הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

תקציר

כרומטין, אשר שרשרת ארוכה של נוקלאוזום subunits, היא מערכת דינמית המאפשרת עבור תהליכים קריטיים כאלה כמו שכפול ה-DNA, תמלול לקחת למקם את התאים האיקריוטים. הדינמיקה של נוקליאוזומים מספקת גישה אל ה-DNA על ידי שעתוק ושכפול machineries, ותורמת באופן ביקורתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס כרומטין פונקציות. מולקולה בודדת מחקרים כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה תרמו באופן משמעותי את ההבנה הנוכחית שלנו התפקיד של מבנה נוקלאוזום ואת הדינמיקה. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הפעלת טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה של AFM ללמוד את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. הפרוטוקול מודגם על ידי AFM נתונים שהושגו עבור נוקליאוזומים צנטרומר שבו H3 היסטון מוחלף עם עמיתו שלה, צנטרומר חלבונים (CENP-A). הפרוטוקול מתחיל עם ההרכבה של מונו-נוקליאוזומים באמצעות שיטה דילול רציפה. הכנת המצע נציץ functionalized עם aminopropyl silatrane (APS-מיכה) המשמשת עבור ההדמיה נוקלאוזום הוא קריטי עבור הפריט החזותי AFM של נוקליאוזומים תיאר וסיפק ההליך כדי להכין את המצע. נוקליאוזומים שהופקדו על פני השטח APS-מיכה הם קודם עם תמונה באמצעות AFM סטטיים, אשר לוכדת תמונה של האוכלוסייה נוקלאוזום. מניתוחי בתמונות אלו, ניתן למדוד פרמטרים כגון כמו הגודל של DNA העוטפת את נוקליאוזומים, תהליך זה גם מפורט. AFM זמן לשגות הדמיה הליך בנוזל מתואר עבור AFM בצילום מואץ במהירות גבוהה כי יכול ללכוד מספר פריימים של נוקלאוזום דינמיקה לשניה. לבסוף, הניתוח של דינמיקה נוקלאוזום המאפשרים אפיון כמותי תהליכים דינאמיים תיאר, מאויר.

מבוא

התאים האיקריוטים, ה-DNA הוא מאוד מרוכז ומאורגן לתוך כרומוזומים. 1 הרמה הראשונה של ארגון ה-DNA בתוך כרומוזום הוא ההרכבה של נוקליאוזומים ב 147 אילו bp של ה-DNA הוא מתאמץ יותר סביב ליבה octamer היסטון. 2 , 3 נוקלאוזום חלקיקים להרכיב על מולקולה DNA ארוך יוצרים מערך כרומטין אשר מאורגן אז עד יחידה קומפקטית מאוד כרומוזום נוצר. 4 פירוק של כרומטין מאפשר גישה חינם דנ א הנדרש על-ידי תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול שעתוק ו גנום של ג'ין, רומז שכרומטין הזה הוא מערכת דינמי מאוד. 5 , 6 , 7 להבנת מאפייני ה-DNA ברמות שונות של כרומטין דינמי הוא חשוב ביותר עבור שחקרתי תהליכים גנטיים ברמה המולקולרית בו טעויות עלולות להוביל מוות של תאים או ההתפתחות של מחלות כמו סרטן. 8 מאפיין כרומטין חשיבות רבה הוא הדינמיקה של נוקליאוזומים. 9 , 10 , 11 , 12 ליציבות גבוהה של חלקיקים אלה אפשרה עבור אפיון מבניים על-ידי טכניקות לחקר הגבישים. 2 . איזה חוסר מחקרים אלה הם הפרטים דינמי של נוקליאוזומים כגון מנגנון ה-DNA הסרת העטיפה מן הליבה היסטון; מסלול דינמי אשר נדרשת עבור תהליכי שעתוק ושכפול. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, חלבונים מיוחדים כינה גורמים שיפוץ הוכחו להקל את פירוק של חלקיקים nucleosomal17; אולם, הדינמיקה הפנימית של נוקליאוזומים הוא הגורם הקריטי בתהליך זה תורם לתהליך פירוק כולו. 14 , 16 , 18 , 19

מולקולה בודדת טכניקות כגון מולקולה בודדת פלורסצנטיות19,20,21,22,18,13,אופטי השמנה (פינצטה)23 ו AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 סייעו להבין את הדינמיקה של נוקליאוזומים. בין השיטות, נהנה AFM מספר תכונות ייחודי ואטרקטיבי. AFM מאפשר לנו להמחיש ולאפיין נוקליאוזומים בודדים, כמו גם את מערכי עוד27. AFM תמונות, המאפיינים החשובים של נוקלאוזום מבנה כגון אורך DNA סביב ליבת היסטון יכול להיות נמדדו 10,14,26,28; פרמטר זה הוא מרכזי האפיון של דינמיקה unwrapping נוקלאוזום. מעבר AFM מחקרים גילו נוקליאוזומים להיות דינמי מאוד ומערכות ה-DNA תוכל לפתוח באופן ספונטני מן הליבה היסטון14. ספונטנית הסרת העטיפה של ה-DNA של נוקליאוזומים היה דמיינו ישירות על ידי AFM לפעול במצב זמן לשגות כאשר ההדמיה נעשית פתרונות מימית 14,26,29.

כניסתו של מכשור מיקרוסקופ כוח אטומי (HS-AFM) במהירות גבוהה זמן לשגות אפשרו להמחיש את התהליך unwrapping נוקלאוזום אלפיות השנייה סרגל זמן 14,15,24. HS-AFM 16,30 המחקרים האחרונים נוקליאוזומים ספציפי צנטרומר גילה מספר תכונות הרומן של נוקליאוזומים לעומת הסוג הקנוני. צנטרומר נוקליאוזומים מהווים של צנטרומר, חלק קטן של כרומוזום חשוב ביותר עבור כרומוזום סגרגציה31. בניגוד נוקליאוזומים הקנוני של כרומטין בתפזורת, ליבת היסטון צנטרומר נוקליאוזומים מכיל CENP-A היסטון במקום היסטון H332,33. החלפה זו היסטון, גלישת ה-DNA של נוקליאוזומים צנטרומר היא ~ 120 bp במקום 147 ~ bp נוקליאוזומים הקנוני; הבדל זה יכול להוביל מורפולוגיות שונות של צנטרומר, נוקליאוזומים הקנוני מערכים34, רומז שכרומטין צנטרומר הזה עובר dynamics גבוה יותר לעומת הנפח אחד. הדינמיקות הרומן מוצג על ידי צנטרומר נוקליאוזומים במחקרים30 16,HS-AFM להדגים הזדמנות ייחודית שסופקו על-ידי טכניקה זו מולקולה בודדת ישירות להמחיש את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. דוגמאות לתכונות ניתן בקצרה שנדונו ואת מאויר בסוף העיתון. התקדמות זו נעשתה עקב ההתפתחות של פרוטוקולים הרומן AFM הדמיה של נוקליאוזומים, כמו גם את השינויים של שיטות קיימות. המטרה של הפרוטוקול המתואר כאן היא להפוך את ההתפתחויות הללו מרגש במחקרים נוקלאוזום AFM מולקולה בודדת נגישה לכל מי שרוצה לנצל את טכניקות האלה החקירות שלהם כרומטין. רבים אחת מהטכניקות שתוארו החלות על בעיות מעבר המחקר של נוקליאוזומים, יכול לשמש עבור חקירות אחרות חלבון ומערכות ה-DNA של עניין. ניתן למצוא כמה דוגמאות של יישומים כגון פרסומים35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 ועתידה של AFM מחקרים של מערכות למערכות ביולוגיות שונות ניתנות ב דעת29,50,51,53,54.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. רציף דילול הרכבה של מונו-נוקליאוזומים

  1. לייצר ולטהר המצע דנ א כ- 400 של bp המכיל את ממורכז ווידום 601 נוקלאוזום מיצוב רצף. 55
    הערה: כדי להגביל את היווצרות di-נוקליאוזומים לא רצויים, כל 'זרוע' איגוף הרצף המיקום לא יעלה על ~ 150 bp.
    1. השתמש פלסמיד pGEM3Z-601 יחד עם תחל תוכנן ומגבירים את ה-DNA המצע באמצעות PCR. קדימה לשימוש המצע bp 423 באורכים 122, 154 bp הזרוע המשמש כאן, (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3 "), הפוכה (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') תחל.
    2. להוסיף צינורות המכיל את התערובת התגובה הצנטרפוגה תרמי טרופה עד 95 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנית הבאה מחזורים 33 לאחר דנטורציה הראשונית עבור 5 דקות ב 95 ° c: 30 s דנטורציה 95 ° C, s 30 חישול ב 49 ° C, הסיומת s 35-72 מעלות צלזיוס. להגדיר סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות אחרי המחזורים 33.
    3. לטהר את הדנ א של התערובת PCR באמצעות ערכת טיהור PCR זמינים מסחרית. כאשר eluting את ה-DNA של העמודה ' ניקוי ' PCR, להשתמש מאגר טריס 10 מ מ (pH 7.5) במקום הקיט מסופק • תנאי מאגר.
      הערה: תשמרי תוספת בהעברת מאגרי בין השלבים טיהור. Eluent מזוהמים יכול לגרום לבעיות במורד הזרם כאשר מדידת ריכוז ה-DNA ו/או יכול לשנות את הריכוז מלח המוצא של התערובת הרכבה נוקלאוזום.
  2. לקבוע את ריכוז הדנ א על ידי מדידת את ספיגת ה-DNA מטוהרים ב-260 ננומטר.
    1. לאסוף ריק על ספקטרופוטומטרים VIS UV באמצעות רק 10 מ מ טריס pH 7.5 • תנאי המאגר. לאסוף את מידת ה-DNA מטוהרים.
  3. עם הריכוז נקבע, aliquot pmol 25 ה-dna מטוהרים לתוך צינור microfuge 0.6 מ"ל ולמקם אותו ומפרידה ואקום עד הפתרון הוא בקושי נראה לעין; בדרך כלל זהו 30 דקות ל- 1 h.
    הערה: המצע DNA עכשיו הוא מוכן להרכבה נוקלאוזום. אחרת, ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, ה-DNA מאוחסנים ב-20 ° C עד השימוש.
  4. מקם את הצינור microfuge המכיל את pmol 25 דנ א על הקרח ולהוסיף רכיבי מכלול של נוקלאוזום טבלה 1, בסדר המפורט. כאשר כל הרכיבים נוספו, הסר את התערובת מן הקרח, דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות.
    הערה: זה קריטי כי תוכן המאגר היסטון מניות מלח נחשב כאשר חישוב של NaCl צורך להשיג את הריכוז הסופי של 2 מ'. 15 , 56
  5. להרכיב את נוקליאוזומים על-ידי הפחתת ריכוז מלח 2 מ' של התערובת עד 200 מ"מ באמצעות לדילול קצב רציף. 57
    1. ממלאים מזרק עם µL 100 דילול מאגר המכיל 10 מ מ טריס pH 7.5 ומניחים אותו על מזרק משאבה.
    2. ישיר המחט של המזרק דרך חור מנוקבת מראש הכובע של הצינור microfuge, הבטחת קשר מורכב עם התערובת הרכבה (איור 1).
    3. הפעל את משאבת מזרק בשיעור של 0.75 µL/דקה במשך 120 דקות.
      הערה: הפתרון µL 100 שיתקבל מכיל 250 ננומטר נוקליאוזומים 200 מ"מ NaCl.
    4. להעביר את התערובת על לחצן דיאליזה MWCO 10 K, dialyze נגד 200 מ של טרום מקורר (4 ° C) נמוך מלח מאגר המכיל 10 מ מ טריס pH 7.5, EDTA 0.25 mM ו- 2.5 מ"מ NaCl, עבור משאבי אנוש 1-4 מעלות צלזיוס.
  6. כדי להעריך את התוכן היסטון מכלול נוקלאוזום, הכנת ג'ל מרחביות-דף מקוטע עם 15% הפרדה, 6% לערום כפי שתואר לעיל30.
    1. Aliquot 10-20 µL של נוקלאוזום מלאי לרכבת התחתית microfuge ולהוסיף 4 x Laemmli מדגם מאגר ריכוז העבודה של 1-2 x. 58
    2. כפקד, חזור על הכנת צינור microfuge נפרדים עבור 1-2 µg של המניה היסטון. מחממים את הדגימות ב 95 ° C עבור ~ 5 דקות.
    3. לטעון את הדגימות של נתיבים סמוכים אחד לשני על הג'ל. להוסיף מאגר מדגם מסלולים שאינם בשימוש כדי לקדם את הלהקה אפילו ההעברה.
    4. להפעיל את הג'ל על 65 V עד החזית צבען נע דרך הג'ל הערימה. כאשר הג'ל הפרדת מתמלאת, להגדיל את 150 V ולהפעיל עד לחזית צבע יש היגרו לגמרי מחוץ הג'ל.
    5. לפרק את היחידה אלקטרופורזה ולהעביר את הג'ל בעדינות במיכל מכתימים מלא dd H2O. תן את הג'ל במשך חמש דקות עם עצבנות עדין. חזור על תהליך זה עוד פעמיים עם dd טריים H2O שימוש בכל פעם.
      הערה: הכתם Coomassie בשימוש פרוטוקול זה אינו דורש תיקון טיפוסי השלבים הדרושים עבור כתמים Coomassie (ראה טבלה של חומרים). אם הכנת Coomassie אחר הנמצא בשימוש, להתאים את השלבים תיקון לפי הצורך.
    6. להסיר את המים רינס הסופי ולהוסיף את הכתם בדיוק מספיק כדי לכסות את הג'ל. תן את הג'ל לשבת עם עצבנות עדין במשך לפחות שעה.
      הערה: עבור התסיסה, המכולה מכתימים ניתן להניח על כל מתקן מקדמת את התנועה של הכתם על הג'ל ולהשאיר את הג'ל מכוסה גם בנוזל.
    7. להסיר את הכתם של המכולה ולא לשטוף את הג'ל עם dd H2O. החלף dd H2O ומשרים את הג'ל במשך 30 דקות עם עצבנות עדין. (הג'ל צריך להופיע ככה באיור איור 2, עם הפרדה ברורה בין הלהקות היסטון).
  7. לאחסן את נוקליאוזומים ב 4 ° C עד השימוש.
    הערה: כאשר מאוחסנים בתנאים אלו, נוקליאוזומים להישאר יציב למשך מספר חודשים. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

2. functionalization של נציץ השטח עבור הדמיה AFM סטטי של נוקליאוזומים

  1. להכין 50 מ מ 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS מניות פתרון במים יונים כמתואר. 30 מ ל 1 חנות aliquots של פתרון זה ב 4 ° C עד השימוש.
    הערה: aliquots ניתן לאחסן במשך יותר משנה ב 4 º C. 59
  2. להתכונן הפתרון עובד APS 1:300 נציץ שינוי על ידי המסת µL 50 של המניה APS 50 מ מ 15 מ"ל dd H2O.
    הערה: פתרון עבודה זה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים.
  3. חותכים רצועות 1 x 3 ס מ של נציץ גליונות נציץ באיכות גבוהה (ראו טבלה של חומרים נציץ המשמש כאן).
    1. לבדוק החלק מתאים כאשר מניחים באלכסון ב cuvette. השתמש קצה חד פינצטה, גילוח או דבק, כדי לבקע שכבות של נציץ עד הצדדים הם טריים ביקע והן החלק הוא רזה כמו ~0.1 מ מ (איור 3 א). מיד למקם את היצירה נציץ cuvette APS מלא, תקופת דגירה של 30 דקות (איור 3B).
  4. להעביר את החתיכה נציץ cuvette מלא dd H2O ומשרים למשך 30 s (איור 3C). יבש לחלוטין צדי רצועת APS-נציץ תחת תזרים ארגון.
    הערה: תאית ארוגים ולנגב חדר נקי פוליאסטר (מומלץ לנגב מפורט בחומרים) יכול לשמש כדי לסייע הפתילה מים מהקצה של נציץ בעת ייבוש.
  5. שימוש רצועת יבשה נציץ הוא עכשיו לשם הכנת המדגם. אחרת, לאחסן את החתיכה cuvette נקי, יבש (דמות תלת-ממד).
    הערה: שטח אחסון נוסף בחלל ריק עבור h 1-2 מומלץ כאשר הסביבה הוא לח. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

3. הכנה של נוקלאוזום דגימות ב- APS-נציץ AFM סטטי הדמיה

  1. דבק דו-פרצופי חלים מספר דיסקיות מגנטיות ומניחים בצד.
  2. חותכים את המצע APS-נציץ לגודל הרצוי (1 x 1 ס מ ריבועים עבור כלי AFM מ מ המשמש כאן). במקום אלה חתיכות בצלוחית נקי ולשמור מכוסה.
  3. להכין שלוש דילולים של נוקליאוזומים שהורכב (ריכוזים נוקלאוזום הסופי של 0.5, 1.0, 2.0 ננומטר) באמצעות מיקרומטר 0.22 מסוננים מאגר המכיל 10 מ מ HEPES pH 7.5 ו- 4 מ מ MgCl2.
    הערה: כדי להגביל את אובדן נוקליאוזומים-הריכוז הסופי נמוך, דילולים צריך להיעשות אחד בכל פעם, מיד לפני התצהיר ב- APS-מיכה.
  4. להפקיד µL 5-10 המדגם נוקלאוזום מדולל במרכז היצירה APS-מישה, והנח תקופת דגירה של שתי דקות. יש לשטוף בעדינות את הדגימה עם 2-3 מ"ל של dd H2O כדי להסיר את כל מאגר הרכיבים. לאחר כל מ ~0.5 ל dd H2O בשימוש, לנער בעדינות את מישה כדי להסיר את המים העודפים שטיפה.
    הערה: מומלץ בשלב השטיפה זה מזרק חד פעמיות.
  5. יבש את הדגימה הופקדו תחת זרם אור של גז ארגון נקי.
    הערה: המדגם מוכן כעת ליצירת תמונה או יכול להיות מאוחסן בארון ואקום או desiccator מלא עם ארגון. דגימות מוכן ומאוחסנים כפי שתואר יש כבר צילמו שנה אחת לאחר הכנה ללא אובדן איכות. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

4. AFM סטטי הדמיה של נוקליאוזומים

  1. הר של עצה AFM את המחזיק עצה. השתמש טיפ בעל קבוע קפיץ של ~ 40 N/m, תדר התהודה בין 300 ו- 340 kHz (ראה טבלה של חומרים עבור cantilevers המשמש כאן).
  2. הר המדגם מוכן בסעיף 3 על הבמה AFM והיזהרו לא פנה אל פני השטח הדגימה.
  3. מקמו את הלייזר הזיז עד הסכום המרבי ולהתאים את ערכי הסטה אנכית, לרוחב כדי קרוב לאפס.
  4. לכוון את המכשיר AFM כדי למצוא תדר התהודה שלו, להתאים את משרעת נסיעה ולהגדיר את גודל התמונה 100 100x ננומטר. לחץ על לחצן לקיים כדי להתחיל את הגישה.
  5. ברגע התקרב, למטב בהדרגה את Setpoint משרעת עד פני השטח של המדגם הוא ראה בבירור. להגדיל את גודל סריקה 1 x 1 מיקרומטר ואת הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים. לחץ על לחצן הלכידה ואחריו הלחצן לקיים כדי להתחיל ייבוא תמונות.
    הערה: התמונות באיור 4 מראים על רקע חלקה הצפויה כאשר הדמיה אלה דוגמאות.
  6. כדי לנתח את הדגימה נוקלאוזום, פתח באמצעות התוכנה ניתוח של כלי נגינה AFM תמונות שנתפסו.
    1. לשטח את התמונה באמצעות קו פולינום חיסור או תכונה דומה.
    2. הגדר את טבלת הצבע כדי לשקף את הערך הנמוך ביותר עבור המינימום ואת הערך הגבוה ביותר מקסימלית. שמור תיעוד של ערכים אלה עבור כל תמונה כפי שהם יהיה צורך בשלב מאוחר יותר.
      הערה: אם לא נעשה שימוש בערכים אלה, נתוני גובה יהיה שגוי בניתוח מאוחר יותר כמו חתכי רוחב של נוקלאוזום ליבות יופיע בתור מישורים בגובה שווה, ולא בדרגות שונות.
    3. לייצא את התמונה כתמונת .tiff בגודל המקורי. ב'אל כל אפשרויות כדי לשמור את התמונה עם ברים גבול או קנה מידה.
    4. פתחו את התמונה בתוכנת ניתוח מסוגל מדידות אורך מתאר.
    5. הגדר של x, y ו- z קשקשים כדי להתאים את התמונה.
    6. כמו כיול אורך פנימי, למדוד ולהקליט את אורך DNA חופשי מקצה אחד לקצה השני מתאר. עבור מרכיב זה כיול, השתמש המדידות כדי ליצור היסטוגרמה ולהתאים אותו עם התפלגות נורמלית (לפי עקומת גאוס). לחלק את המרכז שיא (xc) לפי אורך המצע בזוגות בסיס.
      הערה: ערך זה הוא התמונה ספציפי פקטור המרה מ ננומטר זוגות הבסיס של ה-DNA.
    7. למדוד ולהקליט את אורך מתאר שתי הזרועות עבור כל נוקלאוזום מהקצה חינם של הזרוע אל מרכז הליבה, עקביות (איור 5A).
    8. עבור כל נוקלאוזום ליבה, לאסוף שניים מלא רוחב-חצי ערכי (FWHM) המרביים בניצב מזוג ליבות מידות חתך (איור 5B ממוצע המדידות FWHM שני ו להפחית חצי אחד של הערך המתקבל מן כל זרוע נוקלאוזום נכונות עבור אורך נמדד מכניסת היציאה/DNA למרכז של הגרעין זה לא חלק אורך הזרוע.
    9. לחלק לכל אורך הזרוע על-ידי הגורם כיול מחושב (שלב 4.5.6) כדי לקבל אורך הזרוע ב- DNA בסיסים.
    10. לחשב את היקף DNA גלישה על-ידי חיסור סכום היד נוקלאוזום האורך הכולל זוג בסיסים של המצע עטיפתו. להתוות ערכים אלה כמו היסטוגרמה, להתאים את peak(s) עם התפלגות (לפי עקומת גאוס) רגיל כדי להשיג רשע עטופה בסיס זוגות של ה-DNA עבור האוכלוסייה נוקלאוזום.
    11. לחשב את גובה ממוצע נוקלאוזום מן הסעיפים הצלב נמדד. מגרש זה כמו היסטוגרמה, להתאים את peak(s) עם התפלגות נורמלית (לפי עקומת גאוס) כדי להשיג את הגובה של האוכלוסייה נוקלאוזום.

5. זמן לשגות AFM הדמיה של נוקלאוזום דינמיקה

  1. הר העצה AFM את המחזיק עצה. יכול לשמש מכשיר בדיקה עם קבוע קפיץ של 0.1 N/m, תדר התהודה של 7-10 קילו-הרץ (ראה רשימת חומרים עבור cantilevers המשמש כאן).
  2. לצרף חלק 1 x 1 ס"מ APS-נציץ דיסקית מגנטי באמצעות הקלטת כפול-מקל והר הדיסקית על הכלי AFM.
  3. לדלל את נוקליאוזומים כדי ריכוז nM 1 במאגר מיקרומטר 0.22 מסוננים הדמיה המכיל 10 מ מ HEPES pH 7.5 ו- 4 מ מ MgCl2.
  4. להפקיד µL 5-10 של נוקלאוזום מדולל המרכז של היצירה נציץ עבור 2 דק שטיפה המדגם הופקדו עם 20µL של המאגר הדמיה פעמיים. לאחר השטיפה השני, לשמור droplet של הדמיה מאגר על פני השטח.
  5. להשתמש במצלמה להציג העליונה כדי למצוא עצה, הגישה אל פני השטח באופן ידני עד הקצה הוא ~ 100-500 מיקרומטר מפני השטח.
  6. להוסיף מאגר הדמיה נוספים כדי למלא את הפער בין הקצה השטח. בדוגמה זו, כ- 50 µL מאגר הדמיה מספיקה למלא את הפער. למצוא לשיא תהודה על הטיפ.
  7. מתחילים את הגישה מבוקר-מחשב אל פני השטח. כאשר פנה, להתחיל הדמיה עם אזור 1-2 מיקרומטר כדי לבחור אזור ~ 500 ננומטר התעניינות. בתחום הזה של עניין שנבחרו, להתאים את צפיפות רכישת נתונים ל- 512 x 512 פיקסלים.
  8. התאם את המתח שנקבעה מראש ולנסוע משרעת הפרמטרים לשיפור איכות התמונה. משרעת חינם של 10 ננומטר או פחות קצב סריקה של ~ 2 הרץ וניתן להשתמש בו כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהה. דוגמה של דינמיקה נוקלאוזום שנלכדה באמצעות AFM זמן לשגות מוצג באיור 6.

6. במהירות גבוהה AFM זמן לשגות הדמיה של נוקלאוזום דינמיקה

הערה: להלן הפרוטוקול מסופק עבור כלי HS-AFM שפותחה על ידי הקבוצה אנדו (אוניברסיטת קנואזה, קנאזוואה, יפן). 60

  1. היכונו APS-נציץ הדמיה נוזלי.
    1. לצרף את מוט זכוכית הסורק AFM הבמה באמצעות מוט זכוכית - סורק דבק (ראה טבלה של חומרים). תן את זה יבש למשך תקופה מינימלית של 10 דקות.
    2. הפוך ~0.1 mm עבה מעגלית פיסות נציץ בקוטר 1.5 מ מ על ידי להכות אותם מתוך גיליון נציץ גדול יותר. השתמש הדבק מוט זכוכית נציץ HS-AFM (ראה טבלה של חומרים) כדי לצרף קטע זה נציץ מוט זכוכית על HS-AFM ו יבש, ללא שינוי מינימלי כ-10 דקות. קליב שכבות באמצעות קלטת רגיש ללחץ עד שכבה טוב cleaved נתפסת על הקלטת.
    3. למהול 1 µL של 50 מ מ מניות APS של 99 µL dd H2O לעשות פתרון APS מיקרומטר 500. להפקיד µL 2.5 של פתרון זה על פני השטח נציץ טרי cleaved ותנו functionalize למשך 30 דקות.
      הערה: כדי למנוע התייבשות פני השטח תוך כדי functionalizing, הכיפה של שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל יכול להיות מתאים עם חתיכת נייר סינון לח והניח על הסורק. המניה APS הוא מדולל 3 פעמים פחות עבור הדמיה נוזלי מאשר הדמיה סטטי כדי לשלוט הדינמיקות לקצב. זה יכול להיות שנצפו עם AFM.
    4. יש לשטוף את מישה עם 20 µL dd H2O על-ידי החלת מספר שטיפות µL ~ 3. הסר במים לחלוטין בעקבות כל שטיפה על-ידי הצבת מגבון ארוגים בקצה נציץ. לאחר השטיפה הסופית, במקום µL ~ 3 של dd H2O על פני השטח ולתת לו לשבת למשך תקופה מינימלית של 5 דקות כדי להסיר את כל APS nonspecifically מאוגד.
  2. הכנס את המכשיר בעל HS-AFM והצב המחזיק על הבמה AFM עם קצה פונה כלפי מעלה. שטיפה המחזיק באמצעות ~ 100 µL של dd H2O ואחריו שני ~ 100 µL שטיפות של 0.22 נוקליאוזומים מיקרומטר מסונן הדמיה מאגר אשר מכיל 10 מ מ HEPES pH 7.5 ו- 4 מ מ MgCl2.
  3. עם שטיפות עשו, למלא את התא µL ~ 100 של נוקלאוזום הדמיה מאגר, השוקע הטיפ. להתאים את מיקום זיז עד שזה הוא פגע עם הלייזר. יש לשטוף את APS-מיכה עם 20 µL של נוקלאוזום מסוננים הדמיה מאגר, באמצעות µL ~ 4 לכל שטיפה.
  4. למהול 1 µL של המניה הרכבה נוקלאוזום לתוך µL 250 של נוקלאוזום מסוננים הדמיה המאגר עבור ריכוז נוקלאוזום הסופי של 1 ננומטר. להפקיד µL 2.5 של דילול זה על פני השטח ולתת לו לשבת על 2 דק. לשטוף את השטח עם ~ 4 µL של נוקלאוזום הדמיה מאגר פעמיים. לאחר השטיפה הסופית, להשאיר את פני השטח מכוסה הדמיה מאגר.
    הערה: אם השטח לא שוטפים אחרי הפקדת המדגם נוקלאוזום, פני השטח במהירות להיות צפוף.
  5. להגדיר והסורק לדוגמה על גבי בעל קצה כך המדגם הוא הפנים למטה. כדי להתחיל את הגישה, השתמש בפונקציה אוטומטי-הגישה משרעת שנקבעה מראש, As קרוב תנודה חינם משרעת A0.
    הערה: באופן אידיאלי, As = 0.950, עם זאת, פועל ב- 82% של0 יעבוד גם אם זהיר.
  6. התאם את נקודת קבע עד פני השטח נמצאת במעקב טוב.
    הערה: כדי למזער העברת אנרגיה מהקצה AFM לדגימת נוקלאוזום, משרעת הזיז צריך להישמר קטן, עם amplitudes נמוך כמו 1 ננומטר אופטימלית.
  7. הגדר את אזור התמונה בסביבות 150 x 150 nm 200 x 200 ננומטר בקצב רכישת הנתונים של ms ~ 300 לכל הדמיה מסגרת.
    הערה: גודל תמונה זו היא בדרך כלל מספיק ללכוד את הדינמיקה של נוקליאוזומים כמה בו זמנית. משטח פחות מיושבים יכולים לקרוא לשינויים בפרמטרים האלה. קצב המסגרות המוצעות מספיקה ללכוד נוקלאוזום dynamics כגון לולאה, הזזה, הסרת העטיפה, בין היתר (ראו תוצאות נציג בסעיף להלן).

7. ניתוח של דינמיקה נוקלאוזום שנלכדה באמצעות AFM בצילום מואץ

  1. להמיר את התמונות לסוג הנתונים HS AFM (.asd) .tiff תמונות.
    1. לשטח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח של המערכת AFM באמצעות פונקציות או מטוס או קו עד הרקע יש חדות אחידה.
    2. הגדר את החדות בתמונה (צבע סולם) באופן אוטומטי.
      הערה: הניגוד ניתן להתאים ידנית למטרות המצגת אך לא עבור ניתוח. זה גורם פרט גובה לאיבוד של תמונות שעברו המרה.
    3. שמור על הטווח שנבחר של תמונות קובץ. mov. בטלו את הבחירה באפשרות סרגל קנה מידה, גבול אפשרויות לפני השמירה.
      הערות: אל תעשי ניתוח על התמונות כי יש ברים בהיקף מסגרת. אלה לשנות את גודל התמונה, תגרום במדידות שווא.
    4. להמיר את הקובץ. mov לתמונות tiff באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלה של חומרים). השתמש באותו קצב מסגרת עבור המרה שימש בעת יצירה של הקובץ. mov.
  2. עבור מדידות מתאר אורך הזרוע, לפתוח את התמונות ב תוכנת המדידה מסוגל מדידה זו הקלד (ראה טבלה של חומרים).
    1. להגדיר את מידות התמונה לאלה שבו נכבשה.
    2. למדוד את אורך מתאר של כל זרוע נוקלאוזום מהקצה של היד אל מרכז הליבה נוקלאוזום ולהקליט את המידות בגיליון (איור 4A).
    3. למדוד את האורך של המצע DNA עטיפתו במסגרות לאחר unwraps נוקלאוזום. השתמש באפשרות זו עבור כיול ספציפי של הסרט של היחס nm/bp המשמש נוקלאוזום גלישת חישובים
    4. לאסוף שני פרופילים חתך רוחב עבור הליבה נוקלאוזום. ושניים עבור ה-DNA חשופות (איור 4B).
    5. לייבא את הפרופילים חתך בתכנת, לנרמל את החלקות על-ידי חיסור הערך הנמוך ביותר z של כל נקודות בפרופיל.
    6. לחשב את הגובה ואת רוחב מקסימום חצי (FWHM) עבור כל מקטע קרוס, ממוצע של הערכים השייכים לפרופילים שני לכל מסגרת.
  3. להפחית חצי של הערך FWHM מכל נוקלאוזום הזרועות מגרש כמו מגרש פיזור יחד עם הסכום המחושב של הזרועות.
    1. לחשב את אורך מתאר רעה מן המדידות DNA הכין את ה-DNA במסגרות לאחר פתח נוקלאוזום.
    2. לקבוע את הגורם כיול nm/bp על-ידי חלוקת אורך מתאר מרושע של ה-DNA חופשי באורך זוג בסיסים של המצע הדנ א. השתמש בערך זה כדי לחשב נוקלאוזום גלישת בכל אחת מהמסגרות, כמתואר בסעיף 5.12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מונו-נוקליאוזומים שהוכנו קודם עבור AFM הדמיה ניסויים באמצעות שיטת הרכבה רציפה דילול (איור 1). נוקליאוזומים מוכן ואז נבדקו באמצעות מרחביות מקוטע-דף (איור 2). משטח מישה היה functionalized הבא באמצעות APS, אשר לוכדת נוקליאוזומים על פני השטח תוך שמירה על רקע חלקה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה (איור 3). נוקליאוזומים הופקדו על APS-מישה, לאחר מכן היו עם תמונה באמצעות הדמיה AFM סטטי. בתור פקד על הרכבה ועל התצהיר, H3 מונו-נוקליאוזומים הוכנו, עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר לעיל היא פשוטה למדי, מספקים תוצאות מאוד לשחזור, למרות כמה נושאים חשובים יכול להדגיש. Functionalized APS-מיכה הוא מצע מפתח להשגת תוצאות אמין לשחזור. יציבות גבוהה של APS-מיכה היא אחת התכונות החשובות של סובסטרט זה המאפשר אחד כדי להכין את המצע הדמיה מראש לשימוש שיכול לשמש לפחות שבועיים לאחר להיות מוכן. 59 , 61 . אולם, פני השטח עלולים להיפגע על ידי ואדים של דבק אם הוא משמש נציץ גובר על הדיסקית מתכת. לכן, מומלץ לשימוש דו-צדדי. קלטת נציץ הרכבה כמפורט בפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

מחבר תרומות: YLL ו- MSD תוכנן הפרויקט; MSD התאספו נוקליאוזומים. MSD, נמנום לבצע ניתוחים ניסויים ונתוני AFM. כל המחברים כתב וערך את כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלסמיד pGEM3Z-601Addgene, קיימברידג', MA26656
PCR פריימריםIDT, קורלוויל, IAהזמנה מותאמת אישית(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
פולימראזThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701מספר קטלוגי עבור 200 יחידות
ערכת טיהור PCRQiagen, הילדן, גרמניה 28104קטלוגי עבור 50 יחידות
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001מספר קטלוגי עבור 250 גרם
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028מספר קטלוגי עבור 500 גרם
(CENP-A/H4)2, EpiCypher אנושי רקומביננטיDurham, NC16-0010קטלוגי עבור 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher אנושי רקומביננטי, דורהאם, NC15-0311מספר קטלוגי עבור 50 ug
H3 Octamer, RecombinantHuman EpiCypher, Durham, NC16-0001קטלוגי עבור 50 ug
ערכת מכשיר דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.1 מ"לThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574מספר קטלוגי עבור 10 מכשירים
נתרן כלורידסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOS9888-500Gמספר קטלוגי עבור 500 מ"ג
אמיקון אולטרה-0.5  מסננים צנטריפוגליים mL Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008מספר קטלוגי ל-8 מכשירים
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLמספר קטלוגי עבור 25 מ"ל
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25Gמספר קטלוגי עבור 25 גרם
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001 מספר קטלוגי עבור 1 ק"ג
אמוניום פרסולפט (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700מספר קטלוגי עבור 10 גרם
30% תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158מספר קטלוגי עבור 500 מ"ל
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800מספר קטלוגי עבור 5 מ"ל
4x מאגר דגימת חלבון Laemmli עבור SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
2-MEסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOM6250-10MLמספר קטלוגי עבור סולם
חלבון צבוע מראש ageRulerThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616מספר קטלוגי עבור 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, הרקולס, קליפורניה1610786מק"ט למגבונים לא ארוגים לחדר נקי בנפח 1 ליטר
: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)מסונתז כמתואר ב-22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25Gמספר קטלוגי עבור 25 גרם
סקוטש טייפScotch-3M, סנט פול, מינסוטה
בדיקת EFM TESPA-V2 (להדמיה סטטית)בדיקות Bruker AFM, קמרילו, קליפורניה
MSNL-10 בדיקת afm (להדמיית זמן-lapse סטנדרטית)בדיקות Bruker AFM, קמרילו, קליפורניה
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480מספר קטלוגי עבור צינור 2 גרם
MgCl2Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MOM8266-100Gמספר קטלוגי עבור 100 גרם
מסנן Millex-GP, 0.22  ומיקרו; mסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזוריSLGP05010מספר קטלוגי עבור 10 מכשירים
בדיקה AFM BL-AC10DS-A2 (עבור HS-AFM)אולימפוס, יפן
מתחם FG-3020C-20 פלואורוטכנולוגיה ושות', בע"מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן 
מתחם FS-1010S135-0.5 פלואורוטכנולוגיה ושות', בע"מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן 
מיקרוסקופ כוח אטומי MultiModeBruker-Nano/Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה
מיקרוסקופיה של כוח אטומי במהירות גבוההטושיו אנדו, המכון למדעי הננו-חיים, אוניברסיטת קאנאזאווה, קאקומה-מאצ'י, קאנאזאווה, יפן
מספר , מספר מספר בנפח 10 מ"ל 

מקורות

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AFMCENP AAFMDNA
חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.