאוד, חברו יחד שתי שיטות משלימות מיקרוסקופ אור לאפשר הדמיה מהיר של דגימות בשידור חי: ספינינג דיסק מיקרוסקופ (אס די) עבור ברזולוציה גבוהה ומהירה נפח הקלטה של החזרה גמורה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עבור לוקליזציה מדויק והדמיה של קרום פלזמה. פרוטוקול דימות מקיף ושלם יוצג עבור המנחה דרך הכנת הדוגמא, מיקרוסקופ כיול, התמונה היווצרות ורכישה, וכתוצאה מכך צבע רב SD-TIRF בשידור חי סדרת הדמיה עם רזולוציה גבוהה-עתיים. כל השלבים עיבוד דפוס תמונה נחוץ ליצירת רב ממדית datasets הדמיה בשידור חי, כלומר רישום ושילוב של והערוצים, ניתנים במאקרו עצמית בכתב עבור תוכנת קוד פתוח ImageJ. ההדמיה של חלבונים פלורסנט במהלך החניכה, ההבשלה של מתחמי אדהזיה, כמו גם היווצרות של הרשת cytoskeletal אקטין, שימש הוכחה של עיקרון עבור גישה חדשנית זו. השילוב של מיקרוסקופיית תלת-ממד ברזולוציה גבוהה TIRF סיפק תיאור מפורט של התהליכים המורכבים האלה בתוך הסביבה התאית, באותו הזמן, לוקליזציה מדויק של מולקולות ממברנה-הקשורים מזוהה עם גבוה יחס אות-כדי-ברקע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הימים שלנו, מיקרוסקופ אור טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה/סופר ב קבוע מתן הדגימה החיה מפתחים במהירות. סופר-רזולוציה טכניקות כגון גירוי פליטה דלדול (STED), הבנוי תאורה מיקרוסקופ (SIM), צילום-הפעלת מיקרוסקופ לוקליזציה (דקל) או מיקרוסקופית ישירה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה), בהתאמה, הם זמינים מסחרית ולאפשר הדמיה של מבנים subcellular מציג פרטים כמעט על סולם מולקולרית1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה עדיין מוגבלת הישימות לניסויים הדמיה בשידור חי, שבו צריך כמויות גדולות, ניתן לאבחן עם מספר מסגרות לכל השני מהירות הרכישה. סוגים שונים של תהליכים דינאמיים מאוד מוסדרים דרך קרום פלזמה, למשל אנדו- / אקסוציטוזה, הדבקות, העברה או איתות, מתרחשות במהירות גבוהה תוך תאית בנפחים גדולים. לאחרונה, על מנת למלא את הפער הזה, טכניקה משולבת מיקרוסקופ היה המוצע ספינינג שנקרא דיסק-TIRF (SD-TIRF)7. בפירוט, מיקרוסקופ TIRF היתרי במיוחד לבודד, בתרגום של קרום פלזמה8,9, בעוד SD מיקרוסקופ הוא אחד של רגיש ביותר ומהיר לחיות טכניקות הדמיה הדמיה ומעקב של organelles subcellular10,הציטופלסמה11. השילוב של שתי טכניקות הדמיה בכיוונון יחידה כבר כבר הבנתי את העבר12,13, לעומת זאת, המיקרוסקופ המובאת כאן (איור 1) סוף סוף עונה על הקריטריונים כדי לבצע ניסויים SD-TIRF הדמיה בשידור חי התהליכים הנ ל- 3 מסגרות לכל השני מהירות. מאז מיקרוסקופ זה זמין מסחרית, המטרה של כתב יד זה היא לתאר בפרטים ולספק כלי קוד פתוח ופרוטוקולים ייבוא תמונות, רישום של ויזואליזציה הקשורים עם מיקרוסקופ SD-TIRF.

הגדרת מבוסס על מיקרוסקופ הפוכה מחוברת סריקה שתי יחידות באמצעות יציאות עצמאיות - הנמל שמאל קשורה יחידת SD והנמל בחזרה את יחידת הסורק עבור TIRF וצילום-הפעלה/הלבנת-ניסויים. עד 6 לייזרים (405/445/488/515/561/640 ננומטר) יכול לשמש עירור. עבור עירור וזיהוי של האות פלורסצנטיות, או 100 x / NA1.45 שמן או 60 x / NA1.49 שמן TIRF המטרה, בהתאמה, יש כבר מועסקים. האור הנפלט הוא מפוצל על ידי מראה ודיקרואיק זוהר (561 nm פס ארוך או לונג nm 514-מעבר...), מסוננים על ידי הלהקה לעבור מסננים שונים (55 ננומטר רחב מרוכז בכל 525 nm, 54 nm רחב מרוכז בכל 609 ננומטר על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, בהתאמה) הניח לפני EM-CCD מצלמת שני תקופות. הינכם מתבקשים לשים לב כי לקבלת פרטים טכניים נוספים אודות הגדרת רשומים Zobiak. et al. 7. בתצורה TIRF, יחידת SD עזב את נתיב האור בתוך בערך 0.5 s כך שתי מצלמות אותו יכול לשמש לצורך זיהוי, ומאפשר מעבר מהיר יותר בין שתי שיטות הדמיה בהשוואה בסביבות 1 s שדווח בעבר13 < /c2 >. תכונה זו מאפשרת רכישה סימולטני ערוץ כפול, ובכך 4 ערוצי SD-TIRF הדמיה ב בעבר לא תואמות מהירות, דיוק יכול להתבצע. יתר על כן, יישור בין תמונות SD ו- TIRF אינה נחוצה. יישור תמונה בין שתי מצלמות, אך יש לבדוק לפני תחילת הניסוי, תוקן במידת הצורך. בפרוטוקול הבא, שיגרה תיקון הרישום בוצע במאקרו ImageJ עצמית בכתב. יתר על כן, המאקרו בעיקר נועדה לאפשר ויזואליזציה סימולטני של SD, TIRF datasets למרות שלהם dimensionality שונים. רכישת התוכנה עצמה לא סיפקו תכונות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תאים

  1. יומיים לפני הניסוי, זרע תאים 3 * 105 הלה או NIH3T3 2 מ של מדיום הגידול מלא בכל טוב של צלחת 6-ובכן תא-תרבות. ודא כי התאים מתבצע במסגרת תא למינארי לאורך כל פרוטוקול זה.
  2. יום אחד לפני הניסוי, הכן את ריאגנטים תרביות תאים על פי ההמלצות של היצרן או פרוטוקול מדעית נחוש, למשל:
    1. למהול 1 µg של RFP-Lifeact, 1 µg של YFP-Vinculin סך של 200 µL מופחת סרום בינוני. מערבולת הכימית תרביות תאים בקצרה, להוסיף 4 µL 200 µL DNA ו מערבולת שוב. דגירה המיקס תרביות תאים למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הוסף את המיקס כולו תרביות תאים dropwise ישירות אל התאים. לערבב ע י ניעור לצלחת ומניחים אותו בחזרה לתוך החממה.
  3. ביום של הניסוי, הכן את הדגימה עבור הדמיה בשידור חי:
    1. להכין פתרון µg/mL 10 של fibronectin ב- PBS כדי להרגיע את משטח זכוכית צלחת תחתית זכוכית 35 מ מ. השתמש רק באיכות גבוהה 0.17 מ מ coverslips זכוכית דקה לקבלת ביצועים מיטביים TIRF והימנע מנות התחתון מפלסטיק. לעזוב הפתרון על משטח הזכוכית של פני השטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר אותו ולתת המנה מילה נהדרת...
    2. לדלל פתרון חרוזים מרובי פלורסנט מיקרומטר 0.1 צפיפות של 1.8 x 10 חלקיקים9 לכל מ ל מים מזוקקים ולהוסיף את הפתרון עבור 30-60 s השטח מצופים fibronectin זכוכית. להסיר לאלתר את הפתרון, מילה נהדרת לתת המנה.
      הערה: השלב זה נחוץ רק אם המטוס TIRF צריך להימצא לפני זריעה תאים ו/או לרכוש תמונת ייחוס 2-צבע לרישום תמונה המבוססת על חרוז.
    3. להכין פתרון חומצה אסקורבית (AA) 0.1 M, למהול אותו כדי ריכוז סופי של 0.1 מ"מ מדיום הגידול (AA-בינוני). מקם את הפתרון באמבט מים 37 º C.
      הערה: השתמש תא הממוטבים פלורסצנטיות תרבות בינוני במידת האפשר, כזה כמו ללא phenolred, (ribo-) בינוני פלווין-מופחתת. AA הוא סוכן אנטי מחמצן שיכולים להפחית תופעות פוטוטוקסי במהלך דימות חיים14. בדקנו אותה בהצלחה ב- assay זו, דהיינו עוד תאים הופיע בריא בתנאים להחיל יותר ללא תוספת AA. עם זאת, ה-pH של המדיום הונמך 0.17 יחידות pH.
    4. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS, להוסיף 250 µL טריפסין-EDTA ולחכות עד התאים הם לגמרי מנותק (2-3 דקות בתוך חממה 37 ° C). Resuspend התאים בזהירות 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני עם פיפטה ולהוסיף אותו 4 מ ל AA-בינוני בשפופרת התרבות התא 15 מ"ל. מקום התליה תא עם מכסה פתוחה מעט אינקובטור נקבע ל- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באזור המיקרוסקופ.
    5. להוסיף 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני למנה התחתון זכוכית ולמקם אותו האוחז המיקרוסקופ מחומם מראש (ראה סעיף הבא).

2. הדמיה חיה

  1. הפעל שליטה סביבתי של המיקרוסקופ להשגת יציבה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ואווירה לח.
    הערה: כאן, תא הדגירה העליון במה קטנה כבר בשימוש בהגדרות יציב מותרים בתוך כ-15 דק חממות גדול יותר יהיה עליך עוד פעם כדי להשיג תנאים יציבים.
  2. לתקן את כל ההגדרות רכישה בהמיקרוסקופ לפני התליה תא מוחל:
    1. להגדיר את מרווח הזמן 30 s וכן את משך הזמן עד 60-90 דקות להפעיל את הפונקציה מיקוד אוטומטי של מבוססי חומרה-מיקוד האוטומטי על כל נקודת זמן (ערך "1").
    2. להתאים את החשיפה מצלמה, רווח, כמו גם את עוצמת הלייזר עבור כל ערוץ. רווח גבוה רמות, לייזר נמוך עוצמה וזמן חשיפה נמוכה recommendable להפחית רעילות צילום.
      הערה: הנתונים המוצגים כאן נרכשה עם חשיפה 200 ms, להשיג רמה 500 ו- 20% לייזר כוח השווה לעירור עוצמות של 0.5 W/cm ² עבור 488 ננומטר, 1 W/cm ² עבור 561 nm, בהתאמה.
    3. הגדר הערימה-z עבור הערוצים ספינינג-disk 10 מיקרומטר עם מרווח מיקרומטר 0.4. בטל את הבחירה להפעיל z-ערימות עבור הערוצים TIRF. ההיסט התחתון מוגדר "0", כלומר המישור הנמוך יהיה המיקום המוקד של פוקוס האוטומטי חומרה.
    4. להפעיל את הפונקציה multi-point "הבמה עמדות".
      הערה: עד 3 עמדות ניתן להקליט במרווח זמן s 30.
  3. למצוא את החרוזים פלורסנט עם תאורה פלורסנט-אפי את העינים או על גבי מסך המחשב, ולאחר מכן להפעיל את ערוץ TIRF אחד, לקבוע את זווית תאורה לערך מציין TIRF תאורה. להפעיל את פוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הכפתור בלוח מיקרוסקופ והתאימו את המוקד עם ההגה היסט. רוכשים של הנתונים (dataset) 2-צבע, כלומר TIRF-488, TIRF-561, לרישום תמונה המבוססת על חרוז עוקבות (ראה הצבע 3.1).
    1. אופציונלי: כדי להבטיח תאורה TIRF, הוסף כמה microliters של ההשעיה חרוזים ססגוניות פלורסנט בחופשיות צף (ראה הצבע 1.3.2.). הפעל את התצוגה בשידור חי של ערוץ TIRF ולהגדיל את זווית תאורה. החרוזים שאינם מחסידי ייעלמו מעבר הזווית הקריטית, הקפדה על תאורה נכונה TIRF8.
  4. לערבב התליה תא שוב על ידי היפוך הצינור סגור 2 - 3 פעמים, ולהחיל 1 מ"ל של התאים על המנה הדמיה.
  5. למצוא במהירות כפולה-transfected תאים עם תאורה epi-פלורסנט ברמה נמוכה. מרכז את התאים בתצוגה המקדימה מצלמה בשידור חי באמצעות תאורה שדה בהיר, לסמן את המיקום. למצוא עוד 1-2 נקודות עניין ולשמור אותם לרשימת עמדות.
    הערה: בהתחלה, התאים בקלות ניתן לנתק עקב התנועה הבמה, ומכאן להגדיר עמדות 4-5, לבדוק מחדש כל לפני תחילת ייבוא תמונות. לאחר מכן, להתעלם 1-2 עמדות.
  6. התחל הנתונים על-ידי לחיצה על כפתור "רצף".

3. התמונה שלאחר עיבוד ב- ImageJ

  1. על מנת ליצור hyperstack ללא רישום של פיג'י15, מאקרו בשם "SD-TIRF_helper" נכתב כי ניתן ליישם datasets timelapse SD-TIRF של ערוץ 2-4. שמור את הקובץ "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" בפיג'י תיקיית משנה "מאקרו", הפעל את המאקרו באמצעות לחיצה על פקודת התפריט "תוספים > פקודות מאקרו > הפעל...".
    1. אם ערוצי הצבע צריך תיקון הרישום, בחר באפשרות צור הפניה חדשה המבוססת על חרוז רישום (קובץ. ציון) או להשתמש בקובץ קיים שנוצר לפני.
      הערה: ה-plugin turboreg16 יוחלו על ידי קרינה פלואורסצנטית חרוזים הפניה תמונות. התקן את התוסף פיג'י תוכנה על פי הנחיות כלליות עבור תוסף התקנות.
    2. לייבא את הנתונים עם היבואן ביו-תבניות ובחר hyperstack כאפשרות הצפייה. לטעון את התמונה ערכת הנתונים, בחר סדרת ה SD-הצעד הראשון, סדרת ה-TIRF בשלב השני. פיג'י יציג את הנתונים הממוינים לפי ערוץ ואת הבמה עמדה, כלומר בדרך כלל כל SD-ערוצי, TIRF כל-הערוצים יופיע כמו hyperstack אחת עבור כל מיקום הבמה שנבחר.
      הערה: ייבוא נתונים אפשרית על סוגי קבצים שונים, למשל סדרת-TIFF או קובץ תלויי פלטפורמה סוגי כגון * .nd. ניתן לזיהוי סוג הקובץ רק אם זה לא יוצאו על ידי רכישת תוכנת בתור עצמאית, דחיסה-פחות בתבנית TIFF.
    3. להחיל את התיקון רישום על הערוצים בהתאמה על-ידי טעינת קובץ ציוני שנקבע מראש.
    4. בחר את טבלת חיפוש צבעים בצבע הרצוי (LUT) עבור כל ערוץ SD - ו TIRF, למזג אותן hyperstack יחיד, רב-מימדי.
      הערה: במהלך העיבוד של ערוצי TIRF, מספר z-מטוסים עם אפס ערכי העוצמה מתווספות על גבי המישור התחתון שתואם עם המספר של z-מטוסים ב- SD dataset. שלב זה חשוב עבור הפריט החזותי של hyperstack הסופית. מתודולוגיה זו נכונה, מאז עומק התאורה TIRF (פחות מ- 200nm7) הוא קטן יותר מהגודל z-צעד של הערימה SD (400 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להראות הפוטנציאל של SD-TIRF הדמיה, שוזמינותו פותחה זה לחשוף את הארגון-עתיים תא מטריצה אדהזיה מתחמי והאינטראקציה שלהם עם שלד התא במהלך אדהזיה הסלולר. לכן, מחסידי הלה או, לחילופין, NIH3T3 התאים היו transfected עם YFP-Vinculin ו- RFP-Lifeact עבור ה' 18-24, trypsinized, נזרע על גבי זכוכית מצופים fibronectin התחתון מנות. שורות תאים אלה נבחרו עבור שלד התא בולטת שלהם ועמידות גבוהה יותר בניסויים הדמיה בשידור חי, בניגוד, לדוגמה, ראשי תאים. אלה לא יכול לעמוד. הדמיה במצב מאוד רגיש כפי שהם לאחר ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נייר זה הוצג יישומו המוצלח הראשון של מיקרוסקופיית SD ו- TIRF תצורה מתאים לביצוע ניסויים הדמיה התא בשידור חי, כלומר רכישה גבוהה המחירים כגון 2 SD-TIRF אוספי תמונות לדקה בשלב שונה 3 עמדות, המקביל סך של מסגרות 168 (בסביבות 3 מסגרות לשנייה), נרכשו. מיקרוסקופים SD-TIRF כמה שהיו שתוארה לעיל12,13, בעיקר חוסר מהירות הדמיה גבוה מספיק כדי לעקוב אחר תהליכים תאיים תלת-ממד שבו רזולוציה טמפורלית של פחות מ 2 s לכל תמונה מחסנית הוא לעתים קרובות הכרחי. הגדרת שהוצגו ניתן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מאוד הקהילה המדעית של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים לתמיכה אותנו עם דגימות להערכה. כלומר, אנחנו תודה סבין Windhorst תאי NIH3T3, אנדריאה Mordhorst עבור YFP-Vinculin ו- Maren רודולף עבור RFP-Lifeact.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מיקרוסקופ ואביזרים
SD-TIRF מיקרוסקופVisitron Systems
Ti עם מערכת מיקוד מושלמתמעמד מיקרוסקופ הפוךניקון
CSU-W1 T2Yokogawaבתצורת מצלמה כפולה
iLAS2 סורק Roper ScientificTIRF/FRAP
Evolve פוטומטריקסEM-CCD מצלמות
PiezoZ שלבLudl מוצרים אלקטרונייםממונע Z שלב
Bioprecision2 XY שלבLudl מוצרים אלקטרונייםממונע XY שלב
הדגירה העליוןOkolabBold Lineטמפרטורה, CO2 ואספקת לחות
<חזק>תרבית תאים
תאי סרטן צוואר הרחםHeLa DSMZACC-57
NIH3T3 פיברובלסטיםDSMZACC-59
תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS) של Dulbecco14190144
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070סרום מופחת בינוני
סרום עגל עוברי (FCS)Gibco10500064
פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)Gibco15140148
מדיום גדילה מלא (DMEM בתוספת 10% FCS ו-1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfection מגיב
חומצה אסקורבית (AA)SigmaA544-25G
צלחת תרבית תאים 6 בארותSarstedt83.392
כלי תחתית זכוכיתMatTekP35G-1.5-10-C35 מ"מ, כיסוי זכוכית 0.17 מ"מ
פיברונקטין, פלזמת בקרThermoFisher Scientific33010018
Neubauer תא משופרVWR631-0696
חרוזי TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, המכון למיקרוביולוגיה רפואית, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג אפנדורף, גרמניה
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, המכון למיקרוביולוגיה רפואית, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג אפנדורף, גרמניה
תוכנה ותוספים
VisiViewVisitron Systemsגרסה 3
ImageJגרסה 1.52c
תוסףhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
מאקרו "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"פרסוםזהhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerגרסה 6.2.2
יחידת דיסק מסתובבת תא Turboreg

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

מאמרים קשורים