אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Summary

בנייר זה, אנו שואפים לתאר את הביצועים של הטכניקה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ויישומו בחקר הפיזיולוגיה של זרע.

Abstract

ברבייה מינית, תא רבייה גברית או תא הזרע בין עם תא רבייה נקבה על הפריה. עם זאת, מספר רב של תאי זרע בעלי יכולת להפרות נדרשים לקיים אינטראקציה עם תא רבייה נקבה כדי לוודא הפריה. ככזה, היכולת המפרה של תאי זרע בודדים הוא קריטי עבור רבייה מוצלחת. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ניצל במשך כמה עשורים כשיטה לשחזור מהיר, יעיל, אפקטיבי, וישימה מאוד לאסוף רק באיכות גבוהה הזרע כדי לשמש הטכנולוגיה סייעה הרבייה. הפרוטוקולים שאנו המתואר במסמך זה מתמקדים הניצול של הטכניקה הדרגתיות צנטריפוגה (PDGC) צפיפות Percoll רציף כדי לבודד שלוש אוכלוסיות נפרדות של זרע רוסטר מאת האיכות שלהם. הצלחנו לאסוף נמוך - בינוני, זרע באיכות גבוהה. אנו מתארים גם פרוטוקולים לשחזור שכרוכים הקובע פוטנציאל הפוריות של זרע על-ידי הערכת הכדאיות שלהם, ניידות, חדירות. אוסף של זרע על ידי איכות שלהם בטכניקה PDGC להיות שימושי במדויק, ביסודיות לאפיין זרע עם פוטנציאל דיפרנציאלית פוריות.

Introduction

גולגולת, זכר גמטות עוברים אינטנסיבי הלחץ הסלקטיבי; לכן כושר הרבייה של הזכר הוא מרכזי להשגת הפריה מוצלחת. הזכרים של כל מין חוליות נתון חייב להיות מסוגל לייצר תאי זרע בכמויות גדולות ושל באיכות טובה דיה על מנת לענות על הצרכים של הפריה. תאי זרע, יש ראש הזרע והן של שוטון, הם התאים מקוטב ביותר בגוף. הם גם מאוד הטרוגנית באיכות הזרע (נמוך בשידור חי ולא מת, מורפולוגית נורמלי חריג ואני משותק, ניידים וגבוה ניידים), אשר מתגלה וריאציה רחב יעילות הרבייה של הזכרים. גדול יותר חלקם של זרע באיכות גבוהה, פחות המספר של matings נדרשים בהצלחה להפרות את הביצית. עם זאת, כדי להשיג פוריות, תאי זרע נורמלי מורפולוגית להסתמך על כוחות-חליפת שנוצר על ידי שוטון שלהם כדי להגיע לאתר של הפריה גם כדי לח....

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה של גאורגיה.

1. שטיפה באמצעות צנטריפוגה מסורתי

1. להכין את בופר פוספט (PBS). הוסף 8.0 גר' NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 g של Na-₂-HPO-₄ ו- g 0.24₂פו ח'₄ 800 מ ל מים מזוקקים (dH₂O). להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 0.1 N HCl ולהביא את הפתרון 1 ליטר באמצעות dH₂O.
2. להכין מאגר תנועתיות. להוסיף 6.5 גרם של NaCl, 4.5 גר' גלוקוז, 0.444 g CaCl₂ ו- 11.5 g של N - טריס-[hydroxymethyl] חומצה מתיל-2-אמינו-ethanesulfonic (מלון טס) 800 מ של dH₂O. להתאים את ה-....

Results

הטכניקה PDGC הביא הפרדה ברורה של שלוש שכבות של זרע על ידי מידת איכות על פני כל הפרמטרים. זרע מפריד לשכבה באיכות גבוהה להלן הפתרון צפיפות גבוהה יותר, שכבה באיכות בינונית בין פתרון צפיפות נמוכה יותר גבוה יותר ובין שכבה באיכות נמוכה מעל התמיסה צפיפות נמוכה יותר. ההבדלים באיכות הם שמעידים הבדלים ברורים הכדאיות (איור 4), ניידות (איור 5), חדירות (איור 6). זרע מבודד מן השכבה באיכות גבוהה של PDG הציגה עליות .......

Discussion

פוריות לא רק קובעת את הרווחיות של ייצור בעלי החיים, אלא פועלת גם כאמצעי הברירה הטבעית של מינים לקיום. הפונקציה האולטימטיבי של תא זרע היא להפרות את הביצית. Oviduct של הנקבה בוחרת רק את הזרע בכושר כדי להבטיח הפריה של ביצית^23,24. מחקרים במבחנה נחשפו גם מתאם קרוב בין תכונות הזרע איכותי הפריה הצלחה^4,11,23,24. הפריון מזוהה עם איכות י.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	P7828
Schiff' s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב	75004524
DU 530 Life Sciences ספקטרופוטומטר UV/Vis	בקמן קולטר, בריה, קליפורניה, ארה"ב		לא נמצא קטלוג
אולימפוס IX 71 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך וניגוד פאזה	אולימפוס אמריקה בע"מ, פנסילבניה, ארה"ב		לא נמצא קטלוג