Assay תחרות צלחת כמו הערכה ראשונית מהירה של דיכוי מחלות

סיכום

המוצג הוא פרוטוקול עבור assay תחרות הצלחת לזהות אם קומפוסט ספציפי הוא עשוי להכיל חיידקים ופטריות לדיכוי צמיחה של Rhizoctonia solani.

תקציר

המטרה הייתה לפתח, לייעל את פשוט, זול ויעיל bioassay לזהות מחלה היכולת המדכא של קומפוסט ספציפיים כנגד קטילת פטריות Rhizoctonia solani. Solani ר הוא. חיידק של מגוון רחב של צמחים מארחים ברחבי העולם. הפטרייה שרד בקרקעות כמו saprophyte, גדל במהירות במדיה אגר מים פשוטים. צלחת וזמינותו היא שיטה מהירה כדי להשוות composts ליכולתם להאט את הצמיחה של ר' solani. וזמינותו מופיע גם עם דיכוי של פתוגנים אחרים פטרייתי קטילת לשרוד כמו saprophytes בקרקעות כגון Alternaria מוקדם פגע רע, Fusarium ווילט, כימשון root רוט Pythium root רוט.

מבוא

Rhizoctonia מייצג את מתחם רחב של פטריות, של אילו Donk הקוקומריס Thanatephorus (פרנק) (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) היא המחלה גורמת root רוט, המתלים-off¹. Rhizoctonia solani הוא של פתוגן אגרסיבי, saprophyte שיכולים לשרוד כמו sclerotia תחת בתנאי סביבה קיצוניים¹. כתוצאה מכך, יש פיזור גלובלי והוא יכול לגרום למחלה על מגוון רחב של צמחים מארחים כולל סולניים, קטניות, מורכבים מצליבים וכתוצאה מכך רציני הפסדים כלכליים.

קומפוסט יש את היכולת הנמל סוכנים/מוצרים חדשים עבור מסוימים פתוגנים צמח². עם זאת, לא כל composts דומים ולא משפיעים על כל הפתוגנים באופן דומה³. עץ מבוססי פחמן יש ליגנין גבוה יותר כדי תאית יחסי מאשר חציר או קש-פחמן המבוסס composts. רבי solani מעדיף זמינים פחמן נמצא קש. לעומת זאת, פטריות הדברה ביולוגית, כגון Trichoderma spp., יעילים יותר אם פחמן זמין פחות בקלות. מועיל פטריות וחיידקים לדשן יכול לדכא במחלות צמחים באמצעות תחרות, אנטגוניזם או ויסות גדילה הצמח³. הבדיקה המוצעת מזהה בעיקר אנטגוניזם שנוצרו על-ידי ייצור של אנטיביוטיקה, ecoenzymes או chelators הפוגעים בזכויות הפתוגן.

צמח bioassays הם תקן הזהב כדי לקבוע אם composts טובה או להרתיע גידול הצמח⁴. עם זאת, צמח bioassays הן זמן רב (שבועות עד חודשים) כדי להשלים את אשר עשוי להיות יותר זמן ממה הרצוי והוא דורש עוד עבודה כדי לחלץ צמחים בעלי שורשים כדי לכמת את החומרה של מערכות השורשים. וזהובה חזקים, אך מהיר יותר (ימים) מבחני יהיה אידיאלי עבור תוכניות בקרת איכות. המטרה של המאמר היא להפגין בדיקה מדויקת ומהירה יחסית כדי לנבא פוטנציאל המדכא של קומפוסט. השיטה הייתה בדוגמת אחרי אלפאנו. et al. ⁵ עם שתי חריגות, תמציות קומפוסט היו מדולל, אגר מים שימש במקום תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA). Solani ר גדל במהירות במדיה אגר מים פשוט ואילו PDA קידום התפתחותם של חיידקים ופטריות אחרים מזוהמים תרבות⁶.

זה וזמינותו צלחת מגישה כמחוון של דיכוי שחל על מגוון של פתוגנים צמח לשרוד בקרקע כמו saprophytes כולל solani ר⁷, Alternaria מוקדם פגע רע, Fusarium ווילט, כימשון root רוט Pythium root רוט. הצלחת התחרות וזמינותו שימושי למסך מגוון של מוצרים דשן המכיל קהילות של חיידקים זה לשמש הדברה ביולוגית סוכנים של פתוגנים בקרקע. וזמינותו היה אחד האינדיקטורים הכי עקבי של דיכוי המחלה ב קומפוסט מסחרי-מוצרים-^6,-⁸. המוצרים נבחרו שלהם וריאציה מתכון, בגרות, ואת תהליך הייצור.

פרוטוקול

1. מכינים מראש

1. תרבות פטרייתי מאסטר (מבחן האורגניזם)
   1. סדר מן האוסף סוג התרבות האמריקאית, מיקרוביולוגיה אוסף⁹, לפי teleomorph Thanatephorus הקוקומריס (פרנק) (בקרת האוויר 10154) או מאיה 4031.
   2. לחלופין: לאסוף מבודד מקומיים כפי שנעשה על ידי המחברים. אחרים-שתילים, צנון אדום (צנון sativus) עובד טוב כמו צמח פיתיון; לאסוף את אדמת ממיקום ידוע יש היסטוריה של המתלים-off או שורש ריקבון הנגרם על ידי רבי solani. לזרוע זרעים בקרקע ולבודד מן השורש נגעים כאשר השתילים הם בני 3-4 שבועות.
      1. להסיר את השתילים האדמה ולשטוף עם מים מהברז. חפשו רקמות חום באזור hypocotyl בין העלים השורש (איור 1).
      2. השימוש סכין גילוח יחיד, להב לחתוך קטעים 1 ס מ של hypocotyl או שורש יש צבע חום. להשתמש מלקחיים מחוטא-להבה לטבול את מקטעי בריכוז 10% של מלבין ביתי 1 דקות, ואחריו 10 s שטיפה במים סטריליים.
         הערה: החלק העליון והחלק התחתון של צלחת פטרי סטריליות הם מיכלים שימושי עבור שלב זה.
      3. שימוש מחוטא-להבה מלקחיים כדי להעביר את הצמח חתיכות הפנימי של מגבת נייר כדי פאט יבש ולאחר מכן מקם על פני צלחת פטרי עם אגר מים (15 גרם ב 1 ליטר).
      4. מניחים על צלחת פטרי בתוך מיכל פלסטיק עם מכסה, דגירה בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C). לנגב את הפנים של המכולה עם 10% באקונומיקה או 75% אתנול, לתת לו אוויר יבש לפני הוספת המנה.
      5. שמור מבודד אחסון לטווח ארוך על מדיה מינימלי של אגר כשהתירס מלוכסנים (17 גרם ב 1 ליטר) (ב 5 ° C).

איור 1: תסמיני המחלה. קרקע המכילה solani רבי התוצאה אחידה נביטה הממסד (משמאל). הסימפטומים על צנון שתילים להופיע נגעים חום-hypocotyl (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. השתמש פלטות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (39 גרם ב 1 ליטר) עבור inoculum עבור זה וזמינותו צלחת.
   1. ימסדו תרבות הבת של תרבות Rhizoctonia על אגר דקסטרוז תפוח אדמה אחד או יומיים לפני וזמינותו, כדי להבטיח זה מבוסס על הצלחת תרבות לפני וזמינותו. התחל את התרבות הבת העברת חלק קטן (קוטר 10 מ מ) solani ר מהתרבות מאסטר במרכז צלחת טריים של תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (איור 2).
      הערה: תא למינארי או לנקות ספסל מעבדה עם אתנול באקונומיקה או 75% 10% כדי למזער את הסיכון של זיהום.
3. אוטוקלב תאים 25 מ ל מבחנות עם aliquots 10 מ"ל של מים מזוקקים (2 x מספר דוגמאות).

2. הכנת דוגמאות למבחן

1. להוסיף שתי דגימות 0.5 ג'י עצמאית של כל מדגם מבחן קומפוסט 10 מ"ל מים בלוק במבחנות 25 מ. לנער את המבחנות בן לילה.
   1. תווית צינורות הבדיקה עם מספרים ייחודי, כל חבר של הזוג (הפניה) או B (דוגמה).
2. לאחר 24 שעות, להוסיף 1.5 גר' אגר רגיל 90 מ ל מים מזוקקים ב mLconical 125 שתי מבחנות.
3. אוטוקלב בשתי מבחנות חרוט עם אגר, המדגם A של כל זוג למשך 20 דקות עם סביבה הפליטה איטי.
4. לאחר החיטוי, מקם את המבחנות חרוט עם אגר לתוך אמבט מים 45 ° C עד שיגיעו שיווי משקל (כ- 30 דקות). אל תשים שום slurries מדגם באמבט מים עד זה יש מקורר עד 45 מעלות צלזיוס.

איור 2: איור של פרוטוקול. פקקים של רבי solani ממוקמים על בצלחות פטרי המכילות תמצית מים קומפוסט. הקוטר של צמיחה mycelial נמדד לאחר 1-2 ימים בעזרת מיקרוסקופ סטריאו לשיפור רזולוציה וניגודיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. שופכים את slurry קומפוסט (הפניה בלוק) מדגם A לתוך אגר מותכת בקבוקי שתייה צידניות אגר A. מערבולת כדי לפזר קומפוסט לתוך אגר.
6. שופכים את slurry קומפוסט (דוגמה חיה) מדגם B לתוך אגר מותכת בקבוקי שתייה צידניות אגר B. מערבולת כדי לפזר קומפוסט לתוך אגר.
7. שופכים את התערובת של כל הבקבוק לתוך חמש צלחות פטרי פלסטיק שאינן 100 מ מ קוטר.
8. תן הלילה קריר הצלחות אז אגר מתקשה.

3. מוסיפים את האתגר Rhizoctonia

1. באמצעות הטכניקה aseptic, להעביר כל זוג של פלטות אגר מדגם בגודל שווה חתיכות של רבי solani (3-5 מ"מ corkborer עובד טוב להקים חתיכות בגודל שוות). סעו חתיכות של המושבה השוליים החיצוניים של המושבה כדי להבטיח תפטיר הוא גדל באופן פעיל.
   הערה: תא למינארי או לנקות ספסל מעבדה עם אתנול באקונומיקה או 70%-10%.
2. תקופת דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר של 1-2 ימים עד הגידול המושבה מגיע בערך בחצי הדרך לקצה של הלוחות A.

4. למדוד רבי solani צמיחה

1. למדוד הרדיוס של תפטיר כל צלחת על 1 מ מ הקרובה עם סרגל ברור שטוח באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם תאורה המשודרת.
   הערה: תאורה עקיפה או כהה בשדה זה מקל לראות ולמדוד את hyphae שקוף. בשלב זה, אזורי של דיכוי יהיה גלוי סביב קומפוסט שברי בצלחת B אם הקומפוסט הוא מדכאים.
2. להקליט את הרדיוס ב-3 מקומות לכל צלחת, לחשב ממוצע של שלושת לשמש כאמצעי נציג.
3. הפחת הממוצע של הלוחות B מן הלוחות A. אם B < ואז יש חיידקים לוחית B כי הם מדכאים את המחלה solani ר .
4. לחלק את רדיוס רשע לפי מספר ימי אתגר לבטא יחידות של דיכוי יחסית כמו קצב, תפטיר מ מ ליום.

תוצאות

קומפוסט סיים צריך להיות יציב, בוגר, שני התנאים אשר משמשים לסירוגין, כך שזה יכול להיות בבטחה הארוזים מועברים, ואת לא לגרום תופעות לוואי במהלך שלו יסתיים השתמש⁴. יציבות היא התנגדות הפירוק, בדרך כלל נקבע באמצעות מדדי פעילות מיקרוביאלית. מידות כלליות של נשימה מיקרובית יכול למדוד קומפוסט יציבות אך לא בהכרח מחלה דיכוי של פתוגן אגרסיבי ושל saprophyte כגון רבי solani⁷. מחקר זה התמקד בגרות אשר יסיק החומר מוכן לשימוש מסוים, ...

דיון

אנחנו יודעים ממחקרים קודמים, כי composts מסוימים יעילים דיכוי solani רבי , כי ההשפעות מדכאים הם עקב חיידקים חיים של קומפוסט, לא את המאפיינים והאביוטיים של קומפוסט^6,8. השימוש autoclaving כאמצעי ' להרוג ' microbiota ביקורת כי זה משפיע הפחמן הכימיה של מדיה¹⁰. השווינו את השימוש autoclaving כדי סינון ואקום באמצעות נייר וטמן מס ' 1. טיפולים שלא היו לא מסונן ולא בלוק הראה הדיכוי הגדול של רבי solani הצמיחה⁶

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוק חרוטי מזכוכית צרת צוואר הניתן לחיטוי	פישר סיינטיפיק	10-040D	125 מ"ל
מבחנות זכוכית הניתנות לחיטוי	פישר סיינטיפיק	14-925J	25 מ"ל
אגר מגורען מיובש	פישר סיינטיפיק	DF0145-17-0	500 גרם
כמות כפפות עמידות בחום	פישר סיינטיפיק	MEMGG1314WL	מספר מותגים זמינים
פרפילם (רצועות ברוחב 2-3 ס"מ)	פישר סיינטיפיק	PM992 13-374-16	5 או 10 ס"מ רוחב עבודה
צלחות פטרי פוליסטירן חד פעמיות	פישר סיינטיפיק	R80116	מגיע בשרוולים של 20/ea או מארזים של 500
תפוחי אדמה מיובשים דקסטרוז אגר	פישר סיינטיפיק	DF0013-15-8	מגיע בכמויות של 100, 500 ו-2000 גרם
שייקר הדדי ספסל	תומאס סיינטיפיק	1227Y31	דגמים אחרים יעבדו
אמבט מים	ThermoScientific	S37363	5L
סרגל שקוף לשימוש כללי, שטוח, לפחות 10 ס"מ	כל		שימוש כלל מטרי
ATCC תרבות ATCC	אוסף תרבות סוג אמריקאי	ATCC 10154	teleomorph Thanatephorus cucumeris (פרנק) (ATCC 10154) או MYA 4031;
קלטת מעבדה	פישר סיינטיפיק	15935	ניתן לחיטוי ונשלף, 1 אינץ' רחב מועדף
עמיד במים	סמן משרד או אספקה מדעית	עדין שארפי	כתוב מספר מדגם על קלטת

טיפ