Method Article

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

DOI:

10.3791/58820

⸱

January 31st, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כרומטין, אשר שרשרת ארוכה של נוקלאוזום subunits, היא מערכת דינמית המאפשרת עבור תהליכים קריטיים כאלה כמו שכפול ה-DNA, תמלול לקחת למקם את התאים האיקריוטים. הדינמיקה של נוקליאוזומים מספקת גישה אל ה-DNA על ידי שעתוק ושכפול machineries, ותורמת באופן ביקורתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס כרומטין פונקציות. מולקולה בודדת מחקרים כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה תרמו באופן משמעותי את ההבנה הנוכחית שלנו התפקיד של מבנה נוקלאוזום ואת הדינמיקה. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הפעלת טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה של AFM ללמוד את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. הפרוטוקול מודגם על ידי AFM נתונים שהושגו עבור נוקליאוזומים צנטרומר שבו H3 היסטון מוחלף עם עמיתו שלה, צנטרומר חלבונים (CENP-A). הפרוטוקול מתחיל עם ההרכבה של מונו-נוקליאוזומים באמצעות שיטה דילול רציפה. הכנת המצע נציץ functionalized עם aminopropyl silatrane (APS-מיכה) המשמשת עבור ההדמיה נוקלאוזום הוא קריטי עבור הפריט החזותי AFM של נוקליאוזומים תיאר וסיפק ההליך כדי להכין את המצע. נוקליאוזומים שהופקדו על פני השטח APS-מיכה הם קודם עם תמונה באמצעות AFM סטטיים, אשר לוכדת תמונה של האוכלוסייה נוקלאוזום. מניתוחי בתמונות אלו, ניתן למדוד פרמטרים כגון כמו הגודל של DNA העוטפת את נוקליאוזומים, תהליך זה גם מפורט. AFM זמן לשגות הדמיה הליך בנוזל מתואר עבור AFM בצילום מואץ במהירות גבוהה כי יכול ללכוד מספר פריימים של נוקלאוזום דינמיקה לשניה. לבסוף, הניתוח של דינמיקה נוקלאוזום המאפשרים אפיון כמותי תהליכים דינאמיים תיאר, מאויר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התאים האיקריוטים, ה-DNA הוא מאוד מרוכז ומאורגן לתוך כרומוזומים. 1 הרמה הראשונה של ארגון ה-DNA בתוך כרומוזום הוא ההרכבה של נוקליאוזומים ב 147 אילו bp של ה-DNA הוא מתאמץ יותר סביב ליבה octamer היסטון. 2 , 3 נוקלאוזום חלקיקים להרכיב על מולקולה DNA ארוך יוצרים מערך כרומטין אשר מאורגן אז עד יחידה קומפקטית מאוד כרומוזום נוצר. 4 פירוק של כרומטין מאפשר גישה חינם דנ א הנדרש על-ידי תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול שעתוק ו גנום של ג'ין, רומז שכרומטין הזה הוא מערכת דינמי מאוד. 5 , 6 , 7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. רציף דילול הרכבה של מונו-נוקליאוזומים

  1. לייצר ולטהר המצע דנ א כ- 400 של bp המכיל את ממורכז ווידום 601 נוקלאוזום מיצוב רצף. 55
    הערה: כדי להגביל את היווצרות di-נוקליאוזומים לא רצויים, כל 'זרוע' איגוף הרצף המיקום לא יעלה על ~ 150 bp.
    1. השתמש פלסמיד pGEM3Z-601 יחד עם תחל תוכנן ומגבירים את ה-DNA המצע באמצעות PCR. קדימה לשימוש המצע bp 423 באורכים 122, 154 bp הזרוע המשמש כאן, (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3 "), הפוכה (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') תחל.
    2. להוסיף צינורות המכיל את התערובת התגובה הצנטרפוגה תרמי טרופה עד 95 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנית הבאה מחזורים 33 לאחר דנטורציה הראשונית עבור 5 דקות ב 95 ° c: 30 s דנטורציה 95 ° C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונו-נוקליאוזומים שהוכנו קודם עבור AFM הדמיה ניסויים באמצעות שיטת הרכבה רציפה דילול (איור 1). נוקליאוזומים מוכן ואז נבדקו באמצעות מרחביות מקוטע-דף (איור 2). משטח מישה היה functionalized הבא באמצעות APS, אשר לוכדת נוקליאוזומים על פני השטח תוך שמירה על רקע חלקה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה (איור 3). נוקליאוזומים הופקדו על APS-מישה, לאחר מכן היו עם תמונה באמצעות הדמיה AFM סטטי. בתור פקד על הרכבה ועל התצהיר, H3 מונו-נוקליאוזומים הוכנו, עם.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל היא פשוטה למדי, מספקים תוצאות מאוד לשחזור, למרות כמה נושאים חשובים יכול להדגיש. Functionalized APS-מיכה הוא מצע מפתח להשגת תוצאות אמין לשחזור. יציבות גבוהה של APS-מיכה היא אחת התכונות החשובות של סובסטרט זה המאפשר אחד כדי להכין את המצע הדמיה מראש לשימוש שיכול לשמש לפחות שבועיים לאחר להיות מוכן. 59 , 61 . אולם, פני השטח עלולים להיפגע על ידי ואדים של דבק אם הוא משמש נציץ גובר על הדיסקית מתכת. לכן, מומלץ לשימוש דו-צדדי. קלטת נציץ הרכבה כמפורט בפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחבר תרומות: YLL ו- MSD תוכנן הפרויקט; MSD התאספו נוקליאוזומים. MSD, נמנום לבצע ניתוחים ניסויים ונתוני AFM. כל המחברים כתב וערך את כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פלסמיד pGEM3Z-601Addgene, קיימברידג', MA26656
PCR פריימריםIDT, קורלוויל, IAהזמנה מותאמת אישית(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
פולימראזThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701מספר קטלוגי עבור 200 יחידות
ערכת טיהור PCRQiagen, הילדן, גרמניה 28104קטלוגי עבור 50 יחידות
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001מספר קטלוגי עבור 250 גרם
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028מספר קטלוגי עבור 500 גרם
(CENP-A/H4)2, EpiCypher אנושי רקומביננטיDurham, NC16-0010קטלוגי עבור 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher אנושי רקומביננטי, דורהאם, NC15-0311מספר קטלוגי עבור 50 ug
H3 Octamer, RecombinantHuman EpiCypher, Durham, NC16-0001קטלוגי עבור 50 ug
ערכת מכשיר דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.1 מ"לThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574מספר קטלוגי עבור 10 מכשירים
נתרן כלורידסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOS9888-500Gמספר קטלוגי עבור 500 מ"ג
אמיקון אולטרה-0.5  מסננים צנטריפוגליים mL Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008מספר קטלוגי ל-8 מכשירים
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLמספר קטלוגי עבור 25 מ"ל
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25Gמספר קטלוגי עבור 25 גרם
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001 מספר קטלוגי עבור 1 ק"ג
אמוניום פרסולפט (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700מספר קטלוגי עבור 10 גרם
30% תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158מספר קטלוגי עבור 500 מ"ל
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800מספר קטלוגי עבור 5 מ"ל
4x מאגר דגימת חלבון Laemmli עבור SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
2-MEסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOM6250-10MLמספר קטלוגי עבור סולם
חלבון צבוע מראש ageRulerThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616מספר קטלוגי עבור 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, הרקולס, קליפורניה1610786מק"ט למגבונים לא ארוגים לחדר נקי בנפח 1 ליטר
: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)מסונתז כמתואר ב-22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25Gמספר קטלוגי עבור 25 גרם
סקוטש טייפScotch-3M, סנט פול, מינסוטה
בדיקת EFM TESPA-V2 (להדמיה סטטית)בדיקות Bruker AFM, קמרילו, קליפורניה
MSNL-10 בדיקת afm (להדמיית זמן-lapse סטנדרטית)בדיקות Bruker AFM, קמרילו, קליפורניה
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480מספר קטלוגי עבור צינור 2 גרם
MgCl2Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MOM8266-100Gמספר קטלוגי עבור 100 גרם
מסנן Millex-GP, 0.22  ומיקרו; mסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזוריSLGP05010מספר קטלוגי עבור 10 מכשירים
בדיקה AFM BL-AC10DS-A2 (עבור HS-AFM)אולימפוס, יפן
מתחם FG-3020C-20 פלואורוטכנולוגיה ושות', בע"מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן 
מתחם FS-1010S135-0.5 פלואורוטכנולוגיה ושות', בע"מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן 
מיקרוסקופ כוח אטומי MultiModeBruker-Nano/Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה
מיקרוסקופיה של כוח אטומי במהירות גבוההטושיו אנדו, המכון למדעי הננו-חיים, אוניברסיטת קאנאזאווה, קאקומה-מאצ'י, קאנאזאווה, יפן
מספר , מספר מספר בנפח 10 מ"ל 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleosome StructureNucleosome DynamicsAtomic Force MicroscopyAFM ImagingChromatin StructureCENP A NucleosomesTime Lapse AFMMica Substrate PreparationProtein DNA ComplexesSingle Molecule Studies

Related Articles